用于基因转移的病毒包膜载体的制作方法

专利名称：用于基因转移的病毒包膜载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外和体内基因转移的安全、高效载体。具体地， 本发明涉及通过使用病毒或灭活的病毒，尤其灭活的HVJ(仙台病毒)所制备 的基因转移载体。而且，本发明所述基因转移载体还可用于基因治疗和大 规模(high throughput)筛查。
背景技术：
现已开发了多种旨在用于基因治疗的病毒性和非病毒性(合成的)基因 转移方法(Mulligan，科学，260， 926-932 (1993)和Ledley,人类基因治疗， 第6巻，1129-1144(1995))。 一般而言，病毒方法比非病毒方法能更有效地 将基因转移至细胞中。但病毒载体由于同时引入了亲代病毒的基本基因元 件，以及病毒基因的渗漏表达，免疫原性，和对宿主基因组结构的修饰， 使得它存在安全性方面的考虑。非病毒载体一般具有较少的细胞毒活性和 较小的免疫原性。但大多数非病毒方法的基因转移效率(尤其在体内)低于某 些病毒载体。
因此，病毒载体和非病毒载体都既有限制又有优点。因此必须开发体 内应用的高效、低毒性基因转移载体，以便弥补其中一类载体系统的限制 又具有另 一 类系统的优点。
另一方面，HVJ具有较高免疫原性，且已知可诱导CTL，特别是当产 生大量NP蛋白时(Cole，G.A.等，免疫学杂志158， 4301-4309(1997))。也有 人担心宿主的蛋白质合成可能被抑制。
HVJ还有一个问题,当使病毒融合蛋白经离心或柱操作而纯化以便在脂 质膜上重建时，所产生的颗粒可能由于重建而失去病毒的其它蛋白(主要是M蛋白),从而使要求融合活性的Fl与HN蛋白间的比率不能维持在与野生 型病毒相同的水平,导致较低融合活性。此外,由于融合蛋白在重建时插入脂 质膜的方向不必与在野生型中 一样，故可提呈某些未知抗原。
另有人报道了 一种通过添加新的分子而实施重建的方法(Uchida, T.等， 细胞生物学杂志80， 10-20, 1979)。但该方法存在失去原有病毒功能的高度 危险，因为合成颗粒的膜组分本质上不同于天然病毒颗粒的膜组分。
涉及将基因或蛋白包入脂质体并将其与灭活的HVJ融合而产生融合颗 粒(如在传统HVJ-脂质体中 一样)的方法已能将非侵袭性或非毒性基因转移 至培养的细胞或体内组织中。该项技术在世界各地频繁用于动物试验中 (Dzau, V. J.等，美国国家科学院学报，93, 11421-11425 (1996)和Kaneda, Y. 等，今日分子医学，5, 298-303(1999))。但已有人发现该项技术的缺陷例 如，由于须制备两种不同载体，即病毒和脂质体，该方法可能比较复杂； 由于与脂质体融合而致使平均直径比病毒颗粒大1.3倍的那些颗粒，它们的
融合活性为病毒的10%或更低。此外，就某些组织而言，基于传统HVJ的载体可能不能获得任何基因 转移，或如果可以，效率也极低。这表明，根据传统方法可用于基因治疗 的组织很有限。
有需要开发一种用于人类基因治疗的病毒性载体，其可安全、高效、 并简单地制备，还能将基因转移至广泛多种体内组织中。
因此，本发明的一个目标是开发一种安全、高效、且简单的基于病毒 的基因转移载体，其可应用于广泛多种培养细胞或体内组织，它克服了传 统重建型HVJ载体方法或HVJ-脂质体方法的缺点。
发明公开
在本发明的一个方面中，提供一种安全、高效的利用灭活病毒的基因 转移载体。灭活病毒(其中病毒的基因组已被灭活)不能复制病毒蛋白，因此
比较安全并具有低细胞毒性和低抗原性。通过将基因包入病毒包膜载体这 种利用灭活病毒的基因转移载体，可制备一种安全、高效、且简单的用于 培养细胞或体内组织的基因转移载体。
在本发明另 一方面中，提供一种能将基因转移至很多种体内组织中的 病毒包膜载体。在一个实施方案中，所用病毒是HVJ。可利用本发明之病毒包膜载体获得体内基因转移的组织的实例有，但不限于肝脏、骨胳肌、
子宫、脑、眼、颈动脉、皮肤、血管、肺、心脏、肾脏、脾脏、癌组织、
神经、B淋巴细胞、以及呼吸道组织。
在本发明另 一方面中，提供简单实现(realizing)向悬浮细胞的基因转移 的方法。利用本发明病毒包膜载体向悬浮细胞实施基因转移的优选方法实 例包括，在有硫酸鱼精蛋白的条件下使悬浮细胞与病毒包膜载体混合，并 使混合物离心的基因转移方法。
在本发明另一方面中，通过利用本发明的能在短时间内包容大量基因 的基因转移载体实现向培养细胞和体内组织中高效且快速的基因转移。因 此，在本发明另一方面中，利用本发明基因转移载体建立对基因组的高流 通量、快速质量分析系统。
在本发明另 一方面中，基因转移载体可长期以冷冻状态贮存于-20。C 。 例如，可将该基因转移载体以冷冻状态密封、贮存、并运输。
本发明另 一方面提供一种基因转移载体，其对优选70 %或更多的细胞， 更优选80%或更多的细胞，还更优选对90%或更多的细胞，最优选对95 %或更多的细胞具有体外基因转移活性。
本发明一个特定方面提供一种基因转移载体，当灭活病毒制备成功的2 个月后，产生病毒包膜载体作为基因转移载体时，可维持基因转移活性的 60%或更多，优选70%或更多，更优选80%或更多，最优选90%或更多。
本发明另一方面提供一种基因转移载体，当体内局部给与时，其对优 选30 %或更多的组织中细胞，更优选40 %或更多的组织中细胞，还更优选 50%或更多的组织中细胞，最优选60%或更多的组织中细胞具有基因转移 活性。
本发明的一方面提供一种含有灭活病毒的包膜的基因转移载体。 本发明的一方面中，用于制备基因转移载体的病毒可以是野生型病毒 或重组型病毒。
本发明又一方面中，所用病毒属于逆转录病毒科(Retroviridae)、披膜病 毒牙牛(Togaviridae)、 冠讶犬病毒牙牛(Coronaviridae)、 黄病毒牙牛(Flaviridae)、 副粘 病毒科(Paramyxoviridae)、 正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、 布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)、弹^犬病毒3牛(Rhabdoviridae)、痘病毒牙牛(Poxviridae)、疱渗病 毒科(Herpesviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、以及嗜肝DNA病毒科(Hepdnaviridae)。本发明一个具体方面中，所用病毒为HVJ。在本发明另一 方面中，用Hasan， M.K.等(普通病毒学杂志,78， 2813- 2820 (1997))或 Yonemitsu， Y.等(自然生物技术学(Nature Biotechnology) 18, 970-973 (2000))
所述重组仙台病毒制备基因转移载体。
本发明另一方面提供能向动物体内组织实施基因转移的基因转移载体。
在制备本发明基因转移载体的方法中，不必灭活病毒。因此，本发明 一个方面中，可在不进行灭活病毒的步骤的前提下，利用含以下步骤的方 法制备基因转移载体
1) 使病毒与外源基因混合，和
2) 冻融该混合物，或进一步使该混合物与一种表面活性剂混合。 本发明另一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方
法，该方法包括以下步骤 灭活病毒，
使该灭活的病毒与外源基因混合，和 冻融该混合物。
本发明又一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方 法，该方法包括以下步骤 灭活病毒，和
使该灭活的病毒与外源基因在有表面活性剂存在的情况下混合。 在本发明另一方面中，所用表面活性剂选自辛基葡糖苷、Triton-X100、 CHAPS和NP-復
本发明一个具体方面提供制备灭活型病毒包膜载体的方法，该方法还 包括在外源基因与灭活病毒的包膜混合之前，向外源基因中添加硫酸鱼精 蛋白的步骤。
本发明另 一方面提供将基因导入分离的动物组织中的方法，该方法包 括以下步骤
制备含所需基因的基因转移载体，和 通过基因转移载体将基因导入动物组织。
本发明另 一 方面提供将外源基因导入悬浮细胞的方法，该方法包括以 下步骤使悬浮细胞与基因转移载体在有硫酸鱼精蛋白存在的情况下混合，和 离心该混合物。
本发明还有一方面提供含本发明基因转移载体的用于基因治疗的药用 组合物。
更具体地，本发明涉及
1. 含有病毒包膜的基因转移载体。
2. 项l的基因转移载体，所述病毒衍生自野生型病毒或重组病毒。
3. 项1或2的基因转移载体，所述病毒衍生自属于逆转录病毒科、披 膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病 毒科、弹状病毒科、痘病毒科、疱渗病毒科、杆状病毒科和嗜肝DNA病毒 科的病毒。
4. 项3的基因转移载体，所述病毒是HVJ。
5. 项1-4之一的基因转移载体，其利用含以下步骤的方法来制备将 所述病毒与一种外源基因混合；和将该混合液冷冻和解冻2次或更多次。
6. 项1-4之一的基因转移载体，其利用以下方法来制备，所述方法包 括将该病毒与一种外源基因在有表面活性剂存在时进行混合的步骤。
7. 项5或6的基因转移载体，所述方法还包括灭活所述病毒的步骤。
8. 项7的基因转移载体，其中所述表面活性剂选自辛基葡糖苷、 Triton-X100、 CHAPS和NP-40。
9. 项8的基因转移载体，其中所述表面活性剂是辛基葡糖苷。
10. 项l-9之一的基因转移载体，其中所述方法还包括将硫酸鱼精蛋白 添加至所述外源基因的步骤。
11. 项l-10之一的基因转移载体，其用于将基因导入动物体内组织中。
12. 项11的基因转移载体，其中所述组织选自肝脏、骨骼肌、子宫、 脑、目艮、颈动脉、皮肤、血管、肺、心脏、肾脏、脾脏、癌组织、神经、B 淋巴细胞、以及呼吸系统的组织。
13. 用于基因治疗的药用组合物，其包含项l-12之一的基因转移载体。
14. 用于筛选基因文库的试剂盒，其包含项l-12之一的基因转移载体。
15. 制备基因转移载体的方法，所述载体包含用于基因转移的病毒包 膜，所述方法包括以下步骤将所述病毒与外源基因混合；和将该混合液 冷冻和解冻2次或更多次。16. 制备基因转移载体的方法，所述载体括包含用于基因转移的病毒包
膜，所述方法包括以下步骤将所述病毒与一种外源基因在有表面活性剂 存在的情况下混合。
17. 项15或16的方法，进一步包括灭活所述病毒的步骤。
18. 将基因导入分离的动物组织中的方法，该方法包括以下步骤 制备如项l-12之一的基因转移载体，该载体含有所需的外源基因；和 通过该基因转移载体将基因导入分离的动物组织。
19. 将外源基因导入悬浮细胞的方法，该方法包括以下步骤将所述悬 浮细胞与项1-12之一的基因转移载体在有硫酸鱼精蛋白存在的情况下混 合；和离心该混合液。


图l显示，多次冻融HVJ包膜载体并转染培养的细胞后，外源基因(萤 光素酶基因)表达水平(安光素酶活性)的测量结果。
图2显示，当培养的细胞被转染后，萤光素酶活性的测量结果，确保 使用相同数量的病毒来制备添加至培养的细胞中的HVJ包膜载体。
图3显示，当HVJ包膜载体中使用各种量的外源基因(萤光素酶表达载 体)时，萤光素酶活性的测量结果。
图4显示，当使用各类緩沖液制备HVJ包膜载体时，萤光素酶活性的 测量结果。
图5显示用传统基因转移载体、灭活型HVJ-脂质体以及本发明的方法 进行基因转移的结果比较。
图6图示利用表面活性剂的情况下，制备灭活的HVJ包膜载体的方法。 图7示用表面活性剂制备的HVJ包膜载体中所含蛋白的SDS-PAGE模式。
图8是HVJ包膜载体的显微电镜负染图，其显示(l)未处理的HVJ; (2) 不含DNA但接受了辛基葡糖苷处理的HVJ;和(3)含DNA并接受了辛基葡 糖苷处理的HVJ。
图9A-9C显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性 取自辛基葡糖苷的不同浓度；辛基葡糖苷对HVJ的不同处理时间；是否进 行超声(声)处理；以及所用载体的不同大小，如图所示。图IOA和IOB显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶 活性取自硫酸鱼精蛋白(PS)的如图所示不同浓度和不同转染时间。
图IIA和IIB显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶 活性取自图示的不同DNA量(实验中所用量)，以及不同贮存温度。
图12显示以螢光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自 用各种HAU滴度的HVJ制备HVJ包膜载体并将其用于基因转移的情况， 如图所示。
图13A显示如图所示的不同UV辐射量下，以萤光素酶活性水平表示 的基因转移效力。
图13B显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取 自图中所示的不同(3-丙醇酸内酯(BPL)浓度。
图14显示对人的舌上扁平上皮癌(SAS)的以萤光素酶活性水平表示的 基因转移效力，所述酶活性取自图中硫酸鱼精蛋白的不同浓度和转染保温 的不同时间。
图15显示对人的主动脉内皮细胞(HAEC)的以萤光素酶活性水平表示 的基因转移效力，所述酶活性取自图中硫酸鱼精蛋白的不同浓度和转染保 温的不同时间。
图16A显示对小鼠肝脏的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力， 所述酶活性通过利用本发明的HVJ包膜载体或HVJ-AVE(人工病毒包膜)月旨
质体获得。
图16B显示对小鼠子宫的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力， 所述酶活性通过利用本发明的HVJ包膜载体或HVJ-AVE(人工病毒包膜)月旨
质体获得。
图16C显示用本发明的HVJ包膜载体向小鼠子宫实施pEB-CMV-LacZ 基因转移后，对子宫组织的LacZ染色结果。通过LacZ染色可见，LacZ基 因的表达主要在子宫内膜的腺上皮中。
图16D显示，将含有pEGFP-l(10，000 HAU)的HVJ包膜载体经小脑延 髓池或经颈动脉给药至SD大鼠(雄性，体重300-400g)的结果。给药的3-4 天后，处死大鼠，制备活组织切片(live section),在荧光显微镜下进行观察。
①经小脑延髓池给药
经证实基因已导入脑表面。另一方面又证实没有向脑的深部进行基因转移。还证实，没有向脉络丛中进行基因转移。 ②，③经颈动脉给药
在左侧(即给药处)证实有显著高表达。在脑内表面部分、基底核部、以 及另一脑的脑表面均证实有表达。在另一脑的脑表面的表达^^皮认为已通过
侧流(collateral)传(flow)向另 一侧。
图16E显示pCMV-NK4对VEGF-诱导型血管生成的剂量依赖性抑制作 用，所述载体能表达一种HGF突变体，该突变体可抑制HGF的功能。
图16F显示通过向气管注射HVJ包膜载体而实施的基因转移的结果。
图17A和17B显示将寡核苷酸导入细胞后，第二天在焚光显微镜下观 察到的细胞荧光结果。保温IO分钟后获得约10%的寡核苷酸导入效力(图 HB)，而保温60分钟后寡核芬酸已导入80%或更多的细胞中(图HA)。
图18显示在人的白血病细胞系CCRF-CEM， NALM-6，和K-562中的 导入实验的结果。 ，
当使用脂质体或存在脂质体试剂(Gibco BRL的Lipofectamine、 lipofectin 等)时，这些细胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)显示极低的导入效力。
加入600-1 ，000 n g/ml硫酸鱼精蛋白，于20。C以10,000 rpm或15,000 rpm 离心IO分钟，即可获得高萤光素酶活性。未观察到与HVJ包膜载体相关的 显著细胞毒活性。硫酸鱼精蛋白的离心和添加是基因转移所必需的。
图19显示癌组织的基因转移结果。在癌组织的肿瘤实体中观察到基因 表达。尤其，用500 Mg/ml硫酸鱼精蛋白获得了较高的基因转移活性。另一 方面，在较低硫酸鱼精蛋白浓度下未检测到基因表达。
图20显示用疱渗病毒包膜载体将基因转移至细胞的结果。尽管总萤光 素酶活性低，但已确定，用Triton-X10处理5分钟可获得具有最高导入效 力的载体。 一种未利用硫酸鱼精蛋白的制备方法具有高导入效力。所有样 品经形态学观察均未见任何细胞毒性。
图21显示用贮存于-80。C的疱渗病毒包膜载体将基因转移至细胞的结 果。用添加了 10%血清的培养基所获导入效力高于用无血清培养基所获。 用200m1载体溶液(估计量2.8x 107病毒颗粒/孔)所获基因转移活性高于 用100 m 1载体溶液(估计量1.4 x 107病毒颗粒/孔)所获。
实施本发明的最佳模式(定义)
本文中"基因转移"指将天然、合成、或重组的所需基因或基因片段(体 外或体内)导入靶细胞，其导入方式可使所导入的基因维持其功能。本发明
将被导入的基因或基因片段包括DNA、 RNA、或任何核酸(DNA或RNA的 具有特定序列的合成类似物)。本说明书中，术语"基因转移"、和"转染" 可互换使用。
本文中"基因转移载体"、"基因载体"或"病毒包膜载体"指通过在 病毒包膜中包含外源基因而获得的载体。用于制备基因转移载体的病毒可 以是野生型病毒或重组型病毒。
本发明的一个方面中，所用病毒属于逆转录病毒科、披膜病毒科、冠 讶犬病毒-4"、黄病毒牙+、副粘病毒-牛、正粘病毒牙牛、布尼亚病毒牙牛、弹^l犬病 毒科、痘病毒科、疱渗病毒科、杆状病毒科、以及嗜肝DNA病毒科。本发 明一个具体方面中，所用病毒为HVJ。
本文中"基因转移活性"指载体的"基因转移"活性，其可利用所导 入的基因的功能(如果是表达载体，则是所编码蛋白的表达和/或该蛋白的活
性等)作为指标来检测。
本文中"灭活的"用于指基因组已被灭活的病毒。灭活病毒具有复制 缺陷。优选，灭活可通过UV处理或用烷基化试剂处理来获得。
本文中"外源基因"指包含在基因转移载体中的任何核酸序列，但该 核酸序列并非病毒来源。本发明的一个方面中，将外源基因可搡作连接至 使被基因转移载体导入的基因能表达的适当调节序列(如转录所必需的启动 子、增强子、终止子、polyA加尾信号，以及翻译所必需的核糖体结合位点、 起始密码子、终止信号等)。本发明另一方面中，外源基因不包括用于该外 源基因表达的任何调节序列。本发明还一方面中，外源基因为寡核苷酸或 i秀S烏(;decoy:)核酸。
包含在基因转移载体中的外源基因主要是DNA或RNA核酸分子，但 所导入的核酸分子可包括核酸类似物分子。基因转移载体中所含分子种类 可以是一种，也可以是多种不同基因分子。
本文中"基因文库，，指含有自然界分离的或人工合成的核酸序列的核 酸文库。核酸序列的自然来源包括真核生物、原核生物、或病毒的基因组 序列或cDNA序列，但不限于此。通过向自然界分离的序列中加入任意序列(如信号或标记)而获得的文库也包括在本发明的基因文库中。在一个实施 方案中，基因文库包含诸如导致其中所含核酸序列转录和/或翻译的启动子 等序列。
本文中，"HVJ"和"仙台病毒"可互换使用。
本文中，"HAU，，指可凝集鸡红细胞的0.5 %的病毒活性水平。一个HAU 相当于约24，000，000个病毒颗粒(Okada， Y.等，Biken Journal 4, 209 - 213, 1961)。
(基因治疗)
治疗性核酸构建物可利用本发明的基因转移载体而局部或全身性给 药。当这类核酸构建物包括蛋白的编码序列时，该蛋白的表达可利用内源 性哺乳动物启动子或外源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成型的或 可以调节。
当本发明的基因转移载体被作为基因治疗的組合物使用时，本发明载 体的给与，可通过将载体的PBS(磷酸盐緩冲液)、盐水等悬浮液直接注射至 局部位点(如癌组织内部、肝内、肌肉内和脑内)，或经由其脉管(如动脉内、 静脉内或门静脉内)给与。
在一个实施方案中，基因转移载体通常是将单位注射剂型(溶液、悬浮 液、或乳液)的基因转移载体与可药用载体(即在所用剂量和浓度下对受体无 毒性且能与制剂中其它成分相容的物质)混合而配制成。例如，制剂优选不 包括氧化剂以及已知对基因转移载体有害的其它化合物。
可药用载体最好包含少量添加剂如增强渗透性和化学稳定性的物质。
这些物质在所用剂量和浓度下对受体无毒性，且包括緩冲液如磷酸盐、柠 檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、及其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂如抗坏血 酸；小分子多肽(约不到IO个残基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白质(如血清 清蛋白、明胶、或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡硌烷酮)；氨基 酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸)；单糖、二糖、及其它碳水化 合物(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精)；螯合剂(如EDTA); 糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；反离子(如钠)；和/或非离子表面活性剂(如聚 山梨酯(polysorbate)或聚羟亚烃(polyxamer)),或PEG 。
含基因转移载体的药用组合物通常以水溶液形式保存在单剂型或多剂 型的容器，如密封的安瓿瓶或小瓶中。本发明还提供一种药剂包装或试剂盒，其包括一或多个容器，其中装 载本发明药用组合物的一或多种成分。此外，本发明的多肽可与其它治疗 性化合物一起使用。
含有本发明基因转移载体的药用组合物可根据医疗实践进行配制和用 量，应考虑患者个人的临床状况(如需预防或治疗的状况)、含基因转移载体 的组合物的运送位点、耙组织、给药方法、给药时间表、以及本领域纟支术 人员已知的其它因素。因此，本说明书中描述的基因转移载体的"有效量，， 或适当剂量可根据上述考虑而定。
例如，将本发明的基因转移载体给药至小鼠时，每只小鼠可给与相当
于20-20,000 HAU、优选60-60,000 HAU、更优选200-2,000 HAU的基因载 体。所给与的基因载体中外源基因的含量为0.1-100昭，优选0.3-30昭，更 优选l-10iig/小鼠。
如果将本发明的基因载体给药至人，每人可给与相当于400-400,000 HAU、优选1,200-120,000 HAU、更优选4,000-40,000 HAU的基因载体。所 给与的基因载体中外源基因的含量为2-2，000吗，优选6-600吗，更优选 20-200吗/人。
以下实施例旨在举例说明本发明，并非限制。
实施例
1.基因转移载体的利用冻融法的制备，以及其应用 (实施例1:利用冻融法制备HVJ包膜载体)
用萤光素酶基因作为外源基因。将重组HVJ病毒冻融多次后，将该基 因导入培养的细胞中。
将500|il TE、 750吗萤光素酶表达载体pcOriPLuc (Saeki和Kaneda等， 人类基因治疗，11， 471-479 (2000))与各种浓度的HVJ病毒混合。将HVJ 病毒的浓度调整至10、 25、 50、或100 HAU/pl。将该溶液分为12等份， 每份均保存在4。C，用干冰冷冻然后解冻；如此重复最多达30次。将已冻 融了指定次数的溶液加入BHK-21细胞中(24孔板，4乂104细胞/板，0.5 ml DMEM, 10%FCS)。使细胞与5%(:02在37。C反应20分钟后，纟田胞用PBS 洗涤，然后再加入0.5 ml培养液，培养24小时。
除去培养基。向细胞中加入500|il 1 x细胞培养物裂解试剂(Promega)以裂解细胞，将该溶液置于微量离心管中，离心。用Promega萤光素酶分 析系统和Lumat LB9501发光仪(Luminophotometer)测定20jil所得上清的萤 光素酶活性。每种溶液测三次，取平均值。
结果见图1。萤光素酶活性随着重组HVJ病毒冻融次数的增加而增加。 冻融20次时的安光素酶表达10倍或更多倍于冻融三次的观察结果。这些 结果证实，在本实施例所用条件下，重组HVJ病毒的冻融次数优选为5次 以上，更优选约15-约20次。
(实施例2:经冻融制备的HVJ包膜载体的基因转移效力)
将类似于实施例1所用的重组HVJ病毒冻融30次后，在确保将相同量 病毒加入到宿主细胞的前提下，检查向细胞内转移基因的效力。
结果见图2。图2中，在X轴的500 HAU处，具有10 HAU/pl病毒浓 度的溶液的加入量为5(^1,而100 HAU/pl溶液的加入量为5(il。如图2所 示，具有100HAU/V1病毒浓度的溶液的基因表达效力与具有10-50 HAU/pl 病毒浓度的溶液相比减少约50%。该结果表明，在本实施例的条件下，重 组病毒的浓度优选为10-50 HAU4d。
此外，将重组HVJ病毒冻融29次后，第30次实施冷冻，然后将该HVJ 病毒溶液以此冷冻状态保存一周，然后冻融，加至细胞中。结果，在冷冻 状态下保存了 一周的重组HVJ病毒也显示与经受了连续30次冻融的病毒相 同的萤光素酶基因表达水平。
(实施例3:测定用安光素酶表达基因进行的基因转移效力)
利用不同量的营光素酶表达载体制备HVJ包膜载体，检查向宿主细胞 的基因转移效力。
HVJ病毒的量为50 HAU/|il TE。安光素酶表达载体pcOriPLus的量为 0.05， 0.1， 0.25, 0.5， 1.0， 1.5, 2.0, 3.0,或5.5 ^ig/^il TE。冻融20次，将所述溶 液的终体积调整至ioow，然后用如实施例1所述相同的方法测定萤光素酶活性。
结果见图3。以表达载体pcOriPLuc(约9.5kb)为外源基因，随着它的添 加，其表达量以剂量依赖的方式增加，直至添加量达1.5(ig;随后，表达量 几乎不再有变化。该结果证实，在本实施例的条件下，优选用1.5ng/pl或更 多的外源基因DNA进行基因转移。
(实施例4:緩冲液类型对基因转移效力的影响)用不同类型的緩沖液制备HVJ包膜载体，检查向宿主细胞实施基因转 移的效力。
HVJ病毒的量为50 HAU/pl緩沖液。萤光素酶表达载体pcOriPLuc的 量为15吗/Vl。所用緩冲液为TE、PBS、或BSS(137mMNaCl， 5.4mMKCl， 10 mM Tris-HCl， pH7.5)、或向这些緩冲液中添加蔗糖至终浓度为0 mM， 20 mM, 40mM,或60mM。冻融20次，将所述溶液的终体积调整至100^1，然后用 如实施例1所述相同的方法测定萤光素酶活性。
结果见图4，其证实，在本实施例的条件下，优选只使用TE作为制备 重组HVJ病毒的緩冲液。
(实施例5: AVE(人工病毒包膜)型载体和本发明之HVJ包膜栽体的比
较)
利用灭活的HVJ脂质体(具有最佳基因转移效力的AVE型(Saeki，Y.等， 人类基因治疗，8， 2133-2141 (1997)))这种传统基因转移载体进行的基因转 移，与本发明的基因转移方法进行比较。
HVJ脂质体或HVJ病毒的量为50 HAU/pl TE，营光素酶表达载体 pcOriPLuc的量为1.5^ig/|il。重组HVJ病毒的冻融次数为2次或15次。其 它条件与实施例1中的相同，不同的是用人胚肾细胞系HEK293作为宿主 细胞。
结果见图5。其证实，本发明中将HVJ包膜载体重复冻融15次的方法 比用HVJ脂质体进行的传统基因转移方法的基因转移效力高很多。 (实施例6:合成寡核苷酸的导入效力)
将已用FITC(异硫氰酸焚光素)标记的合成寡核苷酸(20bp)以1 mg/ml的 浓度与灭活的HVJ病毒混合。将该溶液冻融20次后，使之与BHK-21细胞 反应20分钟。17小时后观察焚光信号。结果，几乎在100%的细胞的细胞 核中观察到焚光信号。该结果表明，本发明的方法也可有效用于将合成的 核酸导入细胞。
(实施例7: GFP基因的导入效力)
将GFP(绿色荧光蛋白)基因与灭活的HVJ病毒的混合溶液冻融20次 后，将2ng-5jul该混合液注射至大鼠大脑。结果在注射部位观察到荧光信 号。此外，将利用了 GFP基因的HVJ包膜载体冻存3个月，然后注射至大 鼠大脑。同样，在注射部位观察到因GFP基因表达而产生的荧光信号。以上结果表明，本发明的方法确实能实现基因的体内转移。此外，还
证实HVJ包膜载体的冷冻保存是可能的。
2.基因转移载体的利用表面活性剂的制备，以及其应用 (实施例8:利用表面活性剂制备灭活的HVJ包膜栽体)
利用表面活性剂制备灭活的HVJ包膜载体的方法图示于图6。 (1: HVJ的培养)
通常可将HVJ种子病毒接种在受精的鸡胚中以便进行培养。但也可利 用培养的细胞(如猴或人)或持续感染系统(即一种培养液，其中已将一种水 解酶如胰蛋白酶添加至培养的组织中)培养HVJ,或通过以克隆化病毒基因 组感染培养的细胞，导致持续感染，而培养HVJ。
在本实施例中，HVJ如下培养。
利用SPF(不含特异性病原体的)受精卵培养HVJ种子病毒。将分离并 纯化的HVJ(Z种)分配至保存细胞的试管中，添加10。/。DMSO后保存于液氮中。
取刚刚完成受精的鸡卵，将其置于培养箱(SHOWA-FURANKIP-03型； 能容纳约300个受精卵)中，在36.5。C和40%以上湿度的环境下培养10-14 天。在暗室中，用检卯器(其中将来自灯泡的光线引导穿过一个直径约1.5 cm 的窗口)证实胚的活力以及气室和绒毛尿嚢膜的位置。用铅笔标出绒毛尿嚢 膜上方约5 mm处的病毒注入部位(选择该部位应避开任何厚血管)。将种子 病毒(其取自液氮)用多聚蛋白胨溶液(其中将1 %多聚蛋白胨与0.2 % NaCl混 合，用1 MNaOH调节至pH 7.2,然后经高压灭菌，保存在4。C)稀释500 倍，并于4。C静置。鸡胚用IsodineTM和乙醇消毒。用锥子(pick)在病毒注射 部位制造一个小洞。用1 ml的注射针(26号)将0.1 ml稀释的种子病毒液注 入绒毛尿嚢腔。用Pasteur移液管以Molten石蜡(熔点50-52。C)封闭洞口 。 将受精卵置于培养箱中，在36.5。C和40。/。以上湿度的环境下培养3天。然 后，将已接种的受精卵于4。C静置过夜。第二天，用小镊子打开气室，将带 有18号针头的10 ml注射器深入绒毛尿嚢膜中以吸取尿嚢液，将其收集在 无菌小瓶中，4。C保存。
(2: HVJ的纯化)
HVJ可通过利用离心进行纯化的方法，利用层析柱进行纯化的方法，或领域内已知的任何其它方法来纯化。
(2.1:通过离心进4亍纯化的方法)
简单说，收集含病毒的溶液，低速离心以除去该培养液以及绒毛尿嚢
液中的组织或细胞碎片。其上清利用蔗糖密度梯度(30-60。/。w/v)经高速离心 (27,500 x g， 30分钟)和超速离心(62,800 x g,卯分钟)来纯化。纯化期间尽 可能温和地处理病毒，将病毒4。C保存。
具体在本实施例中，HVJ用如下方法纯化。
将约100 ml含HVJ的绒毛尿嚢液(取自含HVJ的鸡胚，收集并保存于 4。C)用Komagome型广口移液管装入两个50 ml离心管中(见Saeki， Y.和 Kaneda,Y:用于运送基因、寡核苷酸和蛋白质的蛋白质修饰型脂质体(HVJ-脂质体).细胞生物学实验室手册(第二版)，J. E. Celis编(Academic Press Inc.， San Diego),第四巻，127-135页，1998),于4。C以3000 rpm低速离心10 分钟(关闭制动闸(brake))。以此除去鸡胚中的组织石争片。
离心后，将上清转移至4个35ml离心管(高速离心型)，用角度转子以 27,000g离心30分钟(加速器和制动闸均打开)。除去上清，沉淀中加入BSS (10 mM Tris陽HCl(pH 7.5), 137 mM NaCl, 5.4 mM KC1;高压灭菌，4。C保存) 约5ml/管，4。C静置过夜。用Komagome型广口移液管轻轻吹打沉淀并转移 至一个试管中，用角度转子以27,000g类似地离心30分钟。除去上清，沉 淀中加入约10 ml BSS， 4'C静置过夜。用Komagome型广口移液管轻轻吹 打沉淀，4。C以3000 rpmj氐速离心IO分钟(制动闸关闭)，乂人而除去尚未彻 底除去的组织碎片和病毒凝集块。将上清转移至新的无菌试管中，4'C保存， 作为纯化的病毒备用。
将0.9 ml BSS加入0.1 ml该病毒液中，用分光光度计测定540 nm处的 吸收值。将病毒滴度转换为红细胞凝集活性(HAU)。 540nm处的吸收值为1 约相当于15,000 HAU。据认为，HAU与融合活性基本成正比。此外，红细 胞凝集活性可利用含鸡红细胞(0.5 %)的溶液进行真实地测定(见"动物细胞 操作实用手册，，)，REALIZE公司(内田，大石，古编)，259-268, 1984)。
此外，必要时可利用蔗糖密度梯度纯化HVJ。具体是，将病毒悬浮液 转移至已将60 %和30 %的蔗糖溶液(已高压灭菌)分层的离心管中，以62,800 xg密度梯度离心120分钟。离心后，回收60%蔗糖溶液中所发现的一条 带。将所回收的病毒悬浮液于4。C对BSS或PBS溶液透析过夜，以除去蔗糖。如果不必立即使用该病毒悬浮液，可加入甘油(已高压灭菌)和0.5 M
EDTA(已高压灭菌)至终浓度分别为10。/。和2-10mM,温和冻存于-80。C，并 最终冻存于液氮(该冻存可用10 mM DMSO代替甘油和0.5 M EDTA溶液)中。
(2.2:利用层析柱和超过滤进行纯化的方法)
利用层析柱进行HVJ纯化的方法也可取代通过离心进行纯化的方法而 应用于本发明。
简单说，利用截留分子量为50,000的超滤膜进行浓缩(约IO倍)和通过 离子交换层析(0.3 M-l MNaCl)进行洗脱均可达到纯化的目的。 具体在本实施例中，用以下方法层析纯化HVJ。
收集绒毛尿嚢液，经滤膜(80jum-10iim)过滤。将0.006-0.008 % BPL(终浓 度)加至绒毛尿嚢液中(4。C, l小时)，以灭活HVJ。将绒毛尿嚢液于37。C保 温2小时以灭活BPL。
用500 KMWCO (A/G Technology, Needham, Massachusetts)经切向流超 滤法浓缩约10倍。所用緩冲液为50mMNaCl， 1 mMMgCl2,2o/。甘露醇，以 及20 mM Tris (pH 7.5)。 HAU分析表明，HVJ产量接近100。/。。故，获得了 极好的结杲。
用Q Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech KK， Tokyo)经柱层析纯 化法(緩冲液20 mM Tris HC1 (pH 7.5)， 0.2-1 M NaCl)可纯化HVJ。产量为 40-50%,纯度为99%或更高。
用500 KMWCO (A/G Technology)经切向流超滤法浓缩HVJ级分。
(3: HVJ的灭活)
如果必须灭活HVJ,可如下通过UV光辐射或烷基化试剂处理而实施。 (3.1: UV光辐射法)
将1 ml HVJ悬浮液置于一个直径30 mm的平皿中，接受99或198 mJ/cn^的辐射。也可使用Y射线辐射(5-20Gy),但它不能彻底灭活。 (3.2:用烷基化试剂进行处理)
使用前，在10mMKH2PO中制备0.01%(3-丙醇酸内酯。制备期间将该 溶液保持在4'C，操作应快速完成。
将P-丙醇酸内酯加入刚刚完成纯化的HVJ悬浮液中至终浓度为0.01 %,于水上静置60分钟。然后于37。C将该混合物保温2小时，再分配至Eppendorf管(10,000 HAU/管)，以15,000 rpm离心15分钟。沉淀物-20。C保 存。不用上述灭活法，无需将沉淀物在-20。C保存，可经表面活性剂处理掺 入DNA, 乂人而构建一个载体。 (4: HVJ包膜载体的构建)
将含有200-800昭外源DNA的92|il溶液加入保存的HVJ中，吹打使 之充分悬浮。将该溶液于-20。C保存至少3个月。DNA在与HVJ混合前加 入硫酸鱼精蛋白可将表达效力增强2倍或更多倍。
将所述混合物于水上静置1分钟，加入8^1辛基葡糖苦(10%)。使该试 管在水上振动15秒，水上静置45秒。用表面活性剂进行处理的时间优选 为l巧分钟。也可用Triton-X00(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、CHAPS(3-[(3-氯酰氨基丙基)-二曱基氨]-l-丙烷磺酸)(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]陽l-propane sulfonate)、或NP-40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇) 等表面活性剂代替辛基葡糖香。Triton-X100， NP-40和CHAPS的终浓度分 别优选为0.24-0.80% 、 0.04-0.12%、和1.2-2.0%。
加入lml冷BSS，迅速将该溶液以15,000 rpm离心15分钟。在所得沉 淀中加入300plPBS或盐水等，经涡旋或吹打使沉淀悬浮。可将该悬浮液直 接用于基因转移或可在-20。C保存后用于基因转移。保存至少2个月后，该 HVJ包膜载体维持了同样的基因转移效力。
(实施例9: HVJ包膜栽体中Fl蛋白与HN蛋白之比)
(1:样品制备)
(i) 将相当于10,000 HAU的纯化HVJ以15,000 rpm离心15分钟，将沉 淀悬浮于300filPBS中，-20°<:保存。
(ii) 用紫外线(198 mJ/cm"对相当于10,000 HAU的纯化HVJ进行辐射， 然后以15,000 rpm离心15分钟，4吏沉淀悬浮于300|ilPBS中，-20。C保存。
(iii) 用紫外线(198 mJ/cm"对相当于10,000 HAU的纯化HVJ进行辐射， 然后以15,000 rpm离心15分钟。向沉淀中加入200pl pcLuci DNA(溶液 92^1),通过吹打来悬浮。将悬浮液置于水上，加入8|11辛基葡糖苷(10%)。 用手将试管振动15秒，于冰上静置45秒。加入lml冷BSS,迅速以15,000 rpm离心15分钟。此后，使沉淀悬浮于300)alPBS中，-20°(3保存。
(2:蛋白质电泳)
将x 5 Laemli样品緩沖液加入三种样品(5， 10， 20 pl)中，进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝染色。脱色后，将凝胶
贴在玻璃纸(cell叩hane)上，风干。 (3:蛋白质鉴定)
将已电泳并染色的样品插入LAS2000(富士胶巻，东京)(图7)，测定对 应于F1和HN的蛋白质带的浓度。对每种样品的三种不同量进行电泳。计 算各自的F1/HN密度，并计算每份样品的平均值和标准差。
(4:结果)
样品(i)、(ii)和(iii)的F1/HN保持在约1.7。考虑到Fl(51kD)和HN(68kDa) 的分子量，分子比应为2.3。这与报道(实验细胞研究，142， 95-101， 1985) 一致，该报道中，F1/HN值约为2时，Fl和HN所重构的脂质体具有最佳 融合。在其他研究者所报道的重构类型中，该比例不同于野生型病毒的(病 毒学杂志，67， 3312-3318， 1993)。其它蛋白组合物在HVJ和HVJ包膜载 体之间也基本相同。
(实施例10: DNA向HVJ包膜栽体中的包裹以及包裹率)
(1: HVJ包膜载体的电子显微镜显像)
(其中的DNA被包膜包裹或未被包膜包裹)
如上述，将130(ig pSFV-LacZ (14.5kb)包入10,000 HAU的HVJ(已用紫 外线灭活)中，并制备HVJ包膜载体。
将已包入的HVJ包膜载体悬浮于30(^1 PBS中，-20°(3保存。IO天后， 将1^1该悬浮液置于栅格(grid)中，负染后用电子显微镜进行观察。用未包 裹DNA的HVJ包膜载体作对照。
(结果)
结果见图8。大多数HVJ包膜载体具有基本相同于HVJ病毒本身所具 有的外膜构象。与未包入DNA的HVJ包膜载体相比，在应用了 DNA的 HVJ包膜载体中可观察到一种高电子密度结构。另一方面，所述未包裹的 HVJ包膜载体具有较高的内部透光率，据此可推论病毒基因组已被破坏或 丟失。
(2: HVJ包膜载体中的DNA包裹率)
将157(ig pcLuci (7.4kb)以上述方式包裹至6,700 HAU的HVJ(UV灭活 型)中，从而制备HVJ包膜载体。将该HVJ包膜载体悬浮于300jilBSS中， 用15个单位的微球菌(Micrococcal)核酸酶、2mMCaCl2、以及20|ig/ml RNA酶A于20。C处理30分钟，对1L PBS透析(4。C ，过夜)。将HVJ包膜载体 用1 %SDS于37。C处理1分钟，再用500|ul苯酚(phenol)和500|il氯仿-异戊 醇处理，然后进行乙醇沉淀。将该沉淀物悬浮于100falBSS中，用分光光度 计测定260 nm或280 nm处的吸光度值。 (结果)
产量为85.7%。将其转化后，可得HVJ包膜栽体中DNA掺入效率为 3.8 % 。将279吗pcLuci掺入10,000 HAU的HVJ中时，效率为7.2 % 。
才艮据以上结果推断，当使用辛基葡糖苷时，向10,000 HAU的HVJ中 掺入DNA的效率约为6 - 7 % ，但根据DNA的使用量不同略有变化。此外， 已发现当^6危酸鱼精蛋白与DNA和HVJ包膜载体同时存在时，导入效率提 高，认为这是由于DNA被HVJ包膜载体包裹的效率得到提高。据推断，使 用Triton-XlOO或NP-40可使效率进一步提高约10 - 40 % 。
(实施例11:借助HVJ包膜载体将基因转移至细胞)
(1:基因转移方法)
将l，OOO HAU装入Eppendorf管(30(il)中，加入5^1硫酸鱼精蛋白(l mg/ml)。更换BHK-21细胞(其于前一天以200,000个细胞/孔的量接种在6 个孔中)的培养基，每孔加0.5 ml培养基(10o/。FCS-DMEM)。每孔加上述载 体(相当于1，000HAU)与硫酸鱼精蛋白的混合物，前后左右摇晃该平板，使 载体与细胞充分混合。将混合物于5%0)2培养箱中37。C保温10分钟。
更换培养基，于5%<:02培养箱中37。C保温过夜(16-24小时)，然后检 查基因表达。如果检查萤光素酶(pcLuci:带有CMV启动子的萤光素酶基因)， 则细胞用0.5ml细胞裂解緩沖液(Promega)裂解，用营光素酶分析试剂盒 (Promega)测定20|il溶液的活性。如果是绿色焚光蛋白(pCMV-GFPE; Promega),则在荧光显微镜下观察完整细胞，放大400倍的情况下观察5-8 个视野，计算发出荧光的细胞的比率。
(2:有关培养细胞之导入效力的影响条件的研究)
用BHK-21细胞作为培养的细胞。
(2.1:对HVJ包膜载体的制备中辛基葡糖苷(OG)浓度的研究) 对上述(l)的基因转移方法进行以下改变，并检查辛基葡糖苷(OG)在以
下浓度(即用于制备HVJ包膜载体时的OG终浓度)之时通过HVJ包膜载体
对基因转移的影响(A) 辛基葡糖苷浓度1、 2、或3%;
制备HVJ包膜载体时灭活的HVJ接受OG处理的时间1分钟、5分 钟、或IO分钟；
进行或不进行超声处理(声处理)。
(B) 辛基葡糖苷浓度0,125-1.25%; 用于转染的载体的体积lO(il, lOOpl。
(C) 辛基葡糖苷0.55-0.8%; 转染时间30分钟，过夜(0/N)。 结果见图9。
(2.2:向细胞内转移基因的条件，硫酸鱼精蛋白(PS)的浓度/处理时间) 对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并4全查碌u酸鱼精蛋白通过 HVJ包膜载体对基因转移的影响
(A) 硫酸鱼精蛋白浓度0-100吗/ml培养基； 转染时间20、 40、或60分钟。
(B) 硫酸鱼精蛋白浓度040ng/ml培养基； 转染时间5、 10、或20分钟。 结果见图10。
(2.3:包入HVJ包膜载体的DNA的浓度对基因表达水平的影响) 对上述(l)的基因转移方法进行以下改变，并检查该实验所用DNA量通 过HVJ包膜载体对基因转移的影响
(A) DNA量20-200|ig;
将HVJ包膜载体于-20。C或-8(TC保存5天。
(B) DNA量180-360|ig/HVJ 10,000 HAU。
结果见图11。
(2.4:用于基因转移的HVJ滴度对基因表达水平的影响)
对上述(l)的基因转移方法进行以下改变，并检查基因转移所用HVJ滴 度通过HVJ包膜载体对基因表达量的影响
利用滴度为5,000、 10,000、或20,000 HAU的HVJ制备HVJ包膜载体, 用相当于250、 500、 l，OOO、或2,000 HAU的量转染BHK-21细胞。
结果见图12。(2.5: HVJ灭活条件对HVJ包膜载体的基因转移效力的影响) 对上述(l)的基因转移方法进行以下改变，并检查HVJ灭活方法(UV或 P-丙醇酸内酯)对BHK-21细胞中萤光素酶基因表达的影响
(A) 用于UV辐射的辐射量0-231 mJ/cm2。
(B) 用于HVJ处理的P-丙醇酸内酯(BPL)的浓度0-0.025 % 。 结果见图13。
(实施例U:利用HVJ包膜载体将基因转移至各种细胞)
根据本发明实施例11所述，将基因转移至人舌上的鳞状细胞癌(SAS) 中。结果见图14。通过基因转移，用于转染的硫酸鱼精蛋白浓度和保温时 间发生变化，如图14所示，根据萤光素酶基因的表达来测定基因转移效力。 在用于转染的条件下，当用200iLig/ml硫酸鱼精蛋白转染60分钟时，基因转 移的效力最大。但通过进一步增加硫酸鱼精蛋白的浓度，有望进一步提高 基因转移效力。
用本发明实施例11的方法向人的主动脉内皮细胞(HAEC)中导入基 因。结果见图15。
通过基因转移，用于转染的硫酸鱼精蛋白浓度和保温时间发生变化， 如图15所示，根据萤光素酶基因的表达来测定基因转移效力。在用于转染 的条件下，当用100吗/ml硫酸鱼精蛋白转染60分钟时，基因转移的效力最 大。但通过进一步增加硫酸鱼精蛋白的浓度，有望进一步提高基因转移效 力。
(实施例13:利用HVJ包膜载体将基因转移至各种类型的体内组织中)
本实施例描述利用实施例11所述的HVJ包膜载体将基因转移至各种 类型的体内组织中。 (13.1:小鼠肝脏)
将0.8 %辛基葡糖苷与200昭pcLuci(其已悬浮于300fil PBS中)一起在水 上静置1分钟，由此制备HVJ包膜载体。所制备的悬浮液取1/10 (30|^1,相 当于1,000 HAU)，用70(ilPBS稀释(总量100^1),将该稀释液注射至小鼠 (C57BL/6)肝脏的 一个小叶中。
通过与200i!gpcLuci—起涡旋/挤压，然后进行蔗糖梯度离心(62000g, 90分钟)，可制备HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂质体。然后通过离心(27000g， 30分钟)使该制剂沉淀，将沉淀悬浮于500|al PBS中。取100pl该样品注射至小鼠(C57BL/6)肝脏的一个小叶中。
24小时后，分离所注射的肝脏小叶，用萤光素酶分析系统(Promega)分 析肝小叶的萤光素酶活性。
结果见图16A。这些结果清楚表明，本发明的HVJ包膜载体显示了非 常高的基因转移效力，该效力比传统HVJ-AVE脂质体的基因转移效力高出 约2倍。
(13.2:小鼠子宫)
如13.1所述制备HVJ包膜载体。将50^1和100|al样品用PBS稀释至 50(Hd，灌注至小鼠的输卵管，将子宫颈结扎IO分钟。24小时后，分离小 鼠子宫，用萤光素酶分析系统(Promega)分析小叶或子宫的萤光素酶活性。 结果见图16B。本发明的HVJ包膜载体能将基因转移至小鼠子宫中，而利平。
含pcLuci的HVJ包膜载体如13.1所述制备。为了进行LacZ表达，用 200昭pEB-CMV-LacZ(13kb)制备含有该质粒的HVJ包膜载体。将含有这些 质粒的HVJ包膜载体如上注射至子宫中。结果见图16C。通过LacZ染色， 测得LacZ基因的表达主要见于子宫内膜的腺上皮中。
(13.3:大鼠脑部)
用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备含 pEGFP-l(即，已将水母的绿色荧光蛋白基因(约0.7kb)引入携有巨细胞病毒 启动子的表达载体中的一种载体；可得自Clontech，PaloAlto,CA)的HVJ包 膜载体。将30^1该载体(相当于1000 HAU，该制品的1/10)注射至SD (Sprague- Dawley)大鼠的颈动脉或经小脑延髓池注射至髓腔内。基因转移的 3-4天后，将大鼠处死，制备脑组织切片但不固定。在焚光显微镜下观察荧 光。如图16D的结果所示，绿色焚光蛋白(GFP)的脑内表达在注射至颈动脉 或经小脑延髓池注射至髓腔内的情况下都可观察到。另一方面，当利用 HVJ-AVE脂质体经大鼠颈动脉进行类似的基因转移时，未观察到脑内GFP 表达。
(13.4:家兔眼部)
pCMV-NK4由大阪大学医学系研究科中村敏一教授等友情赠送，该质 粒是将人HGF(肝细胞生长因子)基因的突变体，NK4 cDNA (1.4kb)克隆至pCDNA3 (InVitrogen， SanDiego， CA)的HindlII/Xbal位点而构建成的。
用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备HVJ 包膜载体，不同的是，使用400或800昭pCMV-NK4以及10000 HAU的灭 活HVJ。 pCMV-NK4是表达能抑制HGF功能的HGF突变体的一种载体。 将50pl该载体(1/6的该制品)注射至已用重组VEGF块处理以诱导血管生成 的家兔角膜组织中。7天后，将家兔处死，观察眼内的血管生成。结果如图 16E所示。pCMV-NK4以剂量依赖的方式抑制由VEGF诱导的血管生成。 (13.5:大鼠肺动脉)
用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备含 pSV-LacZ (Promega， Madison, WI)的HVJ包膜载体，其中pSV-LacZ含有在 SV40启动子控制下的LacZ基因。将50^1该载体(1/6的该制品)注射至大鼠 气管。基因转移的3天后，将大鼠处死，组织用1%戊二醛固定，然后用 X-gal显像动脉中的LacZ表达。结果见图16F。在将HVJ包膜载体经肺动 脉引入的情况下，也观察到支气管上皮中有基因表达(资料未显示)。
(实施例I4:病毒包膜载体作为药物运送系统(DDS)的功能)
本发明的基因转移载体还可作为寡核苷酸或诱饵(decoy)核酸治疗的有 效药物运送系统。
(141:荧光寡核苷酸的导入)
利用本发明的病毒包膜载体将荧光标记的寡核苷酸导入细胞。
20体寡核苷酸(5，匿CCTTgAAGGGATTTCCCTCC匿3，) (194吗/92pl BSS) 在其5'位置用FITC标记，将其与10,000 HAU的HVJ(已用198 mJ/cm2的紫 外线灭活)沉淀混合。加入Triton X-100(终浓度0.24%)，将该混合物于水 上静置1分钟。加入lfilBSS，将该混合物离心(15，000rpm， 15分钟，4'C)。 在沉淀中加入100|ilPBS,将该混合物保存在-20。C。 l个月后，将该混合物 解冻，取10pl与5吗硫酸鱼精蛋白混合，与5,000,000 BHK-21细胞(于0.5 ml 培养基中)一起保温(10分钟，60分钟)。导入后的第二天，在荧光显微镜下 观察细胞的荧光。结果，10分钟后获得约10%的寡核苷酸导入效率(图17B), 60分钟后寡核芬酸已导入80%或更多的细胞(图17B)。
(14.2:用Stat6诱饰核酸治疗接触性皮炎)
利用本发明的病毒包膜载体将诱饵核酸导入细胞。
将含有Stat6 DNA结合序列(5，-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT隱3，和5'陽CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA隱5', (Wang, L.H.等 血液95， 1249-1257， 2000))的双链核酸(250吗/300|11 BSS)与30,000 HAU的 HVJ(已用99 mJ/cm2的紫外线灭活)沉淀混合。
加入Triton X-100 (终浓度0.24%),将该混合物于冰上静置1分钟。 加入lmlBSS，将该混合物离心(15，000rpm， 15分钟，4'C)。在沉淀中加入 300ji1 PBS,将该混合物保存在-20。C。给小鼠皮下注射该HVJ包膜载体， 导致对IgE-诱导型变态反应和迟发型皮肤反应的抑制。
(实施例15:向悬浮细胞中进行基因转移)
用CCRF-CEM、 NALM-6、 K-562 (其类似人白血病细胞)进行基因转移实验。
将200i^g pCMV-萤光素酶(92pl)与10,000 HAU的灭活HVJ(99 mJ/cm2 紫外线)沉淀混合。
加入Triton X-100 (终浓度0.24%)，将该混合物于冰上静置1分钟。 力口入lmlBSS，将该混合物离心(15，000rpm, 15分钟，4°C)。在沉淀中加入 300(il PBS,由此制备HVJ包膜载体。使60^1载体(相当于2,000 HAU)、硫 酸鱼精蛋白、及4,000,000该悬浮细胞在1.5 ml Eppendorf管中混合，离心 (10，000-15，000rpm, 10分钟，2(TC)。然后，在沉淀中加入培养液，将混合 物置于培养皿中。l天后，测定细胞的萤光素酶活性。
所用细胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)当使用HVJ-脂质体或现有脂 质体试剂(Gibco BRL的脂质转染胺试剂(Lipofectamine),脂质转染试剂 (lipofectin))时显示极低的导入效率。但如图18所示，观察到较高的向这些 细胞中转移基因的效力。
优选的基因转移条件如下加入600-l,000[ig/ml硫酸鱼精蛋白，于20 。C以10,000 rpm或15,000 rpm离心10分钟。未观察到与HVJ包膜载体相关 的显著细胞毒活性。离心和硫酸鱼精蛋白的添加是基因转移所必需的。
(实施例16:向癌组织的基因转移)
将354吗pCMV-萤光素酶(92pl)与34,000 HAU的灭活HVJ(99 mJ/cm2 紫外线)沉淀混合。加入Triton X-100 (终浓度0.24%),将该混合物于冰上 静置1分钟。加入lml BSS，将该混合物离心(10,000 rpm-15，000 rpm, 10 分钟，20°C)。在沉淀中加入300(il PBS, -20。C保存。l天后，将该混合物 与500|ig/ml或1000昭/ml硫酸鱼精蛋白混合。取100|il注射至小鼠黑素瘤B16-F1的肿瘤实体(直径7-8 mm)中。1天后测定萤光素酶活性。如图19 所示，在肿瘤实体中观察到基因表达。优选硫酸鱼精蛋白的浓度为 500昭/ml。另一方面，使用较低浓度的硫酸鱼精蛋白检测不到基因表达。
(实施例n:疱渗病毒包膜载体的制备)
(n.i:灭活病毒的制备)
单纯疱渗病毒1型(HSV-1) (101Q空斑形成单位/ml)由大阪大学医学系研 究科细菌学专业的山西教授友情赠送。根据培养的猴细胞(Vero细胞)中病毒 空斑的形成来检查该病毒的灭活条件。当病毒用p-丙醇酸内酯(BPL)0.05。/c) 灭活时，空斑以9.1 x 10"(空斑/Vero细胞)的频率出现在Vero细胞中。另一 方面，当病毒用200或400mJ/cn^紫外线灭活时，空斑出现频率分别为4.3 x 10-4或2.2 x 1(y6(空斑/Vero细刀包)。
(17.2:利用灭活病毒进行的基因转移)
将10011lHSV-l(l()9颗粒)用620itdPBS稀释，用400 mJ/cm2紫外线照射 该稀释液。取其10%(72|11)与DNA(pCMV-萤光酶素8.83昭/^1)混合。于冰上 加入8ji1 3% Triton X-100(终浓度0.24%), 1、 2、 3、 4、 5、或6分钟后， 加入lml PBS以稀释该溶液。每种样品取100|il，导入BHK-21细胞(在6 孔板中)。将细胞培养在含10。/。胎牛血清(FCS)的Dulbecco极限必需培养基 (DME)中。在另 一实验中，每种样品取100|il与5吗硫酸鱼精蛋白混合，然 后导入BHK-21中。将样品于培养箱(37。C， 5%032)中放置60分钟后，培 养液用10。/。FCS-DME更换。22小时后测定萤光素酶活性。如图20所示， 用本发明方法制备的疱疹病毒包膜载体具有较高基因转移效力。经形态学 观察，没有一种样品显示任何细胞毒活性。
疱渗病毒包膜载体用Triton-X100处理5分钟，于-80。C保存2天，然后 解冻，再次加入BHK-21细胞中，测定导入效力。这一次，在导入后60分 钟时加入10%FCS-DME(2.5 ml/孔)，培养过夜，然后测定活性。对血清的 效应以及载体的量进行研究。
如图21所示，即使在-80。C保存2天后仍具有较高基因转移效力。用添 加了 10%血清的培养基比用无血清培养基的导入效力高。用200^1载体溶 液(估计2.8 x 107个病毒颗粒/孔)比用100^1载体溶液(估计1.4xl(^个病 毒颗粒/孔)的基因转移活性高。
(17.3:利用灭活病毒进行的基因转移)根据以上内容，本领域技术人员可显而易见地认识到，本发明利用表 面活性剂产生包膜载体的技术不仅可应用于HVJ,还可应用于更大范围的 具有脂质膜的包膜病毒。因此，本领域技术人员显然可轻易地利用任何其 它包膜病毒，按本发明的公开内容，制备用于基因转移的包膜载体。从而 可产生利用了属于逆转录病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、 副粘病毒禾牛、正粘病毒禾牛、布尼亚病毒-牛、弹4犬病毒牙牛、痘病毒矛牛、疱渗
病毒科、杆状病毒科、嗜肝DNA病毒科等的病毒的包膜载体。相应地，可 以认为，将目标导入特定器官可利用病毒的组织针对性来实现。例如，利 用了疱渗病毒的包膜载体可作为导向神经的载体来应用；利用Epstein-Barr 病毒的包膜载体可作为导向淋巴细胞的载体来应用；利用了流感病毒的包 膜载体可作为导向呼吸器官的载体来应用。
因此，本发明的具体实施方案在本说明书中作为举例来描述。但显然， 在不违背本发明的精神和范围的前提下可作各种修改。具体是，尽管本说
明书中的实施例在利用灭活型HVJ的基因转移载体方面进行了描述，但本 领域技术人员显然可根据本说明书的公开内容，利用不同于HVJ的其它灭 活病毒制备本发明的基因转移载体，也可不通过灭活步骤而利用类似的制 备方法来制备本发明的基因转移载体。因此，本发明仅由所附权利要求书 来限定。
工业实用性
本发明提供了 一种新的基因转移方法，该方法操作简单并具有很好的 基因转移效力。据认为这使得能快速筛选基因文库。本发明还提供了一种 进行大量筛选的试剂盒，它包含本发明的病毒包膜载体。此外，本申请提 供的病毒包膜载体可耐受较长期的冷冻保存，使得它无需在使用时临时制 备。从而可极大地简化操作过程，并可实现以大量产生的导入载体为基础 的匀质基因转移。此外，本发明的基因转移栽体使得基因转移比任何传统 的基于HVJ制备的载体更有效，并使得可将基因转移至比传统方法更大范 围的体内组织中。
本发明还提供了含有本发明基因转移载体的用于给与药物的药物运送 系统，药物筛选系统，以及用于基因治疗的载体。
权利要求
1.仙台病毒(HVJ)的灭活病毒包膜，其是从病毒分离并纯化得到的，在该包膜中，融合活性所需的病毒蛋白的比例与野生型病毒的相同。
2. 权利要求1的灭活病毒包膜，其未与脂质体融合。
3. 权利要求1的灭活病毒包膜，其是野生型的或重组的。
4. 权利要求1-3之一的灭活病毒包膜，其中所述灭活经UV辐射或经 烷基化试剂处理而实现。
5. 权利要求1-4之一的灭活病毒包膜，其是通过纯化HVJ、再进行 33-198 mJ/cm2的UV辐射、然后离心而制得的包膜。
6. 权利要求1-5之一的灭活病毒包膜，其是通过纯化HVJ、再进行 33-165 mJ/cm2的UV辐射、然后离心而制得的包膜。
7. 权利要求l-4之一的灭活病毒包膜，其中纯化的HVJ用烷基化试剂 处理、然后离心。
8. 权利要求7的灭活病毒包膜，其中所述烷基化试剂是P-丙醇酸内酯。
9. 权利要求8的灭活病毒包膜，其中p-丙醇酸内酯的浓度为0.0025 % -0.025 % 。
10. 权利要求8的灭活病毒包膜，其中(3-丙醇酸内酯的浓度为0,0075 % -0.025 % 。
11. 权利要求l-10之一的灭活病毒包膜，其中所述病毒蛋白是F1蛋 白和HN蛋白。
12. 权利要求l-10之一的灭活病毒包膜，其中所含F1/HN蛋白之比与 野生型的相同。
全文摘要
本发明涉及一种用于基因转移的病毒包膜载体，还涉及通过将外源基因导入灭活病毒的包膜，经由冻融处理或与表面活性剂混合，来制备基因转移载体。本发明还提供含有该基因转移载体的基因治疗药用组合物，含有该基因转移载体的试剂盒，以及应用该基因转移载体的基因转移方法。
文档编号C12N15/87GK101302536SQ20081000162
公开日2008年11月12日 申请日期2001年2月2日 优先权日2000年2月2日
发明者金田安史 申请人:安增子摩祺株式会社;金田安史