专利名称：与利什曼原虫属寄生虫毒性相关的基因的制作方法
与利什曼原虫属寄生虫毒性相关的基因本申请是申请号为02813849.X、申请日为2002年6月17日、发 明名称为"与利什曼原虫属寄生虫毒性相关的基因"的发明专利申请 的分案申请。本发明涉及抗利什曼病领域。本发明起于从硕大利什曼原虫 (Leishmania major)的野生分离林中鉴定到一种基因，该基因编码 的蛋白命名为LmPDI，该蛋白具有两个与蛋白质二硫键异构酶(PDI) 潜在活性位点(Cys-Gly-His-Cys )序列相同的区域。LmPDI蛋白主 要在该寄生虫毒性最强的分离林内表达。首先，该蛋白可以成为一个 新的治疗靶标来发展抗利什曼病药物，其次，该蛋白还可以作为一个 新的元素成为旨在保护人类及动物宿主抗击利什曼病的免疫原性制剂 以及可能地疫苗制剂的组成部分。影响上百万个体的利什曼病是一组异质性疾病，这些疾病都是由 于宿主感染了利什曼原虫属原生动物寄生虫所致。这种感染的临床表 现特征呈现高度多态性，包括无症状的感染，单纯或复发性皮肤感染 形式(cutaneous form )，扩散性或无变应性皮肤感染形式，粘膜与皮 肤感染形式以及内脏感染形式，如果不进行特定的治疗，该感染是致 命的。通常，根据该病的地理分布，利什曼病的每个种类或亚类都具 有特定的临床表现，但是，这并不是绝对的规则。另外，在同样的地 理区域，相同的寄生虫物种可能引起不同严重程度的临床表现。该感 染临床表现的这种多样性至少部分是由于寄生虫毒性的多样性引起 的。此寄生虫在其生活周期中，在两个阶段之间交替有鞭毛的前鞭 毛体阶段以及无鞭毛体(amastigote)阶段，前者可在昆虫栽体的消化道 内观察到，后者则存在于宿主的巨噬细胞内。很难使用抗利什曼病药 物，相当重要的原因是这些药物的毒性以及寄生虫形成的日益频繁的抗性(Lira， Sundar et al, 1999)。另外，近来开发的测试疫苗目前并 没有显现出预期的效力(Sharifi, FeKri et al, 1998; Khalil， El Hassan et al， 2000 )。未能找到控制利什曼病的方法的一部分原因是该寄生虫传播周期 的复杂性以及目前对于此寄生虫生物知识的缺乏。在近十年中，已经 鉴定了几种在寄生虫的传染性及生物学中起重要作用的分子。对于表 面糖缀合体，特别是脂磷聚糖(LPG)的修饰与硕大利什曼原虫和杜氏 利什曼原虫(L. donovani)传染性和毒性的改变有关(Beverley和 Turco, 1998); Desjardins和Descoteaux, 1998; Sacks, Modi et al, 2000; Spath， Epstein et al， 2000),而这似乎并不适用于墨西哥利什曼原虫(L. mexicana ) (IIg 2000; Hg， Demar et al， 2001 )。与LPG的生物合成相 关的分子:磷酸甘露糖异构酶(Garami and IIg， 2001), LPGl(Sacks， Modi et al， 2000; Spath, Epstein et al， 2000)， LPG2(Descoteaux, Luo et al， 1995)以及半乳糖基转移酶(De and Roy， 1999 )也与利什曼原虫 毒性相关。最近还描述了一些其它的毒性因子。其中包括半胱氨酸蛋 白酶家族(Mottram， Brooks etal， 1998)，促分裂原活化蛋白(MAP)-激酶(Wiese， 1998 )， A2基因(Zhang和Matlashewski, 1997 )， 表 面糖蛋白gp63 ( Chakrabarty， Mukherjee et al， 1996 )， 动质体 (kinetoplastid )膜蛋白(KMP )國ll( Mukhopadhyay， Sen et al， 1998 )， 过氧化物歧化酶(Paramchuk， Ismail et al， 1997 )， trypanothione还原 酶(Dumas, Ouellette et al， 1997 )， 以及热休克蛋白(HSP )家族的 某些成员(Hubel，Krobitschetal， 1997)。表征毒性因子可能对发展新的抗该病的药物或疫苗具有重要意义。优先筛选出与寄生虫毒性相关的蛋白可以避免在危险性较低的林 系中抗性的不必要出现，这种抗性随后是可能传给其它林系的。另夕卜， 导致对药物产生抗性的目标毒性蛋白的突变在那时也可以引起寄生虫 毒性的降低或消除，从而具备一定的治疗效果。在过去的几十年间，使用了很多方法来研究利什曼原虫寄生虫的 毒性因子。这些方法均基于遗传学研究，例如突变寄生虫的互补(Ryan，Garraway et al， 1993; Descoteaux, Luo et al, 1995; Desjardins和 Descoteaux, 1997; Wiese， 1998 ),基因失效才支术的应用(Titus， Gueiros-Filho et al， 1995; Mottram， Souza et al， 1996; Dumas， Ouellette et al， 1997; Hubel， Krobitsch et al， 1997; Mottram， Brooks et al， 1998 )，或实验室内进行的对寄生虫药物抗性基因的分析(Cotrim， Garrity et al， 1999; Perez-Victoria, Perez-Victoria et al， 2001)。这些研 究鉴定了此寄生虫生物学中几种重要的基因，目前这些基因正在被确 i人为新药物的乾(Selzer， Chen et al， 1997; McKerrow， Engel et al， 1999 )，或者作为靶用于开发及使用毒性减弱的突变体作为活疫苗 (Titus， Gueiros-Filho et al， 1995; Streit， Recker et al， 2001 )。必须指 出，到目前为止，几乎所有已进行的关于利什曼寄生虫毒性的研究要 么是在经长时间培养后丧失了毒性的实验室克隆基础上进行的，要么 是在那些通过突变试验、基因失效或基因过表达而被遗传操作了的寄 生虫基础上进行的。这样，那些涉及在该条件下被鉴定基因的毒性的 结论很可能与传播区域内寄生虫的天然致病性并不切实相关。为了研究寄生虫毒性的分子基础，避免与使用实验室林系相关联 的方法学偏差，本发明人首先分离得到了具有不同毒性水平的硕大利 什曼原虫(L)野生林。硕大利什曼原虫(L. major)是人畜共患的皮 肤利什曼病(ZCL)的起因，在从毛里塔尼亚到蒙古的绵延广阔区域 内，该病在人类中流行。本发明人鉴定了从人类ZCL损伤处得到的硕 大利什曼原虫分离抹，这些硕大利什曼原虫分离林都是在同样的传播 季节得到的，它们对BALB/c敏感小鼠实验感染模型的致病性各不相 同(实施例l)。这种实验致病力的差异与体外生长的差异相关，这反 映出这些野生型分离抹在生物学方面的差异。随后使用"差异显示"技术(Liang和Pardee, 1992; Liang， Bauer et al， 1995)，鉴定在完全不同的分离林之间差异表达的那些基因，所 述分离林通过它们在BALB/c小鼠中的实验致病力而区分(两个高毒 性的分离林以及两个低毒性的分离株)。该技术可以在事先不了解基因 的序列的情况下，研究以不同水平表达的这些基因。然后鉴定出了三个在两个毒性最强的分离林内被优先表达的转录物。其中一个转录物通过筛选硕大利什曼原虫cDNA文库得以完全表征。对该序列的分析 表明其与真核生物的蛋白质二硫键异构酶家族(PDI， Erp60和 Erp72)具有同源性。根据下述理由命名这个新蛋白为LmPDI:如同 PDI家族的其它成员，(i) LmPDI具有两个CGHC活性区域，(ii) 该蛋白的N-末端区域含有一个潜在的信号序列，而C-末端区域含有一 个潜在的内质网停留信号(EEDL ); (iii )它能够自身组织成寡聚结构；(iv)在大肠杆菌中产生的重组蛋白能够体外表达活性的PDI。另夕卜， 除上面提及的保守区域之外，在LmPDI和上述的其它PDI之间几乎 没有相似之处。实际上，PDI家族包括许多高度趋异的分子，其与分 泌到内质网中的蛋白的成熟有关(Noiva 1999; Frand， Cuozzo et al， 2000 )。 PDI为多功能蛋白，其与表达的调控，保持，修复的复杂机制 相关；该蛋白能够促进构象的改变从而保证只有正确折叠的蛋白质才 能离开内质网。除了酶的作用之外(还原和异构)，最近还发现PDI 具有其它的功能，包括陪伴分子活性，肽结合及细胞粘附(Ferrari 和Soling, 1999 )。重要的是，强调LmPDI主要在那些毒性最强的分 离林内表达(实施例2)。总之，这些结果暗示LmPDI在利什曼原 虫寄生虫的天然毒性方面具有重要的作用，因此可以作为化学治疗或 疫苗接种的新靶标。另外，最近关于细菌PDI等价物(称为DsbA， 二硫键)作用的 数据(Martin, 1995; Ostermeier， De Suiter et al， 1996 )提示了该蛋白 可能在不同微生物的致病性中的作用(Yu和Kroll， 1999 )。 DsbA基因 的失活能够强烈地影响弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的存活及毒 性(Yu， 1998; Yu， Edwards-Jones et al， 2000 )。 DsbA还参与霍乱弧菌(Vibrio cholerae )肠毒素的产生(Peek和Taylor, 1992; Yu， Webb et al，1992 )。 DsbA对致病性大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)物种的 致病性也十分重要在尿道致病性物种中，DsbA可催化菌毛蛋白的特 定陪伴分子蛋白形成二硫桥键(Zhang和Donnenberg， 1996 )。在致肠 病物种中，仍需要DsbA来稳定及形成菌毛(Hultgren， Abraham et al，1993; Wang， Bjes et al， 2000 )。本申请第一个说明了 PDI作为毒性因子在原生动物寄生虫中起重 要作用。LmPDI通过辅助其他因子的构象改变和稳定来发挥作用，这 些因子对利什曼原虫寄生虫的生物学及致病性是必要的。鉴定这样的 因子对于从生物学角度更好地了解这种寄生虫极为有利，而且对于发 展抗利什曼病的新型治疗手段或疫苗也很有益处。这样，本发明的第一个方面涉及与利什曼原虫(Leishmania )毒 性相关的蛋白，其含有至少一个与蛋白质二硫键异构酶家族(PDI) 蛋白的潜在活性位点(Cys-Gly-His-Cys)相同的位点。该蛋白优选由 该寄生虫本身编码。特别地，本发明涉及硕大利什曼原虫的LmPDI蛋白，其具有SEQ IDNO:2的序列，并涉及任何与LmPDI具有至少40%同一性，优选 至少80%同一性的LmPDI功能性变体。在这里，我们将"LmPDI功能性变体"定义为在利用LmPDI 基因已被失活的硕大利什曼原虫林所进行的感染性试验中，能够弥补 LmPDI的蛋白。本文所述术语"感染性试验"指任何能够评价通常与 毒性有关的寄生虫生长相关生物学特性的试验。尤其可以列举下述三 种类型的试验 寄生虫前鞭毛体形式在液体培养基中的生长动力学，通过例如 实施例5第2点所述类型的技术测试； 感染体外培养的小鼠巨噬细胞的能力，使用例如实施例6以及 Kebai'er等，2001所述技术测试；.通过感染敏感小鼠(例如BALB/c)，测试诱导实验鼠利什曼病 的能力。该技术在例如实施例5第3点以及Kebai'er等人，2001年的 文献中均有详细描述。使用CLUSTAL W版本1.8软件(Thompson J D， Higgins D G和 Gibson T J )或BOXSHADE版本3.21软件(Hoffman K和Baron M ) 评价与LmPDI的同一性百分比，与几个物种的PDI家族蛋白比较后， 得到LmPDI的同一性百分比在27%-36%之间(实施例2 )。第二方面，本发明涉及重组多肽，其含有至少一个具有上述定义的蛋白的IO个以上氨基酸的片段，并且如果与另一个多肽片段适当地融合的话，那么当对动物施用该重组多肽时，所述重组多肽就能够引发针对LmPDI表位的免疫反应。本发明还涉及如下重组多肽，其含 有至少一个具有上述定义的蛋白的IO个以上氨基酸的片段，并且如果 与另一个多肽片段适当地融合的话，那么该重组多肽就能够被抗 LmPDI蛋白的抗体识别。在本文中，术语"多肽，，应以其广义理解，即，包括具有至少10 个(当规定时可以更多)氨基酸的序列，其可以含有或不含有糖基化 部分或糖脂，而且不考虑其一级，二级和三级结构。上述本发明的重 组多肽中存在的LmPDI片段长度可以多于15， 20, 30， 50或100个 氨基酸，或者更多。重组的或从被感染细胞纯化得到的LmPDI以及本发明的多肽可 用于免疫人类或动物宿主，以保护其远离利什曼病，或者产生并回收 抗LmPDI的抗体，如实施例2所述。本发明的一个特定重组多肽为LmPDI-(His) 6蛋白，其具有SEQ IDNO:3的序列，如实施例2所述。本发明重组多肽的另一实例为LmPDI片段与载体多肽形成的融 合蛋白，所述LmPDI片段含有至少一个LmPDI表位，而所述栽体多 肽有助于该LmPDI片段呈递给免疫系统。它可以是全长或部分 LmPDI与e-内酰胺酶片段、或破伤风或白喉变性毒素、或任何其它 来自病原性微生物(特别是寄生虫、细菌或病毒起源的)的多肽形成 的融合蛋白。另一方面，本发明涉及编码上述蛋白或多肽的核酸序列。优选的 核酸序列包含编码具SEQ ID NO: 1序列的LmPDI的序列或该序列的 片段，所述片段具有30或更多个核苷酸，优选具有100个以上核苷酸， 并且其编码的多肽含有至少一个LmPDI特征性表位。本发明还涉及含有本发明核酸序列的核酸载体。例如，可以是质 粒，粘粒，噬菌体或病毒。优选本发明的栽体能够在宿主细胞中表达本发明的蛋白或多肽。本发明的载体尤其能够在细菌或真核细胞中表达LmPDI。本发明还涉及含有上述栽体的培养细胞。所述细胞可以是细菌， 酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞或任何其它类型细胞。该细胞可用于 表达并可能地生产本发明的蛋白或多肽，或者用于生产其后能够在其 它的培养细胞类型中或体内表达本发明蛋白或多肽的载体。纯粹为非 限制性地举例说明该细胞，可以例举CHO、 VERO、 BHK21细胞和 昆虫细胞作为能够在本发明中体外使用的细胞类型。同样地，BCG和 鼠伤寒沙门氏菌可以作为体内使用的细胞例子。最后，重要的是注意 为疫苗接种目的向个体施用编码上述多肽或蛋白的病毒载体，例如痘 苗病毒或DNA也在本发明的范围之内。本发明的一种特定细胞为细菌菌林LmPDI-XLn于2001年1月 31日保藏在国立微生物保藏中心[CNCM，保藏号为1-2621。该菌林 来自 XLl-blue MRF'细菌菌林，基因型为A (mrcA)183 △ (mcrCB國hsdSMR-mrr)173endAl s叩E44 thi國l recAl gyrA96 relAl lac[F， proABlacIqZ AM15 TnlO(Tetr)]，被质粒pBK-CMV-LmPDI 转化。该质粒相应于Stratagene(La Jolla， CA)出售的质粒pBK-CMV, 在其EcoRI和Xho I限制性位点之间加入了来自LmPDI的cDNA。本发明还涉及能够在严格条件下与SEQ ID NO: 1的核酸序列特 异性杂交的核酸探针，该探针使得可以测定生物样品中是否存在编码 LmPDI的毒性基因。本文中，我们将"严格杂交条件"定义为这样的条件在大约65 "C,在例如6XSSC， 0.5%SDS， 5X Denhanrdt， s溶液以及100ng/ml 变性的非特异性DNA的溶液中或者任何具有同等离子强度的溶液中 杂交，并且在65r，在例如具有至多0.2XSSC和0，l。/oSDS的溶液或 者任何具有同等离子强度的溶液中进行洗涤步骤之后，两个DNA分 子能够特异性杂交的条件。但是，本领域技术人员可以根据待杂交序 列的长度，其GC核苷酸含量以及任何其它参数，依照如Sambrook 等，2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition,Laboratory Press, Cold Spring Harbor， New York )描述的方案，改变 这个条件的严格性。在上述定义以及在本文中，术语"特异性"应该以其在实验室中 通常所用的最广泛含义进行理解。这样，如果在复杂混合物中，分子 A对于分子B的亲合性显著地高于分子A对混合物中其它分子的亲合 性，以致通过分子A可以将分子B检测出来，那么分子A即特异性地 识别分子B。本文所用的严格条件是这样的条件，在此条件下能够在从LmPDI cDNA合成的放射性标记探针存在下，检测出源自不同利什曼原虫物 种的各种PDI，而不能检测出源自宿主或其它微生物的PDI。例如，能够在严格条件下与SEQ ID NO: l序列特异性杂交的本 发明探针可以是这样的当使用所述标记探针对来自感染了表达 LmPDI的硕大利什曼原虫林的细胞的DNA样品进行Southern印迹 时，印迹上会具有至少一条明显不同的条带，其密度高于其它条带(非 特异性的)，而在同样条件下，对来自未感染硕大利什曼原虫的细胞的 DNA样品进行Southern印迹时，不会出现这样的条带。另一方面，本发明涉及核苷酸引物，其允许从利什曼原虫感染细 胞中特异性地扩增SEQ ID NO: 1的至少部分序列，这样就使得可以 检测生物样品中是否存在编码LmPDI的毒性基因。如果以未感染利 什曼原虫的对照细胞进行扩增反应没有导致任何序列被明显扩增，而 以含有SEQ ID NO: 1核苷酸序列的样品进行同样的反应却导致所述 序列的至少一个片段被扩增，那么该扩增就称为"特异性的"。如果有必要，上述的探针和引物可以被标记和/或置于诊断试剂盒 内，而这也是本发明的一个部分。如果能够在利什曼原虫感染过程中 确定LmPDI基因的存在以及可能地该基因的表达水平，例如确定使 用LmPDI抑制剂进行的治疗的寄生虫性和/或机会致病性负栽 (parastic and/or opportunistic charge )， 可食fe是有利的。在另一实施方案中，本发明提供能够特异性识别LmPDI的纯化 抗体。可以是单克隆或多克隆的人抗体，人源化抗体或动物抗体。所述抗体可以使用实验部分所述的方法，在LmPDI亲和性柱上进行纯 化。所述特异性的LmPDI抗体可以有很多应用。可用其检测生物样品中LmPDI的存在，例如以诊断利什曼病和/ 或确定使用LmPDI抑制剂治疗利什曼病的可能性。这样，本发明还涉及体外诊断引发利什曼病的寄生虫感染的方法。 该方法可使用本发明的多肽或蛋白，或抗该蛋白的抗体进行，或者使 用上述的探针进行。本发明的一个特定诊断方法包括以下步骤 将至少一个本发明的抗体与来自对象的生物样品在能够使所 述抗体和生物样品中所含抗原性蛋白形成免疫复合物的条件下相接 触，其中所述对象局部感染了引发利什曼病的寄生虫； 检测所述复合物。可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测复合物(酶促反应， 荧光转移等)。本发明的抗体可以以与上述探针或引物相同的方法被包含在诊断 试剂盒中。用于执行上述方法的诊断试剂盒也是本发明的一部分。 以例举的方式，所述试剂盒可以包含 至少一个本发明的抗体； 适于使被分析样品中所含抗原性蛋白与所述抗体形成免疫复 合物的介质； 使得能够检测到如此形成的复合物的试剂； 如果适当的话，对照样品。或者，本发明的抗体可以构成药物的组成部分，所述药物旨在用 于预防，减轻或治疗特定利什曼病。本发明另 一 方面涉及含有本发明上述蛋白和/或重组多肽和/或核 酸序列和/或栽体和/或细胞的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物能 够体外刺激单核的细胞的增殖，所述单核的细胞来自与利什曼原虫寄 生虫接触过的个体。优选本发明的免疫原性组合物能够体外刺激来自与硕大利什曼原虫接触过的个体的单核的细胞增殖。在本发明免疫原性组合物的一个优选实施方案中，所述组合物具 有药物学上可接受的用于人或动物宿主给药的制剂。本发明人已证明，LmPDI能够在体外诱导来自与硕大利什曼原虫 接触过的个体的单核的细胞产生细胞因子，并且这些细胞因子的表达 镨与在Thl型免疫反应中所观察到的一致(实施例3 )。如上所述的免 疫原性组合物，由于当其被施用给人或动物宿主时能够诱导Thl型免 疫反应，因此构成了本发明的一个特别优选的实施方案。本发明还涉及含有本发明上述蛋白和/或重组多肽和/或核酸序列 和/或载体和/或细胞的疫苗组合物，所述疫苗组合物旨在保护人类或动 物宿主免于利什曼病。优选地，将本发明的疫苗组合物以药学上可接 受用于人或动物宿主给药的方式配制。所述疫苗组合物可以是液体形式，皮下或肌肉内注射到患者体内， 或者可以是口服疫苗的形式，香骨剂形式，或者与本发明核苷酸序列 结合的颗粒形式，例如将DNA吸附到颗粒表面。后一种形式使得疫 苗可以使用基因枪来施用。应当注意本文所述的疫苗组合物剂型仅仅 为说明性地例举，而非限制其范围。本发明的免疫原性组合物和/或疫苗组合物还可以含有一个或多 个与利什曼原虫异源的抗原，和/或一个或多个编码所述抗原的核酸序 列。因此本发明的组合物可以引发针对几种不同病原体的免疫反应， 如果适当的话，还可制成多元疫苗(polyvaccine )。接种方法以及活性剂的剂量必须与所用疫苗的类型以及待施用的 哺乳动物相适应。抗利什曼原虫的疫苗接种方法也在本发明的范围之内，其包括给 人类或动物宿主施用含有本发明上述蛋白和/或重组多肽和/或核酸序 列和/或栽体和/或细胞的组合物。确定利什曼原虫毒性中LmPDI所起的作用还使得能够启动新的 策略来鉴定活性分子，所述分子可用于抑制此寄生虫的生长。已经显 示能够抑制PDI的分子一一例如杆菌肽或氯汞基苯磺酸(pCMBS )——可以抑制利什曼原虫在液体培养基中的生长(实施例4)。因此， 本发明还涉及可以抑制硕大利什曼原虫生长的分子的筛选方法，包括 评价所述分子对LmPDI活性的抑制能力的步骤。蛋白质二硫键异构 酶通常具有多种活性，特别是氧化还原、异构酶以及陪伴分子活性。 本发明的筛选方法可以涉及对LmPDI任何功能的抑制。在本发明的一个特定筛选方法中，对分子抑制LmPDI活性的能 力的评价步骤是在用于使变性的RNaseA ( scrambled RNase A )再活 化的试验中进行的，包括下述步骤 在允许变性RNase A再活化的条件下，在LmPDI存在下，孵 育此变性RNaseA; 加入受试分子，在与允许变性RNase A被LmPDI再活化的条 件相同的条件下，孵育此RNaseA; 将存在受试分子和不存在受试分子时所获得的结果相比较，当 存在受试分子时RNase A再活化的差错说明所述分子具有LmPDI抑 制活性。在本发明的筛选方法中可以使用任何其它的PDI活性试验，特别 是按照Lyles和Gilbert(1991)所描述的原始方案改进的试验。本发明的筛选方法还可以包括用于抑制硕大利什曼原虫在液体培 养基中生长的试验，以及如果合适的话，用于抑制硕大利什曼原虫在 利什曼病实验鼠模型中生长的试验。这种方法的实例在实验部分实施 例5中描述。按如上定义的方法所筛选出来的活性分子具有抑制或调节硕大利 什曼原虫生长的特点。实施例4所示的用杆菌肽获得的结果表明PDI抑制剂能够抑制 利什曼原虫的生长。因此， 一种或多种蛋白质二硫鍵异构酶(PDI) 抑制剂在制备预防、减轻或治疗利什曼原虫感染的药物组合物中的应 用也是本发明的一部分。本发明可以使用的具有抗PDI活性的化合物 有例如抗PDI或抗LmPDI抗体，杆菌肽，杆菌肽锌，5，5，-联硫基双 (2-硝基苯甲酸)(5，5'誦dithiobis (2-iiitrobenzoic) acid， DTNB ),对氯汞基苯碌酸(pCMBS )或tocinoic acid。根据上述应用制备的组合物优选局部地，口服地或通过肠胃外途 径施用给人或动物宿主。本发明的一个特定方面涉及杆菌肽或杆菌肽锌作为引发利什曼病 的寄生虫的生长抑制剂、或作为抗利什曼原虫感染的活性剂的应用，很显然，用于治疗利什曼原虫感染的、含有一种或多种蛋白质二 硫键异构酶(PDI)抑制剂的药物组合物是本发明的一部分。这样的 组合物可特别地含有杆菌肽或杆菌肽锌。该组合物可制备成局部施用 的制剂，例如霜状，软骨剂，香骨剂或喷雾剂，该例举为非限制性的。 本发明人已证明，将这样的组合物以香骨剂对BALB/c小鼠的寄生虫 感染部位局部给药后，能够緩解疾病的发展(实施例9和图14)。本发明还涉及治疗利什曼原虫感染的药物组合物，其含有至少一 种针对LmPDI的特异性抗体和/或任何能够抑制PDI活性的分子。这 样的组合物优选适于局部，口服或肠道外方式给药。治疗利什曼病的方法也落入本发明的保护范围之内，所述方法包 括对人或动物患病个体施用PDI或LmPDI抑制剂，不论该抑制剂是 抗体或任何其它类型的分子。下文的实施例及附图描述了本发明所进行的生物学实验，其目的 为提供所需的实验支持，而不是限制本发明的范围。这些实施例和附 图还以非限制性的方式说明了本发明的实施方案以及重要性的某些方 面。
图l显示对两个毒性最强的分离林(94和67， V)和两个毒性最 弱的分离林(32和07， v )内硕大利什曼原虫基因表达的差异显示(DD ) 分析。图1A显示放射自显影后测序凝胶的一部分，显示使用随机十聚 体引物以及寡聚dT引物PCR扩增的产物。差异表达的CDNA由箭头 标出。pl4cDNA由星号标出。图IB显示Northern印迹分析DD技术所鉴定出的基因在毒性最 强的分离林(94和67， V)和毒性最弱的分离林(32和07， v)内的 表达。从处于稳定生长期的不同分离林前鞭毛体提取得到的mRNA与 放射性标记的探针p14进行了杂交。放射自显影后，印迹先去杂交 (de-hybridized)再与硕大利什曼原虫a-微管蛋白(oc -tub)基因的特异 性探针重杂交。图2显示LmPDI cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )及推导 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。以小写字母表示的核苷酸代表非翻 译域。18nt的前导序列(SL)以下划线标出，而用于多腺苷酸化信号 的潜在序列以方框标出。肽信号的潜在序列以黑体标出。LmPDI潜在 的活性位点以双下划线标出，而使其停留在内质网的可能序列则以虛 线标出。图3显示布氏锥虫(Trypanosoma brucei) ( T. brucei， GenBank 登录号P12865 ) ， Hypocrea jecorina(H. Jecorina， 074568)， Caemorhabditis elegans(C. elegans, 017908) ， Chlamydomonas reinhardtii(C. reinhard, 048949)，黄果錄(Drosophila melanogaster) (D. melano， P54399), Cryptosporidium parvum(C. parvum, Q27553)和人 类(H. sapiens, P072237 )的蛋白质二硫键异构酶与LmPDI氛基酸序 列进行的比对(alignment)。黑色方框内的字母表示相同的氨基酸， 灰色方框表示类似氨基酸。导入了 "空位(gap)"来获得比对序列之 间的最大相似性，并以短划线标出。使用两套软件程序进行序列比对 CLUSTAL W版本1.8; Thompson, J D， Higgins， D G和 Gibson, T J; BOXSHADE版本3.21; Hoffman, K和Baron, M。图4显示对重组LmPDI在再活化变性RNase( scrambled RNase ) 中所起作用的分析结果。25X:下，在含有4.5mM(cCMP)， lmM谷胱 甘肽GSH，0.2mM谷胱甘肽二石充化物(GSSH )，2mM EDTA和lOOmM Tris-HCL， pH 8的緩冲液中，在牛血清白蛋白(BSA ) (l.化M )的存在下，或在牛蛋白质二硫键异构酶蛋白(1.4fiM)的存在下，或在 重组LmPDI (1.4pM )的存在下，孵育变性的RNase A ( 8pm ) 30分 钟，其中牛血清白蛋白作为阴性对照，而牛蛋白质二硫键异构酶作为 阳性对照。在30分钟内，每5分钟测定296nm下的RNaseA活性， 以此确定RNase A的再活化(Lyles和Gilbert, 1991 )。图5A显示对硕大利什曼原虫基因中LmPDI基因拷贝数目的 Southern印迹分析结果。将8吗分离自硕大利什曼原虫94的基因组 DNA用下述限制性酶消化Aval, EcoRV，HindIII， Pstl， EcoRI， Xhol， NcoI，SacI， Sphl。标有星号的酶在LmPDI cDNA上可酶切一次。图5B显示对不同利什曼原虫物种中的LmPDI基因的Southern 印迹分析结果。将8pg分离自硕大利什曼原虫(94)，嗜皮性嬰儿利什 曼原虫(L. infantum MC ),嗜内脏性嬰儿利什曼原虫(L. infantum Vise);杜氏利什曼原虫的基因组DNA用Pstl酶切。在这些试验中基 因组DNA与代表LmPDI整个eDNA序列的探针杂交。图6显示用不同抗LmPDI抗体制品对硕大利什曼原虫中天然 LmPDI进行的免疫检测。将20pg前鞭毛体GLC 94的总蛋白在 Laemmli緩冲液(第1道)中或在0.5m DTT存在下(第2道)以及 在0.05ng产生自大肠杆菌并已纯化的LmPDI ( rLmPDI)存在下(第 3道)进行电泳，然后转移到硝化纤维素膜上，并使用抗-LmPDI免疫 血清(第1道)或亲合柱纯化的抗-LmPDI抗体(第2、 3道)进行显 示。图7显示两种毒性最强(94， 67, V)和两种毒性最弱分离林(32， 7， v)前鞭毛体中LmPDI表达的Western印迹分析结果。将20吗 来自不同分离抹的稳定生长期总前鞭毛体蛋白进行电泳，然后转移到 硝化纤维素膜上，在抗-LmPDI多克隆抗体的存在下孵育该膜。箭头 (〉)指示由抗LmPDI的免疫血清所识别的3种蛋白。图8显示与LmPDI ( 5ng/ml)孵育后，来自在突尼斯人兽互传性 皮肤利什曼病区域生活的个体的单个核细胞的增殖情况。收集淋巴单 核细胞，用RPMI-PS/Glu培养基连续进行3次离心(30ml—次，然后10ml两次)以洗涤，之后计数并在存在或不存在5ng/ml LmPDI 的条件下以106细胞/ml的浓度孵育。培养5天后，加入氚标记的胸苷， 评估对淋巴细胞的刺激作用。结果以CPM表示。图9显示使用杆菌肽在液体培养基中进行的寄生虫(L. major) 生长抑制试验的结果。其是针对在0， lmM, 1.5mM或2mM杆菌肽 存在下硕大利什曼原虫前鞭毛体绘制的96小时生长曲线。图10显示杆菌肽(BAC)，杆菌肽锌(BACZn),对氯汞基苯甲 酸(pCMBA)以及tocinoic acid ( TOC )对重组LmPDI体外活性的 影响。使用不同浓度的抑制剂(0-2mM)跟踪PDI抑制剂对LmPDI 体外再活化变性RNase A的能力的影响。使用无抑制剂时的LmPDI 作为阳性对照(T)。图ll显示杆菌肽(BAC)(图llA)，杆菌肽锌(BACZn)(图11B )， 5，5'-联疏基双(2-硝基苯曱酸)(DTNMB)(图IIC)以及对氯汞基苯 甲酸(pCMBA)(图11D)对利什曼原虫在液体培养基中的体外生长 的影响。使用不同浓度的抑制剂(0-5mM)跟踪PDI抑制剂对寄生虫 的体外增殖的影响。使用未经抑制剂处理的寄生虫作为这些实验的对照(T)。图12显示杆菌肽和杆菌肽锌对于rLmPDI活性的抑制作用。体 外测定杆菌肽(BAC )和杆菌肽锌(BACZn)对于rLmPDI活性的作用。 利用不同的BAC和BACZn抑制剂浓度(0-2mM)进行试验，以此分 析其对rLmPDI体外再活化变性RNase A的能力的影响。未经抑制剂 处理的rLmPDI活性作为阳性对照。图13显示杆菌肽锌对GCL94前鞭毛体增殖的抑制作用。体外测 定杆菌肽锌(BACZn)对于GCL94前鞭毛体增殖的作用。使用不同抑制 剂浓度进行试验，以此分析其对寄生虫体外扩增能力的影响。在不含 抑制剂的完全培养基中培养的寄生虫作为对照(C)。图14显示杆菌肽锌对敏感BALB/c小鼠体内疾病发展的影响，所 述小鼠已被GCL94分离林前鞭毛体所感染。用1(^个GCL94分离林 前鞭毛体感染敏感BALB/c小鼠的爪垫，并使用杆菌肽处理或不处理。该处理在感染后9周停止(箭头表示处理终止)。每条曲线显示单个小 鼠在大小上的变化。实施例下述实施例所显示的实验结果是使用以下材料及方法获得的 寄生虫和培养条件研究中所用的硕大利什曼原虫(L major)分离林来自人ZCL病 变伤口，该伤口是在实施例1所述研究中获得的。26"C下，使用NNN 培养基(以琼脂糖和兔血为基础制备的固体培养基)培养寄生虫，逐 步转移到含有2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100jLig/ml链霉素 和10%灭活胎牛血清的RPMI( SIGMA， St Louis， MO )(完全培养基) 上。将对数生长期的前鞭毛体在恒定体积的完全培养基中调整到106 寄生虫/ml浓度，26n孵育。4-6天后达到稳定生长期，寄生虫密度为 3xl0:8xl(^个寄生虫。使用这些稳定生长期的前鞭毛体进行RNA和 蛋白的提取。RNA提取及差异显示使用"TRIZOL"试剂(Gibco-BRL)提取总RNA。根据制造商说 明书，使用"poly A+RNA分离试剂盒"(Amersham-Pharmacia )，通 过寡聚dT/纤维素柱子纯化poly A+ RNA。在含有lpM寡聚(dT )uMN 引物(其中M-A或C或G， N-A或C或G或T(Genset) )， IX第一 链緩沖液(Gibco画BRL)， 5nM dNTP(Amersham誦Pharmacia)， 10U RNAsin (Promega)以及200U逆转录酶(Gibco-BRL )的20|xl逆转录 反应中4吏用200ng mRNA。37"C孵育1小时后，95C孵育5分钟以终止反应。使用12个寡聚 dT和10个随机十聚体的组合，通过PCR扩增cDNA。 PCR反应溶液 体积为20pl，含有2nl逆转录反应液，0.2nM5，引物，1(iM3'引物， 2jiMdNTP, 10|iCia35SATP, lXTaqDNA多聚酶反应緩冲液和1U Taq聚合酶(Amersham-Pharmacia )。该反应物在Perkin-Elmer 9600 热循环仪上孵育40个循环94" 30秒，40'C 60秒以及72tl 30秒，再72t: 6分钟一个循环。用6。/。丙烯酰胺测序凝胶分析PCR产物。 在Whatmann 3MM滤纸上真空干燥该凝胶，并放射自显影。从凝胶 中切下差异表达的cDNA，洗脱，并在同样的寡聚核苷酸存在下在上 述条件下再次PCR扩增。使用平末端PCR克隆试剂盒(Amersham Pharmacia )，根据厂商说明书，将扩增产物克隆到pMOSblue栽体中。 4吏用Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)测定克隆片段的 序列，并使用ABI 377自动测序仪进行分析。 Nothern印迹分析将200ng从处于稳定生长期的4抹硕大利什曼原虫分离林前鞭毛 体所提取的mRNA变性，在1.2。/。琼脂糖/2.2M甲醛凝胶上进行分离， 毛细管转移到"Hybond N+" ( Amersham-Pharmacia )膜上。然后80 r加热2小时固定该核酸。使用Megaprime DNA标记体系试剂盒 (Amersham-Pharmada )，用[oc 32PIdCTP标记差异表达的cDNA片 段和a-微管蛋白。65。C下，在lXDenhardt， s/6X SSC/0.1% SDS/0.1 mg . ml"鲑鱼精子溶液中，进行杂交过夜。65C下，用含有0.1X SSC/0.1% SDS的溶液清洗该膜，并放射自显影。构建cDNA文库以及对LmPDI cDNA的表征根据厂商说明书(Stratagene )，在ZAPII载体中，利用5jig来自 毒性最强林(GCL94)前鞭毛体的mRNA构建cDNA文库。使用 Megaprime DNA标记体系试剂盒(Amersham-Pharmacia )， 用oc 32P]dCTP标记p14探针，用该探针筛选6 x 1()6噬斑(lysis plaques)。 回收目的噬斑，并再次筛选，以此从污染克隆中分离出阳性克隆。然 后对阳性克隆测序。Southern印迹分析用图5所示的限制性酶消化10网提取自毒性最强林GLC94前鞭 毛体的基因组DNA，并在0.6%的琼脂糖凝胶上分析，然后转移到 HybondN+ (Amersham-Pharmacia)膜上。在[a 32PdCTP放射性标 记的、且与LmPDI的整个cDNA克隆相对应的探针存在下，孵育该 膜。然后用含有0.1X SSC/0.1% SDS的溶液清洗该膜，并放射自显影。重组蛋白LmPDI在大肠杆菌BL21细菌内的表达及纯化 将去除了信号肽编码序列、相应于LmPDI cDNA开放阅读框的序 列(1371bp)克隆到细菌表达栽体pET-22b ( Novagen )中。在LB 培养基内培养含有重组质粒(pET-22b-LmPDI)的大肠杆菌BL21细 菌，再用lmM异丙基-l-硫代-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)处理4小时 谦导重组蛋白的合成。在镍(Ni2+)柱上(Amersham-Pharmacia )通 过亲合层析纯化重组蛋白LmPDI-(His)6 ( SEQ ID NO: 3)。通过 SDS-PAGE证实制得的蛋白的纯度。制备抗LmPDI多克隆抗体以及免疫印迹分析天然蛋白的表达 通过肌内注射500jig纯化重组蛋白LmPDI在弗式不完全佐剂 (IFA， Sigma)中的乳化液(v/v)以免疫兔子。再给兔子另外注射两次 500ng重组蛋白。第一次是在最初注射后15天进行的肌内注射，而笫 二次是在30天后进行的皮内注射。最后一次注射后，釆取兔血10天，收集血清保存在-80t:。 ioox:下，将来自前鞭毛体的蛋白裂解物在Laemmli 1X緩冲液中变性10分钟，加载在12%的SDS丙烯酰胺凝胶 上，并电转移到硝化纤维素膜上(Millipore)。室温下将该膜孵育在饱 和PBS/0.1o/。Tween20/3。/。脱脂奶溶液中1小时，然后在4"C,用含有 1/1000稀释的抗LmPDI抗体的相同溶液孵育过夜。在 PBS/0.1%Tween20中清洗3次后，室温下，在偶联了过氧化物酶的兔 抗-IgG 二抗(Amersham-Pharmacia，稀释到1/1000)存在下赙育该 膜1小时，之后在PBS/0.1%Tween20中清洗3次。使用"ECL系统" 试剂盒(Amersham-Pharmacia)，根据厂商说明书，通过检测过氧化 物酶的活性来测定蛋白抗体复合物。 制备变性的RNaseA将20mg纯化的核糖核酸酶(RNase A )于室温下置于pH 8.6且 含有0.15M DTT， 6M胍-HCl以及0.1M Tris-HCl的緩冲液中18小时， 使其变性，再通过0.01MHC1平衡的SephadexG-25柱进行纯化。在 275nm下，使用9200M"cm1的消光系数测定变性RNase A(scrambled RNaseA)级分的浓度。-80^0下将此级分保存两周。重组LmPDI蛋白对RNase A的再活化作用25C下，在含有4.5mMcCMP， lmM谷胱甘肽GSH， 0.2mM谷 胱甘肽二石克化物GSSH， 2mMEDTA和100mMTris-HCl， pH8的緩 冲液中，在牛血清白蛋白(BSA) (1.—M)的存在下，或在牛蛋白质 二石危键异构酶蛋白(1.4pM)的存在下，或在重组LmPDI (1.4liM) 的存在下，孵育变性的RNaseA (8pm) 30分钟，其中牛血清白蛋白 作为阴性对照，而牛蛋白质二硫键异构酶蛋白作为阳性对照。如文献 (Lyles and Gilbert, 1991)所述，每5分钟测定296nm下的RNase A 活性，以此确定RNaseA的再活化。实施例1:筛选具有不同毒性水平的硕大利什曼原虫分离林本研究所用的硕大利什曼原虫分离抹来自人ZCL病变伤口 ，该伤 口获自1994-1995年在突尼斯南部E1 Guettar进行的前瞻性研究期间 (Louzir, Melby et al， 1998 )。根据其在敏感型BALB/c小鼠感染试验 中的致病力，从19个分离抹中进行挑选来自不同分离林的2乂106无 鞭毛体被注射到BALB/c小鼠后爪垫中，并在9周内每周观察伤口的 进展。感染后5周，测定由寄生虫抗原体外激活的淋巴结(lymphatic ganglia)单个核细胞产生的IL-4和IFN- y量。这些试验首先显示了不同硕大利什曼原虫分离林所诱导的疾病的 进展有巨大差异，其次说明了使用单个分离林能够产生重现性结果。感染后5周，毒性最强的林体外诱导产生了最大量的IL-4和最低 水平的IFN-Y 。在BALB/c敏感型小鼠的感染实验模型中，用硕大利什曼原虫感 染的临床表现根据分离林的不同而有所变化，而用其中单个的分离林 感染则可以得到重现性结果，根据这些观察结果，本发明人建立了这 样的假说当比较毒性最强和最弱的分离林时，与毒性相关的那些基 因可能会被差异表达。已经由其它作者描述过的与寄生虫的毒性相关 的一组基因，包括LPG1， LPG2, KMP-ll， Cpc， Cpb， HsplOO, Gene B和gp63，其表达情况已通过逆转录技术和定量基因扩增技术 进行了初步分析。在对BALB/c小鼠表现出不同致病力的硕大利什曼原虫分离林之间，该分析并没有显示出任何差异(Kebaier， Louzir et al， 2001 )。两抹诱导重度损伤且快速发展的分离林MHOM/TN/94/GLC94 和MHOM/TN/94/GLC67 (分别为GLC94和GLC67 )代表毒性最强 的分离林，而两林i秀导轻度试验症状的分离林MHOM/TN/94/GLC07 和MHOM/TN/94/GLC32 (分别为GLC07和GLC32 )代表毒性较弱 的分离林，它们被选择出来，以继续研究在不同林内具有潜在不同表 达水平的毒性基因。实施例2:差异显示技术鉴定硕大利什曼原虫的新蛋白质二疏鍵 异构酶LmPDI，其参与天然寄生虫毒性1-鉴定那些在硕大利什曼原虫强毒性分离抹和弱毒性分离株内差 异表达的基因首先，从两林强毒性分离抹(GLC94和GLC67)和两林弱毒性 分离林(GLC32和GLC07)的前鞭毛体纯化mRNA，然后使用 Oligo(dT)nMN引物，逆转录为cDNA，其中M-A或C或G， N=A 或C或G或T。该差异显示试验过程中所用的引物为使用与逆转录反应所用相同的Oligo-dT引物以及10个随机引物， 按科学文献(Liang和Pardee, 1992; Liang, Bauer et al 1995; Heard, Lewis etal， 1996 )所述的，进行PCR扩增反应。总体而言，产生并分析了 60种引物组合。使用不同引物组合所产 生的扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶进行分析，结果显示来自硕大利什 曼原虫不同分离林(强毒性和弱毒性)的基因约95。/。表达相同mRNA 并且表达水平相同。仅25个信使RNA在强毒性和弱毒性分离林之间 似乎差异表达(图1A)。先从丙烯酰胺凝胶中分离出差异表达的cDNA， 然后使用与第一次PCR所用相同的引物组合再次扩增，最后克隆到 pMOS载体中。对不同克隆测序后鉴定了其中一些。使用差异表达的14个片段作为探针，通过Northern印迹分析硕 大利什曼原虫不同分离林的mRNA，结果显示在14个分离林中，有3个克隆在强毒性和弱毒性分离林之间表现出差异表达。其中 一个克隆p14已经用Northern印迹进行鉴定。相应于克隆p14的探针与约2.2kb 大小的转录物特异性地杂交，与两个弱毒性分离林相比，该转录物在 两个强毒性分离株内优势表达(图1B)。这证实了由差异显示技术获 得的结果。克隆pl4全长被测序，该克隆为339bp。该片段核苷酸序 列与数据库(GenBank和EMBL )内的各序列之间比较后，未发现显 著同源的序列。这可能是由于pl4克隆对应着信使RNA的非翻译3' 末端区域所致。2-克隆并分析p14全长cDNA序列为分离得到相应于pl4克隆的全长cDNA序列，使用339bp片段 来篩选GLC94分离抹前鞭毛体的cDNA文库。从^f皮分析的6X105f 组克隆中分离得到2个阳性克隆。图2显示最长克隆的核苷酸序列， 其为2094bp( SEQ ID NO: 1)。该克隆具有编码477个氨基酸(aa )多 肽的开放阅读框，所述多肽的理论分子量为52.4kDa，等电点为5.22。 该蛋白的N末端相应于向内质网运送所需的潜在信号肽，20aa长度。 非翻译的5，区域含有一个利什曼原虫特有的剪切前导序列，而非翻译 的3'区域含有多聚A尾巴，其前边即为潜在的聚腺苷酸化位点(图2),该分离克隆的多肽序列与几种物种的蛋白质二石危键异构酶家族蛋 白(PDI和Erp)具有27-36%的同一性(图3)。另外，该蛋白在47-52 和381-386位残基处含有两个与PDI、 Erp和石危氧还蛋白家族蛋白的 潜在活性位点(Cys-GIy-His-Cys，或CGHC)相同的区域。C末端区 域在474-477位残基处显示出潜在的KDEL(EEDL)型内质网滞留信 号，这说明，如同PDI和Erp—样，该蛋白可在内质网腔内被发现。 这样，P14就是一种来自硕大利什曼原虫蛋白质二硫键异构酶家族的 蛋白。其被命名为LmPDI (图2和3 )。为确定LmPDI是否具有大多数已描述的蛋白质二硫键异构酶显 示出的氧化还原酶巯基-二硫化物活性(oxido-reductase thiodisulfide activity),我们研究了重组蛋白LmPDI使变性RNase A复性的能力。 在大肠杆菌中合成重组LmPDI,然后纯化，并用于再活化RNase A的体外试验。获得的结果显示LmPDI能够恢复RNaseA活性，其再 活化作用的方式类似于牛PDI的，试验使用牛PDI作为对照(图4)。为鉴定编码LmPDI的基因的拷贝数目，本发明人使用"P标记的 LmPDI cDNA片段作为探针，进行了 Southern印迹类型的杂交。所 获的结果基本上显示出单一的带，除了在LmPDI cDNA内部带有切割 位点的那些酶(图5A)。因此，编码LmPDI的基因很可能在硕大利 什曼原虫基因组内以单拷贝存在。另外，在受试的各种利什曼原虫物 种(嗜皮性嬰儿利什曼原虫(L. infantum MC )，嗜内脏性(viscerotropic) 嬰儿利什曼原虫(L. infantum Vise)和杜氏利什曼原虫)中，LmPDI 基因似乎是保守的(图5B)。3-LmPDI表达的免疫印迹分析为表征天然蛋白的表达，用大肠杆菌内合成再通过亲合层析纯化 的重组LmPDI蛋白免疫兔子。通过免疫印迹，本发明人发现，所获 的抗LmPDI多克隆抗体极有效地识别GLC94稳定生长期前鞭毛体裂 解物中预期大小(55kDa)的蛋白(图6)。另外，还检测到另两种蛋 白。第一种蛋白分子量为105kDa，相应于LmPDI的约2倍，第二种 蛋白的分子量为35kDa。为证实105kDa蛋白是否对应于LmPDI二聚 体，在高浓度DTT(0.5mM)存在下，分析变性的GLC94前鞭毛体裂解 物。该条件下，抗LmPDI抗体未能检测到105kDa蛋白。这些结果i兌 明LmPDI被组装成寡聚物。35kDa蛋白似乎是污染物。事实上，亲 合柱(Sepharose 4B-LmPDI )上纯化的抗LmPDI抗体不再识别35kDa 蛋白(图6)。为了比较毒性最强和毒性最弱的分离抹内LmPDI的表达水平， 提取稳定生长期的前鞭毛体蛋白并定量。在12。/。聚丙烯酰胺-SDS凝 胶上分析5pg蛋白，并转移到硝化纤维素膜上。使用抗LmPDI抗体 进行的Western印迹显示LmPDI ( 55kDa )及其二聚体(105kDa) 在毒性最强的分离林内表达更强烈(图7)。相反，35kDa的污染蛋白 在各个受试株内以同等方式表达。这些结果说明LmPDI的表达水平 和被研究分离林的致病力之间存在相关性。实施例3: LmPDI诱导有活动性损伤或ZCL前驱症状的个体的 单核细胞体外增殖由于硕大利什曼原虫LmPDI在寄生虫感染阶段会高度表达，因 此可以作为细胞免疫反应的靶标。为证实该假说是否中肯，通过获自 有活动性损伤或ZCL前驱症状的个体的单核细胞的增殖试验来评价 LmPDI诱导细胞免疫反应的能力。该研究通过37名El Guettar(突尼斯南部)居民进行，针对这些个 体获得了相对于寄生虫全部抗原的细胞增殖试验(SLA, —种能够显 示与寄生虫事前有接触的试验)结果。按下述将这些个体分组l组8名SLA试验阴性的个体；2组29名SLA试验阳性的个体。通过Ficoll/Hypaque梯度离心(Pharmacia, Uppsala, Sweden )， 从外周血中分离出含有淋巴细胞和单核细胞的单核的细胞。结果(图8)显示对于免疫的个体有显著增殖。将单核的细胞与同浓度的LmPDI孵育48小时，诱导PBMC培养 物上清液内的细胞因子(IFN-P， IL-4)，使用人抗IL-4和抗IFN-P 单克隆抗体(Pharmingen, San Diego, CA )进行ELISA检测以评价这 些细胞因子。结果来自个体的小样品。它们清楚地显示在LmPDI刺激过的细 胞上清液中，不存在IL-4而存在显著量的IFN-P。该结果显示基本上是Thl型反应，说明LmPDI能够作为抗利什 曼病的疫苗备选物质。实施例4: PDI抑制剂的存在可以抑制液体培养基中硕大利什曼 原虫的生长杆菌肽是一种已知的PDI抑制剂。使用杆菌肽进行的试验表明 终浓度为2mM的杆菌肽完全抑制了硕大利什曼原虫在液体培养基内 的生长(图9)。这些试验在下述试验条件下进行a)制备变性的RNaseA将20mg纯化的核糖核酸酶(RNase A )于室温下置于pH 8.6的 含有0.15M DTT， 6M胍-HC1以及0.1M Tris-HCl的緩冲液中18小时， 使其还原变性，再通过0.01M HC1平衡的Sephadex G-25柱进行纯化。 在275nm下，使用9200M"cnT1的消光系数测定变性RNase A级分的 浓度b -80匸下将这些级分保存两周。b) 重组LmPDI蛋白对RNaseA的再活化作用25C下，在含有4.5mMcCMP， lmM谷胱甘肽GSH， 0.2mM谷 胱甘肽二硫化物GSSH, 2mM EDTA和lOOmM Tris-HCl, pH 8的緩 冲液中，在牛血清白蛋白(BSA) (1.4|uM)的存在下，或在牛蛋白质 二石克键异构酶(1.4^M)的存在下，或在重组LmPDI (1.4pM)的存 在下，孵育变性的RNase A ( 8pM ) 30分钟，其中牛血清白蛋白作 为阴性对照，而牛蛋白质二硫键异构酶作为阳性对照。如文献(Lyles and Gilbert, 1991)所述，每5分钟测定296nm下的RNase A活性30 分钟，以此确定RNaseA的再活化。c) 体外测试不同PDI抑制剂对于重组LmPDI的巯基-二硫化物氧 化还原酶活性的抑制作用对重组LmPDI进行的巯基-二硫化物氧化还原酶活性 (thio-disulfide oxido-reductase activity)抑制试验的试验条件与"重组 LmPDI蛋白对RNase A的再活化作用"段所述的条件完全一致，除了 反应在O.OlmM， O.lmM， 0.5mM，和2mM下述PDI抑制剂存在下 进行 杆菌肽 杆菌肽锌 对氯汞基苯甲酸(pCMBA)tocinoic acidd) 抑制寄生虫(硕大利什曼原虫)在液体培养基中生长 为测定杆菌肽(BAC),杆菌肽锌(BACZn)，对氟汞基苯甲酸(pCMBA )， 5，5'-联硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB )对利什曼原虫 在液体培养基内的体外生长的影响，上述抑制剂以不同的浓度，即0mM， 0.05mM， O.lmM, 0.2mM, 0.5mM, lmM， 1.5mM， 2mM, 2.5mM，和5mM，加入到含有5%胎牛血清和2xl06/ml指数生长期寄 生虫的RPMI中。26X:孵育该寄生虫，并在96小时内，每24小时进 行计数。在Mallassez单元(cell)上计数寄生虫。实施例5:就其抑制硕大利什曼原虫生长的能力评价LmPDI抑制分子对于LmPDI在利什曼原虫毒性中所起作用的评价可以开发出新 的策略来鉴定在利什曼病治疗过程中有效的分子。杆菌肽之外的已知 具有抗PDI活性的分子可能能够抑制该寄生虫的生长。在此提出了一 种评价分子抗利什曼原虫的潜在有效性的方案实例。可分三个步骤评价已知分子的抗PDI活性或那些将要被新鉴定的 分子。第一个步骤中，体外测试该分子对大肠杆菌中合成的重组 LmPDI蛋白的作用。然后进行抑制寄生虫在液体培养基内的生长的试 验，最后利用利什曼原虫的试验鼠模型试验这些分子。l-评价对重组LmPDI的抑制作用分析LmPDI的PDI活性的技术在实施例2和上面的材料和方法 部分已详细描述。可使用同样的技术，通过向反应液中加入不同浓度 的潜在抑制剂来评价某个已知或待鉴定的PDI抑制剂的能力(使用 LmPDI分子模型)。将结果表示为相对于仅仅緩沖液的抑制作用百分 比。只保留那些具有明显的且剂量依赖性的LmPDI抑制活性的分子。为了确定文献中所述的各种PDI抑制剂是否能够抑制LmPDI的 巯基-二硫化物氧化还原酶活性，以不同的浓度体外试验这些抑制剂阻 断LmPDI的该酶活性的能力，所述LmPDI由大肠杆菌合成并已被纯 化。抑制剂为 杆菌肽*杆菌肽锌 对氯汞基苯甲酸(pCMBA )tocinoic acid结果如图10所示，该结果表明O.OlmM pCMBA和2mM杆菌肽或杆菌肽锌的存在就会完全抑制LmPDI的活性。与此相反，在所 采用的浓度下(该浓度能够完全抑制人类PDI的活性)，tocinoic acid 似乎对于LmPDI的活性并没有太大作用。
2-抑制寄生虫(硕大利什曼原虫)在液体培养基内生长。将试验 分子溶解在溶剂中，溶剂的适合性取决于其物理化学性质(在水溶液 或有机溶剂中的溶解度)。所有试验中使用单独溶剂作为对照。例如， 试验可以利用硕大利什曼原虫GLC94分离林进行。培养基的组分已 在上面给出(实施例2及材料和方法)。26'C孵育培养物，并定期重新 接种以使寄生虫维持在稳定生长期。在某些试验中使用了无鞭毛体样 阶段的寄生虫。这种情况下，离心稳定生长期的寄生虫(前鞭毛体)， 将培养基替换为pH5.0且补充了胎牛血清(FCS)的Schneider Drosophila培养基。然后在35C, 5%<:02下孵育培养物。
硕大利什曼原虫前鞭毛体生长的抑制试验是采用指数生长期的寄 生虫进行的，将其初始浓度调整为106寄生虫/1111完全培养基，在存在 或不存在各种浓度受试分子的条件下，在96孔培养板上以100nl/孔的 量孵育。26"C, 5% C02下孵育寄生虫，并在96小时内每24小时计 数。在Mallassez单元上进行寄生虫计数。或者使用血细胞计数器。 所有的测定均一式三份。以抑制浓度来确定分子的抑制能力，所述浓 度为与对照相比能够将细胞分裂降低50%的浓度(IC50 )。
使用Almar Blue作为生存/生长指示剂，通过荧光测定试验评价 无鞭毛体生存力的降低。
为测定在(l-)段中所述的PDI抑制剂对寄生虫体外生长的抑制 能力，对其进行试验。向含有2xl(^指数生长期的寄生虫/ml的RPMI 中加入不同量的抑制剂。26X:下孵育寄生虫，并在96小时内每M小 时计数。在Mallassez单元上进行寄生虫计数。所获结果如图11所示， 该结果显示浓度分别为5mM， 2mM和0.5mM的杆菌肽、杆菌肽锌 和PCMBA完全抑制了利什曼原虫的生长。与此相反，在所采用的浓 度下(该浓度能够完全抑制人类PDI的活性)，5，5，-联硫基双(2-硝基 苯曱酸)(DTNB)似乎对于利什曼原虫的生长并没有太大作用。3-测定预先选择的抑制剂在硕大利什曼原虫感染敏感型BALB/c 小鼠试验模型中的效力。该体内试验取决于受试分子的毒性和理化特 性。可以用106稳定生长期的硕大利什曼原虫前鞭毛体感染BALB/c 小鼠，并注射(50nl体积)到右后爪垫内。使用游标卡尺每周测量伤 口的直径。
总的说来，根据情况，可以使用三种治疗方案
对于易扩散且低毒或无毒的疏水分子，可使用不同的方案，以 不同的浓度，腹膜内注射该产品。注射的频率视该分子的生物利用率 和半衰期而定。所有试验中，该方案均在注射后9周末尾结束。
对于水溶性的且相对具有毒性的分子，可在伤口内部通过至少 4次对硬化区的注射(通常可将活性剂量除以10)来完成注射。
对于脂溶性分子，对试验伤口每周施用香骨剂进行测试。
总之，不论受试产品的注射方式如何，可以进行两种类型的方案
注射寄生虫后随即开始的方案；
注射寄生虫后4-5周才开始的方案，在该起始时间点上，损伤 已经建立。
所有试验中，在方案结束后，处死小鼠并在注射位点以及引流损 伤的结中估计寄生虫负荷。
实施例6:利什曼原虫体外感染鼠巨噬细胞
从雌性BALB/c小鼠股骨或胫骨内抽出骨髓并从中分离鼠骨髄巨 噬细胞(MBMM )。在多孔板上以1.5x103细胞/孔的量在500nl完全培 养基中培养MBMM。为刺激MBMM的生长和成熟，向培养基内补充 20%的L-929成纤维细胞的条件培养基，其作为巨噬细胞集落刺激因 子(MCSF)的来源。37n， 5。/oC02下培养6天后，去除培养基，清 洗MBMM，加入含有10%胎牛血清但不含L-929成纤维细胞条件培 养基的新鲜RPMI。通过差速离心法，从未溃烂的损伤中纯化出伤口 内的无鞭毛体，并使用锥虫蓝病毒染色计数。使用这些寄生虫，以4 个寄生虫/巨嗟细胞的终比例感染MBMM。加入寄生虫后2小时，用 PBS洗涤巨噬细胞5次，以去除未被吞噬的无鞭毛体。然后在37匸，95%空气和5% C02下孵育该培养物。在不同的时间点进行试验 30min，及2， 24和72小时。在各个时间点，用PBS洗涤各孔，去除 覆盖物，室温下用乙醇固定被感染的巨噬细胞1小时。然后清洗该板 之后用Giemsa染色以追踪感染。
在每孔中央计数被感染的巨噬细胞，在孔中央细胞分散良好，可 以容易地计数寄生虫。在板的这种水平，寄生虫/巨噬细胞的比例可以 高于4。
实施例7:通过蛋白质二硫键异构酶抑制剂抑制重组LmPDI的酶
活性
已有文献描述了几种蛋白质二硫键异构酶(PDI)抑制剂(Ryser et al， 1994， Orlandi 1997， Mouetal， 1998)。其中，杆菌肽和杆菌肽锌 是由枯草杆菌(Bacillus subtilis )和地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis )产生的多肽抗生素复合物。杆菌肽A是商业杆菌肽的主 要化合物，其为至少9种杆菌肽的混合物。该抗生素能够抑制许多革 兰氏阳性细菌细胞壁的合成，还能够抑制许多蛋白酶的活性，所述蛋 白酶如PDI,谷氨酰胺转移酶，木瓜蛋白酶以及神经肽酶。这些蛋白 酶的大多数都在其活性位点具有半胱氨酸残基。
第一步，本发明人检验这些抑制剂的作用以验证它们体外改变重 组LmPDI (rLmPDI)酶活性的可能能力。
使用上述变性RNase技术(Lyles和Gilbert, 1991 )来说明LmPDI 的活性。将20mgRNaseA(Amersham-Pharmacia)于室温下置于pH 8.6的含有0.15M 二硫苏糖醇，6M胍HC1以及0.1M Tris-HCl的緩冲 液中18小时，4吏其变性。再通过0.01M HC1平衡的Sephadex G-25 柱进行纯化，并在275nm下用分光光度法定量。
在基于谷胱甘肽的还原緩冲液中，PDI可以催化变性RNase复性 (Gilbert, 1998 )。以2，-3'-环胞苷单磷酸(cCMP )为底物，分光光度 法测定RNase活性的恢复。将8pM变性RNase，单独或在1.4pM牛 血清白蛋白(BSA )或1.4|iM rLmPDI的存在下，与含有4.5mM cCMP， lmM还原型谷胱甘肽(GSH), 200 pM氧化型谷胱甘肽(GSSG ),2mM EDTA和lOOmM Tris-HCl, pH8的緩冲液混合。室温下反应30 分钟。通过在反应的半小时内每5分钟测定一次296nm下的吸光度来 记录由RNase复性导致的cCMP水解。
在不同浓度杆菌肽(BAC 0.01mM-2mM)和杆菌肽锌(BACZn, 0.01mM-2mM)的存在下，测定重组LmPDI ( rLmPDI)的活性。结 果如图12所示。
这些结果显示，杆菌肽和杆菌肽锌具有类似的效果。在这两种产 品存在下，O.lmM时观察到了 50%抑制，在0.5mM下为700/。， 2mM 下为100%。抑制rLmPDI的这些浓度与文献中描述的作为其它物种 PDI的抑制剂时的浓度相当。
实施例8:在杆菌肽锌存在下硕大利什曼原虫前鞭毛体的体外生 长动力学
本发明人随后测试了杆菌肽锌对硕大利什曼原虫前鞭毛体的体外 生长动力学的影响。该研究中仅试验了杆菌肽锌，首先是由于它对 rLmPDI酶活性的抑制镨与杆菌肽的相同，其次是由于杆菌肽与杆菌 肽锌相比更加稳定且毒性更低。
为此，在凝结的兔血清为基础的培养基上培养GLC94分离林前 鞭毛体2天。然后将寄生虫(2xl(^寄生虫/ml)转移到含有浓度为1， 1.5， 2.5mM的杆菌肽锌BACZn的完全培养基中。将在不含有抑制剂 的完全培养基中生长的前鞭毛体作为对照。通过在48， 72和96小时 计数寄生虫来进行监测。结果如图13所示。
这些结果说明，当杆菌肽锌浓度为1.5mM时，寄生虫的生长被部 分抑制，而当浓度为2mM和5mM时则被完全抑制，而浓度在lmM 时不起作用。因此，非常重要的是注意到，该分子能够阻断培养的硕 大利什曼原虫寄生虫的增殖。
实施例9:杆菌肽锌存在下对BALB/c小鼠中硕大利什曼原虫前 鞭毛体生长的抑制作用
杆菌肽锌已经成为一种治疗手段，杆菌肽锌的可获得性允许测试 其对BALB/c小鼠的硕大利什曼原虫感染进展的影响。用GLC94分离林处于稳定生长期的前鞭毛体(106前鞭毛体爪)感染小鼠后爪爪垫， 并用基于5mM或25mM BACZn (制备在凡士林中)的香骨处理。注 射寄生虫后48小时开始施用药骨，每天一次， 一周5天。以同样的方 式感染小鼠并用凡士林处理作为对照。每周测量伤口的大小。结果如 图14所示。
尽管是初步研究，但这些结果仍显示当以香骨剂形式在注射部 位局部使用杆菌肽锌时，其能够緩解BALB/c小鼠的疾病进程。应该 强调在处理组小鼠中，用5mM杆菌肽处理的3只小鼠中，有2只 出现损伤减轻，而用25mM杆菌肽处理的4只小鼠中，有2只出现损 伤减轻。由于BALB/c小鼠不能完全灭除寄生虫，预期在终止治疗后 会出现临床疾病复发，即使是用于人类的治疗方法(锑酸葡胺和 paramomycin)对于BALB/c小鼠中诱导的疾病也几乎无效，在 BALB/c小鼠中从未观察到寄生虫的完全消失。
因此，我们认为LmPDI可以作为抵抗利什曼原虫的化学疗法的 潜在靶标，而且杆菌肽似乎对硕大利什曼原虫具有潜在效力。
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1. 与利什曼原虫(Leishmania)毒力相关的蛋白质，其包含至少一个与蛋白质二硫键异构酶家族(PDI)蛋白质的潜在活性位点相同的位点(Cys-Gly-His-Cys)。
2. 与利什曼原虫毒力相关的利什曼原虫蛋白质，其包含至少一个与蛋白质二硫键异构酶家族(PDI)蛋白质的潜在活性位点相同的位点(Cys-Gly-His國Cys )。
3. 权利要求1或2的蛋白质，其特征在于它是硕大利什曼原虫(Leishmania major )的LmPDI蛋白，具有SEQ ID NO: 2的序列，或者是与LmPDI具有至少40%同一性，优选至少80%同一性的任何 LmPDI功能性变体。
4. 重组多肽，其含有至少一个权利要求1-3任一项所述蛋白的多于10个氨基酸的片段，当对人或动物宿主施用该重组多肽时，所述重组多肽能够引发针对LmPDI的表位的免疫反应。
5. 权利要求4的重组多肽，其特征在于，它是具有SEQIDNO: 3序列的LmPDI-(His )6蛋白。
6. 含有与另一多肽片段融合的权利要求4的重组多肽的融合蛋白，当对人或动物宿主施用该融合蛋白时，所述融合蛋白能够引发针对LmPDI的表位的免疫反应。
7. 编码权利要求1-6任一项的蛋白质或多肽的重组核酸序列。
8. 权利要求7的核酸序列，其特征在于，其含有相应于SEQ ID NO: 1第241-1674位核苷酸的编码序列，或者所述序列的大小为100个或更多个核苷酸的片段。
9. 核酸载体，其特征在于其含有权利要求7或8的核酸序列。
10. 权利要求9的载体，其特征在于其为质粒，粘粒，噬菌体或病毒。
11. 含有权利要求9或10的载体的培养细胞。
12. 权利要求11的细胞，其特征在于其为细菌菌株LmPDI-XLu于2001年1月31日保藏在国立微生物保藏中心[CNCM， the National Collection of Microorganism Cultures]，保藏号为1-2621。
13. 在高严格条件下能够与SEQ ID NO: 2核酸序列特异性杂交 的核酸探针在确定生物样品中编码LmPDI的毒力基因存在与否中的应用。
14. 核苷酸引物，其特征在于其允许从利什曼原虫感染细胞特异 性地扩增SEQ ID NO: 1序列的至少部分序列，由此允许确定生物样 品中是否存在编码LmPDI的毒力基因。
15. 纯化的抗体，其特异性地识别LmPDI。
16. 免疫原性组合物，其含有权利要求l、 2、 3或6的蛋白质和/ 或权利要求4或5的重组多肽，和/或权利要求7或8的核酸序列，和 /或权利要求9或10的栽体，和/或权利要求11的细胞，所述免疫原性 组合物能够在体外刺激单核的细胞的增殖，所述单核的细胞来源于与 利什曼原虫寄生虫接触过的个体。
17. 权利要求16的免疫原性组合物，其能够在体外刺激单核的细 胞增殖，所述单核的细胞来源于与硕大利什曼原虫接触过的个体。
18. 权利要求16或17的免疫原性组合物，其为对人类或动物宿 主施用的药学上可接受的制剂。
19. 权利要求16至18的免疫原性组合物，当施用给人类或动物 宿主时，其能够诱导Thl型免疫应答。
20. 免疫接种组合物，含有权利要求1， 2, 3或6的蛋白质和/ 或权利要求4或5的重组多肽，和/或权利要求7或8的核酸序列，和 /或权利要求9或10的栽体，和/或权利要求11的细胞，所述免疫接种 組合物旨在保护人类或动物宿主免患利什曼病。
21. 权利要求20的免疫接种组合物，其为对人类或动物宿主施用 的药学上可接受的制剂。
22. 权利要求16-21任一项的免疫原性和/或疫苗组合物，还含有 利什曼原虫的外源抗原和/或编码利什曼原虫外源抗原的核酸序列。
23. 能够抑制硕大利什曼原虫生长的分子的筛选方法，包括评价所述分子抑制LmPDI活性的能力的步骤。
24. 权利要求23的筛选方法，其中，评价所述分子抑制LmPDI 活性的能力的步骤是在再活化变性RNaseA的试验中进行的，所述试 验包括以下步骤 在允许变性RNaseA再活化的条件下，在LmPDI存在下，赙育 变性的RNase A; 加入受试分子，在与允许变性RNase A被LmPDI再活化的条件 相同的条件下，孵育变性的RNaseA;.将存在受试分子和不存在受试分子时所获得的结果相比较，当 存在受试分子时RNase A再活化的差错说明所述分子具有抑制 LmPDI的活性。
25. 权利要求23或24的筛选方法，进一步包括抑制硕大利什曼 原虫在液体培养基中生长的试验，如果合适的话，还包括抑制硕大利 什曼原虫在利什曼病试验鼠模型中生长的试验。
26. —种或多种蛋白质二硫键异构酶(PDI)抑制剂在制备旨在 用于预防、緩解或治疗利什曼原虫感染的药物组合物中的应用。
27. 权利要求26的应用，其中PDI抑制剂为抗PDI或抗LmPDI 的抗体，杆菌肽，杆菌肽锌，5，5'-联硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)， 对氯汞基苯碌酸(pCMBS )或tocinoic acid。
28. 权利要求26或27的应用，用于制备对人或动物宿主进行局 部、口服或肠胃外给药的组合物。
29. 杆菌肽或杆菌肽锌作为引起利什曼病的寄生虫生长的抑制剂 的应用，或者作为抗利什曼病感染的活性剂的应用。
30. 用于治疗利什曼病感染的药物组合物，其含有权利要求15 的抗体。
31. 权利要求30的组合物，其适于局部、口服或肠胃外给药。
32. 用于治疗利什曼原虫感染的药物组合物，其含有一种或多种 蛋白质二硫键异构酶(PDI)抑制剂。
33. 权利要求32的药物组合物，其含有杆菌肽或杆菌肽锌。
34. —种体外诊断可引发利什曼病的寄生虫感染的方法，其特征 在于其包括 将至少一种权利要求15的抗体与患者的生物样品在允许所述抗 体和生物样品中所含抗原性蛋白形成免疫复合物的条件下相接触，其 中所述患者部分地感染了引发利什曼病的寄生虫；.检测所述复合物。
35. 用于实施权利要求34的方法的诊断试剂盒，其特征在于其含有 至少一种权利要求15的抗体； 适于形成与所述抗体的免疫复合物的介质； 允许检测所形成的任何复合物的试剂； .如果适当的话，对照样品。
全文摘要
本发明涉及抗利什曼病领域。本发明从野生型硕大利什曼原虫分离株中分离出了被称为LmPDI的蛋白编码基因，该蛋白具有两个与蛋白质二硫键异构酶(PDI)蛋白潜在活性位点序列(Cys-Gly-His-Cys)相同的区域。LmPDI蛋白主要在毒性最强的寄生虫分离株内表达。该蛋白可用于制备抗利什曼病药物，可用于制备免疫原性组合物以及疫苗制剂，使人和动物宿主免受利什曼原虫感染。
文档编号C12N15/09GK101274960SQ200810001348
公开日2008年10月1日 申请日期2002年6月17日 优先权日2001年6月18日
发明者H·罗兹尔, K·德拉吉, M·乔尼克, 阿乔尔 Y·本 申请人:突尼斯巴斯德研究所;巴斯德研究所