专利名称：L-氨基酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及使用微生物的L-谷氨酸等L-氨基酸的生产方法。L-谷氨酸 作为调味品原料等，其它L-氨基酸作为动物饲料用添加剂、保健食品成分 或氨基酸输液等，在产业上是有用的。
背景技术：
为了通过使用微生物的发酵方法来产生目标物质，例如L-氨基酸等， 存在下述方法使用野生型细菌(野生型菌抹)的方法、使用从野生型菌抹 衍生的营养缺陷菌抹的方法、使用从野生型菌抹作为对各种药物的抗性突 变体菌抹而衍生的代谢调节突变体菌抹的方法、使用同时具有营养缺陷菌 抹和代谢调节突变菌林特征的菌抹等。
例如，L-谷氨酸主要通过使用属于短杆菌属(^"ev/6ac&Www)、棒杆菌 属(Cbo;Me6(3"en'wm)、樣丈杆菌属(M/cra6a"er/wm)的称作棒状杆菌型纟田菌 (coryneform bacteria)的L-谷氨酸生产菌或者它们的突变菌4朱的发酵方法来 生产(参照例如非专利文献1)。作为通过使用其它菌抹的发酵方法来生产L-谷氨酸的方法，已知有下述方法使用芽孢杆菌属(^z"7/w力、链霉菌属 (5Yreptowyces)或青霉属(尸em'"7/^m)属等微生物的方法(参照例如专利文献 1),使用假单胞菌属(尸"i^omo"as)、节杆菌属(力"/zra6ac er)、沙雷氏菌属 GS^ra"a)或假丝酵母属(OmA^)等微生物的方法(参照例如专利文献2)，使 用芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气气杆菌04ero6a"er fl￡rogg"&s)( J见在名为产气肠#干菌(EVz/er。6"cfe^ "e"oge"es))等4敬生物的方法 (例如参照专利文献3),使用大肠杆菌的突变菌抹的方法(参照例如专利文献 4)，等等。此外，还公开了使用属于克雷伯氏菌属(K/e6wW/fl)、欧文氏菌属 (五nWm'a)、泛菌属(尸awto&a)或肠杆菌属C&7fero6a"e。的孩i生物的L-谷氨酸 生产方法(参照例如专利文献5 7)。
近年来，在目的物质的发酵生产中运用了重组DNA技术。例如，通过 增强编码L-氨基酸生物合成体系酶的基因的表达(专利文献8、专利文献9)、
3或者增强碳源向L-氨基酸生物合成体系的流入(专利文献10),可以改善细 菌的L-氨基酸生产力。
例如，已经有报道称，对于L-谷氨酸的生产，在棒杆菌属或短杆菌属 的纟田菌中引入源自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌(Cor;/"e6(3"en'wm g/wtom/cww) 的编码种檬酸合酶的基因，对于棒状杆菌型细菌的L-谷氨基酸生产能力的 增强是有效的(参照例如专利文献11)。另外，已经有报道称，将源自棒状 杆菌型细菌的柠檬酸合酶基因引入属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏 菌属、欧文氏菌属或埃希氏菌属的肠细菌(enterobacterium)中，有效地增强 了 L-谷氨酸产生能力(参照例如专利文献12)。
此外，已知通过缺损微生物的a-酮戊二酸脱氩酶(a-KGDH)来生产显著 量的L-谷氨酸(专利文献13、专利文献14、专利文献15)。
琥珀酸脱氬酶(SDH)是催化由琥珀酸到富马酸的反应的酶，已知在棒状 杆菌型细菌中通过缺损该酶的基因，生成微量的L-谷氨酸(专利文献16)。
另 一方面，已知属于肠内细菌群的大肠杆菌(^^en'c/z/a co/Z)中也存在琥 珀酸脱氢酶缺损抹(非专利文献2)，但尚不清楚其与L-谷氨酸生产之间的关 联。
此外，已知a-酮戊二酸脱氢酶缺损的大肠杆菌呈琥珀酸营养缺陷性， 但若与SDH—起双重缺损，则琥珀酸营养缺陷性可以恢复(非专利文献2)。 然而，a-酮戊二酸脱氬酶与琥珀酸脱氢酶的双重缺损对L-谷氨酸等L-氨基 酸生产的影响尚属未知。
专利文献l美国专利第3,220,929号说明书
专利文献2美国专利第3，563，857号说明书
专利文献3特公昭32-9393号公报
专利文献4特开平5-244970号公报
专利文献5特开2000-106869号公报
专利文献6特开2000-189169号公报
专利文献7特开2000-189175号公报
专利文献8美国专利第5,168,056号说明书
专利文献9美国专利第5,776,736号说明书
专利文献10美国专利第5,906,925号说明书
专利文献11特公平7-121228号公报专利文献12特开2000-189175号公才艮 专利文献13欧州专利申请公开771879号公才艮 专利文献14欧州专利申请公开0952221号公报 专利文献15欧州专利申请公开1078989号公报 专利文献16欧州专利申请公开1106684号公报
非专利文献1明石邦彦等著，氨基酸发酵，学会出版中心，195~215 页，1986年
非专利文献2JGen Microbiol. 1978 Jul; 107(1): 1-13
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供能够高效地生产L-谷氨酸等L-氨基酸的细菌， 和使用该细菌高效地生产L-氨基酸的方法。 解决问题的手段
本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过对细菌进 行修饰使得琥珀酸脱氢酶活性和a-酮戊二酸脱氢酶活性降低，可以提高L-谷氨酸等L-氨基酸的生产力，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1) . 一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养具有L-氨基酸生 产能力且经过修饰使得琥珀酸脱氪酶活性和a-酮戊二酸脱氢酶活性降低的 微生物，使L-氨基酸在该培养基中或菌体内生成并蓄积，并且从该培养基 或菌体收集L-氨基酸。
(2) .上述方法，其中通过降低琥珀酸脱氢酶编码基因或a-酮戊二酸脱 氢酶编码基因的表达量，或者破坏所述基因，来降低琥珀酸脱氢酶活性或a-酮戊二酸脱氬酶活性。
(3) .上述方法，其中，所述琥珀酸脱氢酶编码基因是选自sdhA基因、 sdhB基因、sdhC基因和sdhD基因中的l种或2种以上的基因。
(4) .上述方法，其中，a-酮戊二酸脱氬酶编码基因是选自sucA基因、 odhA基因和sucB基因中的1种或2种以上的基因。
(5) .上述方法，其中，所述微生物为属于肠杆菌科(Enterobacteriacae) 的细菌或者棒状杆菌型细菌。(6) .上述方法，其中，所述氨基酸为L-谷氨酸或以L-谷氨酸为前体生 物合成的L-氨基酸。
(7) .上述方法，其中，所述L-氨基酸选自L-精氨酸、L-脯氨酸、L-鸟 氨酸、L-瓜氨酸和L-谷氨酰胺。
图1显示了辅助质粒RSF-Red-TER的结构。 图2显示了辅助质粒RSF-Red-TER的构建。
实施发明的最佳模式
以下，对本发明进行详细说明。 <1>用于本发明的微生物
本发明的方法是使用具有L-氨基酸生产能力、且经过修饰使得琥珀酸 脱氢酶活性和a-酮戊二酸脱氢酶活性降低的微生物的L-氨基酸生产方法。
用于本发明的微生物可以这样获得以具有L-氨基酸生产能力的微生 物为亲本菌^^,通过修饰使其琥珀酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶活性降低。 此外，用于本发明的微生物还可以这样获得以经过修饰而使得琥珀酸脱 氬酶和a-酮戊二酸脱氢酶活性降低的微生物为亲本菌抹，赋予或增强L-氨 基酸生产能力。
用于本发明的微生物可以是本来就具有L-氨基酸生产能力的微生物， 也可以是通过利用突变法、重组DNA技术等的选育而被赋予了 L-氨基酸生 产能力的微生物。
此处，"L-氨基酸生产能力，，是指当在培养基中培养用于本发明的微生
物时，其具有以可从细胞或培养基中回收的水平生产L-氨基酸的能力。优 选具有与在相同条件下培养的野生型菌抹或非修饰菌株相比具有生产更多
量的L-氨基酸的能力。
作为L-氨基酸，可以列举出L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨 酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨 酰胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸(胱氨酸)、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨 酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸、L-高丝氨酸；优选L-谷氨酸或以L-谷氨酸为前体的L-氨基酸，特别优选L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸。
作为在本发明的生产方法中使用的微生物，可以列举出细菌，例如埃
希氏菌属、；乏菌属、肠4干菌属等属于肠4干菌一牛(五"ten96a"en.aceag family) 的4效生物；谷氨酉交斗奉一干菌禾口乳发酵杀豆4干菌(Brevz力a"en'wm /acto/erweWww) 等棒状杆菌型细菌；和枯草芽孢杆菌(Bacz7/w w^7/力等属于芽孢杆菌属的细菌。
在本发明中，"棒状杆菌型细菌，，还包括原来归类于短杆菌属、但现在 归类于棒杆菌属的细菌(Int. J. Syst. Bacteriol" 41, 255 (1991)),以及与棒杆
菌属亲缘关系非常近的短杆菌属的细菌。这样的棒状杆菌型细菌的实例可 列举下述
p耆乙酰乙酉吏才奉4干菌(Co^yweZ)acten.ww ac^oac/fifop/n'/ww) 醋谷才奉4干菌(Co^ywe6acfen'wm ace/og7wtom,cwm) 烷醇才奉杆菌(Co^yMe6(3cfe"'wm a/fe3"0/3^/cwm) 美棒軒菌(Co^y"eZ acfen'wm ca〃w"ae) 谷氨酸棒杆菌
百合花才奉4干菌(C07Me6a"en.ww /z7/wm) 才西#唐蜜氺奉才干菌(CoryweZ)ac&"'wm me/oweco/a)
p耆产氨才奉4干菌(Co/^"eZ)acfen.wm Ae^7woam/"oge"&s) (Co^y"e6ac&r/Mm
力士氺奉4干菌(Cory"e6(3cfen.wm /zercw//" 二ji支4豆4干菌(5rev/6acfeWwm A.van.C(^MW) 黄色^豆才干菌(5rev^a"en'ww ^Zavww)
乳发酵4豆冲干菌(6rev/6a"en'wm /actoyb7we"fwm)(谷氨酉臾才奉4干菌)
J文3鬼色-豆4干菌(jBrevAac&Wwm rcwewm)
角竿糖短杆菌(^"ew力a"e
生石克4豆才干菌(5reW6a"en'wm A/ogem'to//"
产氛棒軒菌(万rev/6a"m'w附amwom'age"as)
p耆氨《效^干菌(Af/cro6acferz.wm a附mom'ap/z〃wm)
7具体地，可以下述菌抹为例 嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870 醋谷棒杆菌ATCC15806 烷醇棒杆菌ATCC21511 美才奉杆菌ATCC 15991
谷氨酸棒杆菌ATCC13020、 ATCC13032、 ATCC13060
百合花棒杆菌ATCC15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC17965
嗜热产氨棒杆菌AJ12340 (FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC13868
二歧短杆菌ATCC 14020
黄色短杆菌ATCC13826、 ATCC14067
5rev/6acfen.廳/w7附an'op/n7麵ATCC14068
乳发酵短杆菌ATCC13869 (谷氨酸棒杆菌ATCC13869)
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生石克短杆菌ATCC19240
产氨才奉杆菌ATCC6871、 ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
^，力acfm'謹化///7應ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
这些菌抹可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC:地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America)通过分售获得。即，对每种菌林都给予了登录号，可以 使用这些号码通过分售获得菌株(http'. 〃www.atcc.org/)。美国典型培养物 保藏中心的目录中列出了每种菌株的对应登录号。根据布达佩斯条约的规 定，将AJ12340菌抹于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院 生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology),(目前为， 独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology)) (305-5466日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第 6)，登录号为FERMBP-1539。
对于用于本发明的属于肠杆菌科的微生物没有特殊限制，只要它们属 于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏 菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属(#0^^^/^)等属，具有L-氨基酸生产能 力即可。具体地说，可以使用按照NCBI (美国国家生物技术信息中心， National Center for Biotechnology Information)数据库中记载的分类属于肠 4干菌牙牛的纟田菌(http: 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock)。作为肠杆菌科 的亲本菌抹，尤其优选使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌或泛菌属细菌。
对于埃希氏菌属细菌的亲本菌抹，没有特别限制，具体而言，可以使 用 Neidhardt等的著4乍(Neidhardt et al. ■Esc/zer/c/z/a and Sa/mo"e〃i3 T^/7/z/ww/画,American Society for Microbiology, Washington D.C.， 1029表 l)列出的细菌。在这些细菌中，例如可列举大肠杆菌。作为大肠杆菌，具 体地可列举源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌W3110 (ATCC 27325)和 大肠杆菌MG1655 (ATCC 47076)。
特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为Y-变 形细菌Cy-Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43(6) 355-361 、 International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pi061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验 等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(尸a"toea ogg/画era—或等(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989; 39(3).p.337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中， 有些#皮重新分类为a"a"w 、 斯氏泛菌(尸(3"tog(3 WewaW/)(参月褒 International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43(1).p.162-173)。
肠4干菌属纟田菌的实例包4舌成团肠4干菌(五"fero6acfer agg7omeraws)和产 气肠杆菌CE"tera6acfer aerogeMM)。具体地，可以使用欧州专利申请公开 952221号说明书示例的菌抹。作为肠杆菌属的代表性菌抹，可以列举出成 团肠杆菌ATCC12287抹。
作为泛菌属细菌的代表性菌4朱，可以列举出Pantoea ananatis 、斯氏泛菌、 成团泛菌、尸朋toeac^ea。具体地，可以列举下述菌才朱。a"awafe AJ13355 4朱(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开 0952221号说明书)
fl"朋a^ AJ13356抹(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开 0952221号说明书)
而且，这些菌抹在欧洲专利申请7>开0952221号说明书中记载为成团 肠杆菌，但现在，如上文所述，依据16SrRNA核苷酸序列分析将其重新分 类为。
作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(五rw/m'a 胡萝卜软腐欧文氏菌(五rWw'a carotovora);作为克雷伯氏菌属细菌，可以列 举出植生克雷伯氏菌(^^^^//0尸/^&0/0)。具体地，可以列举出下述菌抹。
解淀粉欧文氏菌ATCC15580抹
胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713抹
植生克雷伯氏菌(K/eZwW/a pfe""co/a) AJ13399抹(FERM BP-6600)(欧 洲专利申请公开955:368号说明书)
植生克雷伯氏菌(A7e&zW/a ; /a""co/a) AJ13410株(FERM BP-6617)(欧 洲专利申请公开955368号说明书)
<1-1>匸氨基酸生产能力的赋予或增强
以下，说明对如上所述的微生物赋予L-氨基酸生产能力的方法，或增 强如上所述的微生物的L-氨基酸生产能力的方法。
为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌 属细菌等氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变 体、L-氨基酸类似物抗性菌林或代谢调节突变菌抹，创建L-氨基酸生物合 成系统酶表达增强的重组菌抹等等(参见《氨基酸发酵》，(抹)学会出版中 心，1986年5月30日初版发行，第77-100页)。这里，在L-氨基酸生产 菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可 以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基 酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可 以将营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成 系统酶的增强组合进行。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌抹、类似物抗性菌抹或代 谢调节突变菌抹可如下获得对亲本菌抹或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍等
处理；其后，从所得的突变菌抹中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代 谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌抹。此外，L-氨基酸产生菌 还可以通过基因重组增加L-氨基酸生物合成系统酶的活性来进行。
以下，对赋予L-氨基酸生产能力的方法和赋予了 L-氨基酸生产能力的 微生物进行示例。
作为通过选育来赋予或者增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举例 如通过修饰使得编码L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。 L-谷氨酸生物合成相关酶的实例包括谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶 (glnA)、谷氨酸合酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA， acnB)、柠檬酸合酶(citrate synthase; gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶(aceEF， lpdA)、丙酮酸激酶(pykA， pykF)、磷 酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgmA, pgml)、 磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、 果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA， pfkB)、葡糖磷酸异构酶(pgi) 和曱基柠檬酸合酶(prpC)等等。此外，酶名称后的括号内为基因名称(以下 同)。
作为增强这些基因的表达的方法，可以这样来实现导入扩增质粒， 所述扩增质粒是将包含这些基因的DNA片段导入适当的质粒，例如至少包 含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体而形成的；或者， 通过接合、基因转移等使这些基因在染色体上多拷贝化；抑或在这些基因 的启动子区域导入突变(参照国际公开小册子W095/34672号)。
当向上述扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达这些基因 的启动子可以是能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的任何启动子，可以是 所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适宜 地选择在棒状杆菌型细菌中强力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的 -35、 -10区域与共有序列接近，来进行基因表达量的调节。作为通过如上所 述的方法进行修饰从而增强了柠檬酸合酶基因、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸 脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的微生物，可以例举WO00/18935 号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等中记载的微生物。
为了赋予L-谷氨酸生产能力的修饰可以通过降低或缺损下述酶的活性来进行，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支出来而产生其它化合物 的反应。作为催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支出来而生成L-谷氨酸以
外的化合物的反应的酶，可以列举出异柠檬酸裂合酶、乙酰羟酸合酶、 乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氪酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(1-匕°口 U 乂一 5 —力^求年、>^一卜f匕K、口y于一if)、乙酰 CoA水化酶(WO2006/057450)等。
降低或者缺损上述酶的活性，可以按照与后述的降低琥珀酸脱氢酶活 性和a-酮戊二酸脱氪酶活性相似的方法来进行。
而且，作为在棒状杆菌型细菌中赋予L-谷氨酸生产能力的方法，还可 以采用下述方法扩增yggB基因(NCgl 1221; NP—600492. Reports small-conductance...[gi: 19552490])的方法，导入在编码区内导入突变而得 到的突变型yggB基因的方法(W02006/070944)。
此外，作为提高L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举导入编码D-木酮 糖-5-磷酸磷酸酮醇酶(D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase)和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(fructose-6-phosphate phosphoketolase)(这里合称磷酸酮醇酶) 的基因的方法。例如，作为磷酸酮醇酶活性提高的微生物，可以列举以下 微生物(W02006/016705)。
乳发酵短杆菌ATCC13869AsucA(pVK9-xfp)、
乳发酵短杆菌ATCC13 869AsucA(pVK9-PS2—xpkA)
L-谷氨酸生产能力可以通过增强6-磷酸葡糖酸脱水酶活性、或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性、或者这两者的活性来赋予。作为6-磷酸葡 糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性提高的微生物，可 以列举出特开2003-274988公开的微生物。此外，L-谷氨酸生产能力还可以 通过扩增作为L-谷氨酸分泌基因的yhfK基因来赋予(W02005/085419)。
此外，作为用于本发明的L-谷氨酸生产微生物，可以使用具有于酸性 条件下培养时在液体培养基中蓄积超过L-谷氨酸饱和浓度的量的L-谷氨酸 之能力(以下也称为酸性条件下的L-谷氨酸蓄积能力)的微生物。例如，按照 欧洲公开公报1078989号记载的方法，通过获取在低pH环境下对L-谷氨酸 的抗性提高的菌林，能够赋予蓄积超过饱和浓度的量的L-谷氨酸的能力。
作为本来具有酸性条件下的L-谷氨酸蓄积能力的微生物，具体地可以 列举出Pa"toeaAJ13355林(FERM BP-6614)、 AJ13356抹(FERMBP-6615)、 AJ13601抹(FERM BP-7207)(以上，参照欧洲专利申请公开 0952221号说明书)、SC17sucA抹、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹、NP106 抹和NA1株等。
Pa"toea AJ13355抹是作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源 的培养基中增殖的菌林从静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌抹。AJ13356 为AJ13355抹的aKGDH-El亚基基因(sucA)缺损而得到的菌抹。
AJ13355抹和AJ13356株已于平成10年(1998年)2月 19日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技 术综合研究所专利生物保藏中心，地址邮政编码305-8566茨城县筑波市 东1 丁目1番地1中央第6),保藏号分别为FERM P-16644和FERM P-16645, 并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给 予保藏号FERMBP-6614和FERMBP-6615。而且，这些菌抹在分离时被鉴 定为成团肠才干菌CE"fera6acfer agg/omera"力，并当作成团肠杆菌AJ13354、 AJ13355进行了保藏。但是，近年来，基于16SrRNA核苷酸序列分析等， 它们4皮重新分类为户awtoea (参照后述实施例)。而下文所述的
AJ13601同样也是在上述保藏机构中作为成团肠杆菌保藏的，而在本说明书 中表述为朋a"afe。 AJ13601已于1999年8月18日保藏于工业技 术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技术综合研究所专利生物保藏 中心，地址邮政编码305-8566茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6), 保藏号为FERM P-17156，并且于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约 的国际保藏，并给与保藏号FERM BP-7207。
此外，作为Pa"/oea的L-谷氨酸生产菌，可以列举出a-酮戊二 酸脱氢酶(aKGDH)活性缺损、或者aKGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。 作为这样的菌抹有前述的AJ13356林，以及从AJ13355抹中作为粘液质 低生产突变菌林选择出来的SC17抹衍生的sucA基因缺损抹SC17sucA (美 国专利第6,596,517号)。SC17sucA抹的内部编号为AJ417抹，已于2004 年2月26日保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码 305-8566茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6),保藏号FERM BP-08646。
此外，上述SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株是在SC17sucA抹中导入包 含大肠杆菌来源的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG,以及包含乳发酵短杆菌来源的 柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌抹。AJ13601抹是从该 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹中作为低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的 抗性的菌抹而选择出的菌抹。此外，NP106林是如实施例所述那样，质粒 RSFCPG+pSTVCB从AJ13601抹脱落而得到的菌林。
作为赋予或者增强L-谷氨酸生产能力的其它方法，还可以列举赋予 对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑 制剂的敏感性的方法。例如赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209 )、 赋予腺噪呤或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特 开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予苯并吡 喃酮或萘醌抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭 56-140895)、赋予a-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的 方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素^:感性的方法(特开平4-88994)，等等。 作为这样的抗性菌的具体例子，可以列举出下述菌林 黄色短杆菌AJ3949(FERMBP-2632;参见特开昭50-113209) 谷氨酸棒杆菌AJ11628 (FERMP-5736;参见特开昭57-065198) 黄色短杆菌AJU355 (FERMP-5007;参见特开昭56-1889号公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11368 (FERMP-5020;参见特开昭56-1889号公报) 黄色短杆菌AJ11217(FERMP-4318;参见特开昭57-2689号公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11218 (FERMP-4319;参见特开昭57-2689号公报) 黄色短杆菌AJ11564(FERMP-5472;参见特开昭56-140895号公报) 黄色短杆菌AJ11439 (FERMP-5136;参见特开昭56-35981号公报) 谷氨酸棒杆菌H7684 (FERM BP-3004;参见特开昭04-88994号公报) 乳发酵短杆菌AJ11426 (FERMP-5123;参见特开昭56-0488卯号公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11440 (FERM P-5137;参见特开昭56-048890号公报) 乳发酵短杆菌AJ11796 (FERMP-6402;参见特开昭58-158192号公报)。 具有L-谷氨酰胺生产能力的微生物的优选例子是谷氨酸脱氢酶活性 增强的细菌，谷氨酰胺合成酶(glnA)活性增强的细菌，和谷氨酰胺酶基因 被破坏的细菌(欧洲专利申请公开第1229121号和欧洲专利申请公开 1424398号)。谷氨酰胺合成酶的活性增强也可以通过谷氨酰胺腺苷酰转移 酶基因(glnE)的破坏、PII调控蛋白(glnB)的破坏来实现。另外，作为优选
14的L-谷氨酰胺生产菌的例子，可列举具有如下所述的突变型谷氨酰胺合成 酶的、属于埃希氏菌属的细菌，所迷突变型谷氨酰胺合成酶中谷氨酰胺合
成酶第397位的酪氨酸残基被其它氨基酸残基取代(美国专利申请
发明者中村纯, 仁志兰子, 原吉彦, 泉井裕 申请人:味之素株式会社