低温失活的工业用面包酵母的制作方法

专利名称：：低温失活的工业用面包酵母的制作方法低温失活的工业用面包酵母本申请是申请日为1995年3月16日，申请号为95102496.5，发明名称为"低温失活的工业用面包酵母"的发明专利申请的分案申请。本发明涉及一种研制具有Lti特性的工业用面包酵母菌株的方法，根据本发明方法研制的酵母菌株，所说菌株在制备烤制用生面团中的应用，制备含有这些酵母菌株之一的冷却烤制用生面团的方法以及根据本发明方法制备的烤制用生面团。已知用酵母发酵的烤制用生面团的口味和质地比用化学试剂发酵的生面团有许多优点。商业上销售的面包房产品也是己知的。例如制作面包巻和croissants的生面团，这些产品在发酵和烙烤前打算保存在冰箱中，不过它们含有化学发酵剂。相应地，EP0,487,878描述了具有Lti特性的作为发酵剂的酵母菌株在制备制面包产品(其在冷藏后放在炉子中烘烤)中的应用，换句话说Lti特性是在冷藏期间活性非常低但在这些温度下能存活的特性(Lti是英语表达"低温失活"的首字母縮略词)。然而这些酵母太旺盛，即是说在稍高的冷却温度即8—12。C之间，或甚至于14。C时释放太多的气体，事实上，有时在通常的工业贮存冷藏产品条件下过长时间后普遍能观察到这种现象。这种活力尤其应归因于这些菌株中MAL等位基因的存在，该等位基因是活化的并且不受分解代谢途径的阻遏，而且这种活力还归因于未足够选择这些菌株的Ui特性。最终，这些酵母就不能最佳地顺利地响应其工业生产所需的所有条件，例如良好的干燥性能或高的生长率。另外，W093/01724和EP0,556，905描述了具有与EP0，487，878中所述相似特性的酵母菌株的应用。但是，所描述的菌株属于Lts突变体类型(Lts是英语表达"低温敏感性"的首字母缩略词；Singh等人，1974,Genetics77，651-659)，其通常在冷却温度下快速地丧失其生活力。此外，这些酵母适应最佳工业生产及应用的能力很差。的确，它们是单倍体和营养缺陷型实验室酵母，其在传统的工业用培养基上几乎不能生长。此外，与那些工业用制面包酵母菌株例如"Levuredeboulangeriebleue"(LBB)(蓝面包酵母)(Lesaffre，France)相比，这些酵母在上述培养基上的生长潜力和生产率可能很低。而且，这些菌株的遗传稳定性可能也不足以适应其工业生产。的确在一些生产中有失去Us特性的危险。最后，这些菌株几乎不能在与一种工业用面包酵母菌株能生存的千燥方式相同的传统干燥过程中存活。W093/01724还描述了一种制备含有作为发酵剂的Lts酵母的包装好的且冷载过的烤制用生面团的方法。在该方法中，通过将所说酵母至少与面粉和水混合来制备所说生面团，然后将该生面团放入到一个容器中并密封，然后在所说的生面团在保持于冷却温度的所述容器中发酵。从而获得了含有冷却生面团的密封容器，其中在该容器贮存于低温的整个过程中所述Us酵母实际上应该是失活的。但是，由于各种原因该方法不是令人满意的。首先，在打开容器过程中，由于减压可观察到生面团快速膨胀。不幸的是，这种膨胀趋于毁坏生面团的传统质地。此外，Lts酵母在稍高冷却温度即所说的8至12'C或者甚至于14'C温度下能释放太多的气体和气味，事实上在工业lt存冷却产品的常规条件下常常能观察到这种状况。从而，在贮存几个星期以后，该容器的内部压力就可能有引起容器爆炸的危险。再者，在生面团和容器的大气中存在的气味的浓度也具有攻变生面团的传统嗅味以及感观质量的危险。另外，在较低冷却温度，即所说的最高达8'C时，推测所述酵母没有释放使容器内压力急剧升高的气体，从而没有释放出气味。于是，推测这些气味主要是在生面团发酵期间产生的，发酵之后几乎没有气味产生。相应地，由于气味本性上是不稳定的，所以在贮存期间生面团也可快速地失去其感观质量。最终，在生面团发薛期间酵母被高度激活，并且简单地通过将含有这些醇母的生面团贮存于冷却温度下因而带来了酵母易失活的麻烦。的确，此后酵母具有高度活跃的发酵代谢作用。因而，在生面团的整个保存期间，促进酵母发酵的气味特性的出现，但是不要超出一定的浓度是有利的。还能消除由于容器的内部压力而强制产生的限制也是十分有利的。本发明的主题是克服了现有技术中的缺点，从而提供了一种研制具有Ui特性的工业用面包酵母菌抹的方法，以及一种制备含有所说酵母菌株的冷却的烤制用生面团的方法。为此，在研制具有Lti特性的工lk用面包醇母菌株的方法中，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒醇母菌株与至少具有一个MAL等位基因的单倍体雜酒酵母菌株进行杂交，所述等位基因是活化的但受分解代谢抑制，然后在第二阶段，将分离的后代杂交，最后，选择出一种具有Lti表现型，具有一种活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型并且具有在分枇补料发酵方法中生长的潜力的原养型二倍体菌株。在制备冷藏的包装好的烤制用生面团的方法中，通过将本发明的酵母至少与水和面粉混合来制备所述生面团，然后将该生面团包装在具有排气阀门的容器中。词语"MAL等位基因〃在本发明说明书中是指一种复合基因，该基因是编码三种功能即a—葡糖苷酶、一种透性酶和一种调节蛋白的MAL基因族的一部分。词语"活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因"是指一种MAL等位基因，其功能的表达是例如受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(称为诱导型MAL等位基因)，或是指一种MAL等位基因，其能表达其功能但它的功能本身例如受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(称为组成型MAL等位基因)。另外，词语"生长潜力"是指由工业生产上可使用的方法，尤其是由传统的面包酵母培养方法，已知称之为分批补料法(在通气条件下将糖溶液慢速地逐渐地加入到一种悬浮液中，以便避免在生物量产生期间形成乙醇并且达到最大产量)培养时具有高产量及高生产率的能力。此外，术语"原养型"是指在仅含有碳源，氮源、磷酸盐或琉，微量元素以及微量维生素的培养基上繁殖的酵母。该培养基也称为"基本培养基"。另外，词语"冷却温度"是指所有低于或等于l2'C的温度，在该温度下生面团不会冻结。最后，在其余的描述中，术语"生面团"或"烤制用生面团"是指传统的烤制用生面团，例如匹萨(pizza)生面团，面包生面团或croissant生面团。特别是这些生面团含有至少适当量的例如小麦面粉，盐类，袖和水。于是，可以研制具有在冷却温度下的生面团中失活但存活的特性甚至在更高的温度，即最高达l8'C下实际仍失活的特性的出乎意料的Lti面包酵母菌株。这些面包酵母菌株还具有更适合于工业上使用的特性。因此这些菌株具有类似于或甚至于等同于商品工业菌株例如LBB酵母的生长产率。这些菌株还出乎意料地适用于为了其保存目的而进行的干燥过程中，而在再水合后并不以显著方式失去其活性。最后，还应注意到这些菌株与其LU特性相关的令人惊奇的遗传稳定性。最终，使用制备本发明所述生面团的方法，可以避免与容器内部压力相关的所有缺陷。因而可以使用更具柔韧性的包装材料。并且，由于酵母的残留活性(所述酵母在整个保存期间产生气味但并未使生面团复活(「ise))，还由于贮存期间产生的过量气味外溢至包装之外而改善了生面团的口味。最终，在其贮存期间，生面团为气体所饱和，从而可直接烘烤该生面团，因为生面团中气体的存在足以使之在烘烤时复活。从而避开了发酵生面面的预备阶段。为了实现研制具有Lti特性的醇母菌株的本发明方法，首先将具有Lti特性的单倍体離酒醇母菌株与至少具有一个活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株杂交。为了达到该目的，可以选择一种具有良好Lti特性的单倍体酿酒醇母菌株，所述LU特性即是在例如3至1O'C之间，较好的是在10'C以上时能失活。还可以选择一种含有至少一个受分解代谢抑制的诱导型MAL等位基因的酿酒酵母菌株，所谓诱导型是指在工业培养基中栽培的该醇母其组成上并不存在Cl-葡糖苷酶。的确，这些培养基包含作为主要糖类的引起分解代谢抑制作用的糖类，例如葡萄糖和/或蔗糖。另一方面，在烤制用生面团中，仅当酵母已缺失引起分解代谢抑制的糖类时，该酵母才合成a-葡糖苷酶以便于利用生面团的麦芽糖。从而可以选择例如MAL2、MAL3或MAL6等位基因。此外，受分解代谢抑制的MAL等位基因也是组成型的，即"—葡糖苷酶天然地存在于酵母中，尽管受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制。在烤制用生面团中，仅当该酵母已缺失引起分解代谢抑制的糖类时该酵母才直接利用生面团的麦芽糖。因此可以选择例如MAL2-8c等位基因。然后使来源于首次杂交的二倍体子代在传统的孢子形成培养基上形成孢子，以获得单倍体分离子代。在该阶段，通过在包含作为唯一碳源的麦芽糖的培养基，例如YPM—琼脂培养基(见培养基部分)上培养，可以核验单倍体分离子代的Mal特性。还可以例如通过在8-10'C的冷却温度下在YPD—琼脂培养基上(见培养基部分)至少培养21天而检验单倍体分离子代的Lti特性。至少三星期后，根据没有可见的细胞生长而鉴定出存活的但仍保持相对失活状态的Lti菌落。事实上，Lti候选株没有可见细胞生长相当于亲代非Lti单倍体菌株充分生长。然后，在第二阶段，在合适培养基上相对性别的分离子代进行相互杂交。因此可将从相同的首次杂交获得的分离子代进行杂交，或将从不同的首次杂交获得的分离子代进行杂交，即是说，各自具有可能为不同亲本的，以及其亲本之一可能是相同的两个分离子代进行杂交,从而获得了具有各种各样特性的大量的二倍体酵母菌株。例如将二倍体醇母培养于基本培养基上可以检验其原养型特性。通过在例如YPM-琼脂培养基上培养也可检验Mal表现型。因而从其亲本遗传了一个或多个受分解代谢抑制的MAL基因的酵母可以利用麦芽糖，并且然后由培养基中存在的pH指示剂显示这一特性。使之在例如合适的培养基上形成孢子也可检验酵母的二倍体性状。最后，通过例如在3'C的冷却温度下将其在YPD—琼脂培养基上培养21天可检验二倍体菌株的Lti特性。在这种情况下，Lti菌株在该培养基上生长非常缓慢。结果，在这些二倍体酵母菌株中筛选出一种具有LU表现型，具有活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型以及具有在分批补料方法中的生长的潜力的原养型菌株。在该阶段，因而可选择比前面阶段所用的更严格更精确的筛选标准。从而可以通过检测菌株在例如8—14'C温度下几天之内在烤制用生面团中产生的。02量而筛选特定的Lti特性。也可以根据其在分批补料方法中的生长能力来筛选所说的二倍体菌株，即将其培养于要求酵母具有碳源呼吸代谢作用能力的培养基上从而通过使用本发明研制的方法，可以研制具有显著Lti特性的醇母菌抹。的确，对MAL基因的抑制使生面团中存在的酵母的活性延迟产生，所述生面团处于其中所述醇母又具有潜在活性的温度下。这种延迟作用实际上可由下列事实解释，即醇母在能够利用麦芽糖之前必须首先利用引起分解代谢抑制作用的糖类，并且这些糖类存在的量不足以确保醇母的最适发醇活性。另外，当Lti醇母具有诱导性的但受分解代谢抑制的MAL等位基因时，这种延迟作用甚至更大，因为事实上当酵母已经利用了引起分解代谢抑制的糖类之后，必须另外合成能具有利用麦芽糖的功能的产物,结果Ui酵母对冷藏温度以上的温度变化更不敏感。因此这些酵母可用于制备冷却保藏以后在炉子上烘烤的面包房产a因而可以制备在分批补料发酵过程中具有高于0.5克干生物量/每克糖的生长产率以及在最高达8t:温度时C02产生量低于7rai/小时/'每kg生面团，最高达12'C时COz产生量低于12ml/小时,'每kg生面团的工业用面包房能酒酵母菌株。该酵母在含有麦芽糖的培养基中培养4天后，在最高至l8'C时具有的C02产生量还低于1Onil,'每克浓缩酵母。还可以筛选例如在最高至l2'C温度时COz产生量低于3m1/小时/每kg生面团的醇母菌抹。在以上获得的各个酿酒酵母菌株中，其中两个菌株作为例子，已按布达佩斯条约规定，于34年1月28日保存于NationalCollectionofIndustrialandMarine'BacteriaLtd.(NCIMB)，P.0.Box31，135AbbeyRoad，ABERDEENAB98DG，Scotland(英国)，两菌株的保藏号为NCIMB40611和40612。菌株NCIMB40611还有下列特征一形态学为大小相对均匀的椭园形细胞。一发酵特性为能发酵蔗糖、葡萄糖和麦芽糖的酵母。同祥，菌株NCIMB40612具有下列特性一形态学为大小相对均匀的椭园形细胞。一发酵特性为能发酵蔗糖、葡萄糖和麦芽糖的酵母。在制备本发明所述的冷却的包装好的烤制用生面团的方法中，通过将本发明所说的一种酵母至少与水和面粉混合制备一种生面团，然后将该生面团包装于含有排气阀门的容器中。从而可以在冷藏温度下混合然后包装生面团。诙容器中的大气也可由一种惰性气体如氮气或二氧化碳单独组成或由其混合而成。例如通过抽真空从容器中吸出氧气，然后注入惰性气体，随后密封所说容器来制造所述大气环境。这种大气环境特别能避免真菌繁殖。具体地讲，还可以将所述酵母与生面团混合，所述酵母量为O.l-1M的浓缩或再水化酵母的干物质量。此外，这些酵母可以含有海藻糖。并且可向生面团中加入1.2—2MNaCl,以便减少天然生面团菌丛的过分繁殖。本发明所述的冷藏生面团具有用传统面包酵母发酵的并具有上面所述相同组成的生面团所特有的质地和口味。但是当后者在正常冷藏温度下保存2—60夭时优选本发明的冷藏生面团。下面列举的实施例是为了说明研制Lti菌抹的方法，制备本发明所述生面团的方法，由该研制方法获得的Ui菌株，以及由本发明制备方法得到的包装好的冷藏生面团。除非另有说明，所述百分数是指重量百分数。在描逸各个实施例之前先描述各种试验，各种培养基的组分以及附图的简要说明。试验1.生面团中C02的产生量为了实施该试验，制备用作为培养基的烤制用生面团。该生面团包含60.2%面粉，29.2%水，].4MNaCl，7.2M花生油，以及2MUi酵母(其中含15%干物质)。所有成分保存于4'C，并且在4—8匸之间制备该生面团。为此，首先将含30M干物质的几克Ui酵母悬液置于5OrolFalcon管中，并加入相同量的水，以得到含15M干物质的悬液，然后振荡整个试管而制备一种均匀酵母悬液。接着，将上述面粉和盐混合，然后加入花生袖和水，最后加入Ui酵母悬液。最后，拌合该生面团，直到不再粘滞，但不要操作过长时间。从而获得了一种光滑生面团。然后取出100克的这种生面团转移到Risograph(RDes'gn，USA)，然后立即检测放出的COz。首先在8。C每隔1小时检测放出的气体，共检测120小时。然后将温度升高到12'C,并每隔1小时检测放出的气体，共检测120小时。最后，将温度升高到3[TC，并每隔lO分钟检测放出的气体，共检测6小时。然后计箅每一温度时气体形成的起始斜率(ml/h/kg生面团)而测出酵母活性。2.生长能力该试验目的是为了筛选与工业用酵母菌株具有相似生长能力的酵母菌株。为此，将酵母菌株培养于一种培养基上，该培养基诱导与在分批补料发酵法中培养的菌株相类似的代谢作用。的确，已知在传统的分批补料发醇法中，醇母通过呼吸代谢途径同化碳源，它们很少积累或不积累乙醇或乙酸盐，并且它们还能通过呼吸途径非常快速地将乙醇或乙酸盐再同化。从而通过将其在需要酵母能完成碳源的呼吸代谢途径的培养基上培养而筛选出所需酵母。为了上述目的，将酵母培养于锥形瓶(含有促进培养基通气的挡板)中，该瓶中装有包含作为碳源的乙醇和乙酸盐的YNEA培养基。为了模拟常规的工业培养基如含有糖蜜的培养基，加入小量酵母提取物。再者，用琥珀酸盐和盐酸将培养基的PH值缓冲到4，以有利于乙酸盐以其酸形式存在。在该试验中，将检测的醇母于30'C在5ni1YPD培养基中预培养，并在30'C以约190转/分钟(「pra)的转速搅拌l2小时。然后，将1id预培养物接种到100ni1Y服培养基(装在含有挡板的500ml锥形瓶中)上，并于30f搅拌(19n「pm)培养24小时。最后，将前面的培养物接种于100mlYNEA培养基(装于含有挡板的500id锥形瓶中)，接种量为使培养液ODeoo接近于O.l,在30'C搅拌培养10小时，每隔2小时检测OD6000然后，选择具有最佳生长曲线的菌株。从而筛选起始生长速率至少相当于LBB菌株的65%,优选接近于或相当于对照LBB菌株的100M的菌株。3.分批补料培养法的产率在分批补料发酵的工业生产条件下培养选出的酵母。为此，首先将酵母于30'C振荡培养于各含有400mlYPD培养基的几个容器中，然后无菌条件下将3升前面的培养物接种于含有8升"原糖蜜"培养基(见"培养基"部分)的一个30升发酵罐(Chemap，.瑞土)。最后，根据传统分枇补料方法进行发酵，即在3O'C搅拌(250-450「pm)及增加通气量(0.02-0.8m3/小时)的条件下培养24小时，通过加入适当量的NFUOH而使PH维持在4.5，通过加入增大量的消沐剂如Contraspum210(1.5M重量/培养基体积；Binggeli-Chemie，瑞士)而控制所产生的泡沐，并且有规模地加入适当的加大量的"糖蜜"培养基，直至终体积为约22升。最终，在无菌条件下将最后发酵产物转移到一个300升发酵罐(Cheniap，瑞士)中，并且再进行一个分批补料发酵阶段，即在3(TC，搅拌(240-350rpm)和增加通气量(0.2至10m3/h)条件下培养28小时，通过加入适当量的NH4OH而使PH维持于4.5，通过加入增大量的消沫剂如Contraspum(5%重量/体积)而控制产生的泡沫，并且有规律地在26小时内加入适当的增大量的"糖蜜"培养基，直至终体积为约180升。在发醇的最后2小时内，不再进一步加入糖蜜；从而降低培养基中残留的底物量，以避免在冷藏温度下促进酵母生长的糖类的存在。最后，由此也有利于酵母中海藻糖的形成。该贮存糖对于在传统干燥过程中提高酵母的存活力是十分重要的。'下面表1描述了在30和300升发酵过程中作为时间的函数所加入的"糖蜜"培养基的量。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>然后将300升发酵罐培养物冷却到12。C,之后离心(Westfalia离心机)直至获得约2QM干物质，然后将沉淀酵母重悬于水中。然后再将该悬液离心，在这次离心期间用约300—400升无菌水/100升悬液洗涤该生物质(bioraass)。在此阶段，可加入维生素C，以便降低生物质的氧化。维生素c还具有将PH降至4.4的优点。最后，将生物质离心("DeLaval"离心机)以除去杂质，直到获得28M干物质。然后挤压(B'ikher压榨机)所说生物质直到获得34—35M干物质。从而获得浓缩的酵母。然后可测定酵母的生长产率。为此，测定获得的干生物质量，相当于发酵期间加入的糖类的量(主要是存在于糖蜜中的蔗糖)。4.遗传稳定性具有如LU特性的一种特定特征的醇母菌株的遗传稳定性是该菌株适于工业化使用的决定性因子。为了评估该稳定性，对Lti特性的回复突变型进行研究。为此，用工业分批补料方法将细胞培养物中的约10s个细胞置于含YPD培养基的1Q个培养皿上平板培养，将培养皿在8'C培养，然后，检査约4星期后此温度下产生的菌落。5.在一个温度梯度下002的产生量在为此而特别设计的仪器中进行该试验，该仪器包括例如具有不同温度的腔室的温度禅度装置，在其中可放入发酵管的底端。这些管具有封闭和有刻度的上端，以及从W面分枝出的膨胀瓶。由酵母产生的(302积累在每个管的有刻度的上端，被积累的气体置换的培养基可能进入到膨胀瓶中。为了进行该试验，将2ml在YPD培养基上培养过夜的待测菌株培养物接种于含200ml的含有0.67^的无氨基酸氮源(nitrogenbase)例如由Difco公司市售的商品名为"无氨基酸酵母氮源"的产品，如0.5何酵母提取物，2%蔗糖、1M琥珀酸钠以及调节PH至4.5的浓盐酸的第一种培养基的500id瓶中。在30'C搅拌培养24小时。通过在20'C以6000gn离心5分钟来分离细胞，并将其悬浮于含200mi的含有0.67M无氣基酸氮源，0.3%醇母提取物和0.3%蔗糖，1、琥珀酸钠和为将pH调至4.5的浓盐酸的第二种培养基的500ml瓶中。在3(TC搅拌培养24小时。在4'C，以6000gn离心5分钟而将细胞分离，用50ml蒸馏水将所得的沉淀的酵母细胞洗涤两次。将细胞悬浮于lOml蒸馏水中，并将其转移至有刻度的并预先称重的15ml聚丙烯管中。在4'C，以3000gn将其离心lO分钟。将试管中水排干，称酵母沉淀物的重量，并将其以每毫升中加入相当于具有干物质量约27M的0.5克浓缩酵母的0.61克酵母沉淀物的量悬浮到第三种培养基中，该培养基含有0.67%无氨基酸氮源，2M麦芽糖,1何琥珀酸钠和浓盐酸，以将pH调到4.5。将0.5—3迈1悬液(温度>10'C检测:)或1—3ml(温度<10'C检测)悬液加到上面描述的发酵管中。每个发酵管中预先装有5Qnil所述第三种培养基，换句话说，是含有糖蜜的培养基，并将其冷却到4'C。在所需温度以及在上面描述的温度棒度装置中培养发酵管。在将试管放入声波振荡浴中几秒钟后，在选定的时间间隔内观察生成的C02，以便使释放出的(302气泡进入液体培养基中。培养基除非另有说明，给出的化合物的百分数为重量/体积百分数。YPM-琼脂l%"DifcoBacto酵母提取物"。2%"DifcoBacto胨"。2M麦芽糖。2%"DifcoBacto琼脂"。'0.9%体积/体积(V/V)的溶解于纯乙醇中的0.4%(V/V)BromcresolRed溶液。YPD:2%"IHfcoBacto胨"。1"DifcoBacto酵母提取物"。2M葡萄糖。YPD-琼脂:含有2%"DifcoBacto胨"的YPD。YNE:0.67%"Difco无氨基酸酵母氮源"。0.5%"DifcoBacto酵母提取物"。1M琥珀酸二钠。1.12.%(V/V)5MHC1。0.7%(V./V:)乙醇。YNEA力口0.3M(V/V)冰醋酸的YNE。前糖蜜含有前糖蜜培养基的起始分批补料发酵培养基，它具有下列组分*100kg的软化水263g(，4)2,462gMgS(U8.6gNaCl197.82gCaCl217g肌醇0.84g泛酸钙0.006g生物素糖蜜84.85%无菌糖蜜(Aarberg，瑞士)。13.85%水。1%H2S04。按下列方式将糖蜜灭菌。在80'C热处理3Q分钟而诱导污染的孢子繁殖，在室温使其繁殖2Q小时，在125t:灭菌2分钟。然后冷却之后离心(Westfaia离心机)分离沉淀。附图图1:表示对于菌株NCIMB40611，40612和Hindelbank面包酵母，IOO克含有1M浓縮酵母的生面团在8。C，12'C和3ITC时产生的C02含量与时间的函数关系。图2和3:表示菌株NCIMB40612(图2)和"Uvuredeboulangeriebleue"(蓝面包酵母)(LBB，用于比较，图3)在含糖蜜培养基上产生的C02含量与温度及持续时间之间的三维函数关系图。实施例1具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株，例如具有船Ta、mal3，Its500基因型的NCIMB40613菌株用作为起始材料。该菌株按布达佩斯条约规定于94年1月28日保藏于NaUonalCollectionofIndustrialandMa「ineBacteriaLtd.(NCIMB)，P.0.Box31，135AbbeyRoad，ABERDEENAB98DG，苏格兰(英国)。将该菌株与包含活化的但受分解代谢抑制的并且是诱导型的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株，尤其是具有MATa，tn>5，ade7，ade1,MAL6基因型的NCIMB40614菌株进行杂交，该菌株已按布达佩斯条约规定于94年1月2S日保藏于上面描述的保藏机构。使二倍体酵母形成孢子，分离单倍体的孢子，然后用传统方法鉴定其性别类型，通过在S'CYPD-Agar培养基上培养鉴别其Lti表现型，在YPM-Agar培养基上培养鉴别其Mal表现型。然后将相反性别的分离子代相互杂交。然后筛选二倍体原养型酵母菌株。并也在YPM-Agar培养基上培养而检査fel表现型。最后，通过检测上面描述的烤制用生面团中菌株的COz产生量而筛选LU特性，并根据前面的"生长潜力"试验培养酵母而检测其在分批补料发醇法中的生长能力。然后选出起始生长速率大于对照LBB菌株65%的菌株。在由此获得的各种菌株中，以上面介绍的NCIMB40611菌株作为举例进行了保藏。诙菌株具有显著的Lti特性。正如在描述根据"生面团中。02产生量"试验获得的结果的图1中所看到的那样。在3和12'C之间时该菌株实际上是失活的。的确，在3-12X:温度时它的G02产生量低于3m1/h,'kg生面团。还观察到在30匸时产生的C02量快速上幵。此外，在"在温度禅度下产生的(02量"试验中获得的结果表明在最高至l8'C时在含有麦芽糖的培养基中培养12天之后，该菌株不释放任何气体。另外，该菌株的起始生长速率相当于LBB酵母的66%，并且在根据前面描述的检测法，该菌株在分批补料方法中的生长产率相当于以同样方式测出的LBB菌株的生长产率，就是说0.5g千生物量/每克糖o最后，根据上面描述的对遗传稚定性的检测未发现回复突变型。因而该菌株实际上是稳定的。实施例2以具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株，例如具有MATa、脑13,Its500基因型的NCIMB40613菌株作为起始材料。该菌株已根据布达佩斯条约于94年1月28日保紫于NationalCollectionofIndustrialandMarineBacteriaLtd.(NCIMB),P.0.Box3],135AbbeyRoad,ABERDEENAB98DG，苏格兰(英国)。将该菌株与包含活化的但受分解代谢抑制并且是组成型的Mal等位基因的单倍体酿酒酵母菌株，尤其是具有MATa,leu2,trpl，ura3,MAL2-8c,MAL3基因型的NCIMB40615菌株进行杂交，NCIMB觀5菌抹已按布达慨斯条约于94年1月28日进行保蒹。使双倍体形成孢子，然后将分离子代杂交，按与实施例l同样的方式筛选菌株。在由此获得的各个菌株中，作为举例寄存了上面介绍的KCIMB40612菌株。NCIMB40612于1995年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM95006。正如在描述根据"生面团中产生的。02量"试验中获得的结果的图l中所看出的那祥，实际上在3至12'C之间时该菌株是失活的。的确，在3-8'C温度时其C02产生量低于7m1/h/kg生面团。在至少l2'C时C02产生量低于l2rol/h/kg生面团，并且还观察到在30'C时产生的COz含量快速上升。此外，正如在描述由"在温度梯度下C02生成量"试验获得的结果的图2中所看到的那样，该菌株还在含有麦芽糖的培养基中培养4天之后，在最髙至l8t!时其COz的生成量为每克浓缩酵母低于1Oml。作为比较，还将对照LBB菌株也进行了该试验(图3)。另外，该菌株的起始生长速率相当于LBB酵母的90%，并且根据前面描述的试验其在分枇补料方法中的生长产率相当于按同样方法测出的LBB菌株的生长产率，即每克培养基中产生0.5g干生物量最后，根据上面描述的遗传稳定性检测试验没有发现回复突变型因而该菌株实际上是稳定的。实施例3按下面方式将Lti面包酵母干燥以便能够以粉末形式将其保存较长时间。使用包含约2(]外干物质并且经离心和洗涤过的NCIMB40612菌株的培养物。然后例如按美国专利4，358，250中描述的传统方法将酵母干燥。从而获得了包含96M干物质的干酵母粉。然后按下面方式将这些醇母再水合。在30'C将10%干酵母加到90%水中。然后温和地混合20分钟，最后，在4'C加入一定量的水从而获得了具有所需干物质量的酵母悬液。可以看到经脱水，然后再水合的酵母完全保存其发醇活性。实施例4制备包含浓缩酵母菌株NCIMB40612的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。为此，按前面描述方法将NCIMB40612酵母的浓缩的新鲜培养物用于"分批补料培养产率"检测试验。然后将一定量的所述浓缩酵母(包含约35M干物质)与面粉、水、脂肪和盐混合，从而得到包含0.2.!M浓缩醇母干物质，60何面粉，30%水，8%人造奶油和1.8MNaCl的生面团。然后以与在欧洲专利EP0，158，590中描述的相同方式将该生面团包装，不同之处在于不能透过空气的塑料包装物包含有一个排气阀门，即是说，一个阀门允许气体从包装物的内部溢出到外部，并且阻止空气从包装物外界流进其内部。此外，该包装物的内部大气还包含50M氮气和50%二氧化碳。实施例5制备包含再水合的酵母菌株NCIMB40612的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。使用包含l0M干物质的实施例3所述的再水合NCIMB40612酵母悬液。由此制备包含0.3%再水合酵母干物质，6QM面粉，30%水，8M人造奶袖和1.7MNaCl的生面团。于是按与实施例4所述的相同方式包装该生面团。实施例6使用在冷藏温度下保存了一天的实施例4的生面团，然后将该生面团在22(TC直接烘烤约15分钟。另外，以与上述同样方式分别将冷藏保存7天、28天和60天的实施例4的生面团烘烤。最后，为了比较，制备具有与实施例4所述的相同组分的生面团，唯一不同之处是加入传统面包酵母以替代Ui酵母。将该生面团在室温下发酵45天，然后在与上述同样条件下烘烤该生面团。三种分别保存了7天、28天和60天的经烘烤的生面团具有与按上述传统方式用酵母发酵的生面团非常相似的口味及质地。另一方面，保存了1天的经烘烤的生面团具有的口味及质地与按传统方法用酵母发酵的生面团有一些差异。这可以用下列事实解释，在保存的第一天过程中，Lti酵母还没有产生使生面团十分相似于传统生面团的足量的气味和气体。权利要求1.制备具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其特征在于，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株进行杂交，然后在第二阶段，将分离子代进行杂交，并且最后，选出具有Lti表现型、活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型，和在分批补料方法中具生长能力的原养型二倍体菌株。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在第二阶段，将各自来自于不同的第一杂交组合的分离子代进行杂交。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在酵母中，活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因可以是组成型的或诱导型的。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为检测所要选择的所述二倍体菌株的Lti特性，将其在3至3O'C之间的温度下检测几天内烤制用生面团中产生的COz量。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测所要选择的所述二倍体菌株在分批补料方法中的生长能力，是在需要碳源呼吸代谢的一种培养基中进行的。6.工业用面包酵母菌株酿酒酵母，它在分批补料方法中的生长产率大于0.5克干生物量/每克糖，在最高达S'C时C02产生量低于7ml/h/ks生面团，在最高达12'C时COz产生量低于12nd/h/kg生面团，并且在含有麦芽糖的培养基中培养4天后，在最高达18'C温度时C02产生量还低于1Qml/每克浓缩酵母。7.根据权利要求6所述的菌抹，其特征在于，在最高达12'C时它具有低于3ml/h/kg生面团的COz生产量。8.选自权利要求6的酿酒酵母菌株NCIMB40612以及权利要求7的NCIMB40611的工业用面包酵母菌株。9.权利要求1一8中任何一项所述的工业用面包酵母菌株用于制备在冷藏保存后在炉子中烘烤的面包房产品的应用。10.制备经冷藏的并经包装好的烤制用生面团的方法，其中所述生面团制备如下，即通过将权利要求19中任何一项所述的酵母至少与水和面粉混合，然后将该生面团包装于有排气阀门的容器中。11.根据权利要求lQ所述的制备方法，其特征在于，将所述生面团在冷载温度下混合并然后进行包装。12,根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将生面团在包含氮气或二氧化碳或其两者的混合物的大气中包装。13.根据权利要求1Q所述的制备方法，其特征在于，将酵母以0.1—1%干物质量的浓缩或再水合酵母的量与生面团混合。14.根据权利要求lO所述的制备方法，其特征在于，所述酵母含有海菜糖。15.根据权利要求lQ所述的制备方法，其特征在于，向所述生面团中加入1.2至2%的NaCl。16.根据权利要求10—15中任何一项所述的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。17.根据权利要求lS的烤制用生面团，其特征在于，将其于冷藏温度下保存至少1天。全文摘要制备具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其中首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株杂交，然后在第二阶段，将分离子代进行杂交，最后，选出具Lti表现型、活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型以及具有在分批补料方法中具生长能力的原养型二倍体菌株。将所研制的菌株用于一种制备冷藏的经包装好的烤制用生面团的方法中，其中将该Lti酵母至少与水和面粉混合，然后将该生面团包装于含有排气阀门的容器中。文档编号C12N1/19GK101343617SQ200810001450公开日2009年1月14日申请日期1995年3月16日优先权日1994年3月16日发明者C·吉斯勒,J·巴恩什,P·尼德堡格申请人:雀巢制品公司