专利名称：含有mdr1基因启动子和报告基因的重组质粒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及筛选肿瘤多药耐药逆转剂的方法，具体涉及含 多药耐药(MDR1)基因启动子和报告基因的重组质粒及其在以MDR1基因启动 子为耙点的逆转或诱导肿瘤多药耐药药物筛选方法中的应用。
背景技术：
肿瘤多药耐药(Multidrugresistance, MDR)指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物 耐药的同时对其他结构和作用相同或不同的抗肿瘤药物也产生了耐药性。肿瘤细 胞产生MDR是化疗失败的重要原因，临床上许多肿瘤患者因此对化疗药物不敏 感，导致化疗效果差和肿瘤的复发和转移。从某种意义上讲，90%死于恶性肿瘤 的病例都与原发性或获得性耐药相关。
现有技术公开了通过对MDR的发生机制进行的广泛的研究表明，这是一种 受多因素、多机制调控，主要表现为降低化疗药物的内流、减少细胞内药物的积 聚、增加能量依赖性的药物主动外排、增强DNA的修复活性、加强细胞解毒系 统的作用和阻碍药物引起的凋亡等因素。临床实践证实，结肠癌、肾癌、肝癌、 非小细胞肺癌、神经胶质瘤等实体瘤是容易产生MDR的恶性肿瘤，甚至刚确诊 就有耐药性的存在。进一步的研究发现这些肿瘤的细胞常有P-糖蛋白(P-glyco-protein， P-gp)等转运蛋白的高度表达。有些肿瘤如急性骨髓细胞性白血病、急 性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞常对化疗药物敏感， 但是一段时间用药后又会产生耐药性，表现为P-gp等转运蛋白的表达上调。所述 的P-gp是一种跨膜蛋白，有人类MDR基因家族中的MDR1基因编码。P-gp具有能 量依赖性的跨膜药物外输泵的功能，可将细胞内的底物包括多种抗肿瘤药物泵出 细胞外，使细胞内的药物积聚浓度下降，产生耐药性，显示MDR表型。P-g介导 的MDR是目前研究最为深入多药耐药机制。几乎所有肿瘤细胞均有不同程度上 MDR/ P-gp的表达，但是其中对化疗药物不敏感或疗效差的肿瘤往往有较高的 MDR1基因表达。因此，MDR1基因表达水平成为筛选肿瘤多药耐药逆转剂的一 个重要指标。目前，有多种方法检测基因表达水平。但是每种方法均存在不足之处。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选肿瘤多药耐药逆转剂的方法，具体涉及一种以 MDR1基因启动子为靶点的逆转或诱导肿瘤多药耐药药物筛选方法。
本发明的另一目的是提供一种含有肿瘤多药耐药基因启动子(MDR1)和报 告基因的重组质粒。
本发明的进一步目的是提供上述含有肿瘤多药耐药基因启动子序列和报告 基因的重组质粒及其制备方法和用途。
本发明所述的含有MDR1基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是 所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
本发明是通过如下技术方案来实现的-
以萤火虫荧光素酶为报告基因，构建含有MDR1基因启动子和萤火虫荧光 素酶报告基因的pGL-MDR重组质粒；
用上述的pGL-MDR质粒联合pRL-TK质粒共转染耐药型结肠癌细胞系 HCT-8/VCR，能够通同时检测两种荧光素酶活性用以反应抗肿瘤逆转剂对MDR1 基因启动子转录活性的抑制作用；
用上述的pGL-MDR质粒联合pRL-TK质粒共转染敏感型结肠癌细胞系 HCT-8，能够通同时检测两种荧光素酶活性用以反应化疗药物对MDR1基因启动 子转录活性的诱导作用从而建立靶向筛选肿瘤多药耐药逆转剂或诱导剂的方 法。该方法在筛选肿瘤多药耐药逆转剂或诱导剂、研究肿瘤多药耐药逆转剂的作 用机理以及研究化疗药物诱导肿瘤细胞产生耐药的机理等方面具有极佳的应用 前景。
本发明的重组质粒其中的双荧光素酶报告基因检测基因表达具有如下优点.-
1) 灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等；
2) 同时具有耙向性的特点，能够特异性检测启动子中特定序列的启动活性；
3) 克服了转染效率对结果的影响。
本发明经体外细胞实验，结果显示，在耐药细胞中MDR1基因启动子活性 高于敏感细胞活性十余倍。热处理能够明显增强敏感的HCT-8细%中MDR1基 因启动子的活性，而对耐药的HCT-8/VCR细胞中MDR1基因启动子的活性没有影响。本重组质粒可用于检测MDR1基因抑制剂或诱导剂对MDR1基因表达的影响。
图1是MDR1基因启动子序列的克隆，
其中，Marker为DL2000， 1和2为MDR1基因启动子片段(280bp)。 图2是pGL3-MDR重组质粒的Nhe I和Bgl II双酶切检测， 其中，Markerl为A DNA/HindlIImarker， Marker2为DL2000， 1 pGL3-Basic; 2pGL-MDR; 3pGL-MDR/Nhe I十BglII (4.5kb+280bp)。
图3是热处理对HCT-8和HCT-8/VCR细胞中MDR1基因启动子活性的影响。
图4是EGCG对HCT-8和HCT-8/VCR细胞中MDR1基因启动子活性的影响。
具体实施例方式
一、试验材料
1、 菌株、质粒
l)菌株大肠杆菌￡.0^011501，敏感型大肠癌细胞株HCT-8购于中国科学 院细胞库。耐药性型大肠癌细胞株HCT-8/VCR (市购)对于长春新碱的IC5o为 250ixg/ml，耐药倍数为19.7。 2)质粒pGL3-basic和pRL-TK (市购)。
2、 生化试剂
1) ExTaq酶，限制性内切酶Nhe I ， Bgl II和DNA Ligation Kit购自TaKaRa 公司。DL2000 marker和入DNA/Hindlll marker购自上海MajorBio公司。PRMI 1640培养液(Hyclone); Lipofect Transfection Reagent (TIANGEN， Beijing)。
2) 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒回收试剂盒和 DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司。
3) 小牛血清购自民海生物公司。Tris， EDTA， Trytone， Yeast Extract等试 剂购自上海MajorBio公司。
二、方法步骤1、 重组质粒的构建
1) pGL3-basic和pRL-TK质粒的大量扩增、抽提
用pGL3-basic质粒转化常规制备的DH5a感受态细胞，进行大量的扩增；碱 裂解法大量制备pGL3-basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量；用Nhe I和Bgl II对质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。
2) MDR1基因启动子序列的克隆、酶切及纯化 根据人的MDR1基因启动子序列设计两端引物
引物1为上游5'端引物，其中包含18个MDR1基因启动子互补碱基， 一个 Nhel识别位点，2保护碱基；
引物2为上游3'端引物，其中包含16个MDR1基因启动子互补碱基， 一个Bgl II识别位点，2保护碱基；
引物1: 5，-GCGCTAGCCTAGAGAGGTGCAACGGA-3', 弓l物2: 5，-GCAGATCTGCGGCCTCTGCTTCTT-3，
以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增；反应条件为94'C变性 5min;循环为94'C 30s， 52°C 30s， 72'C 30s，共进行35个循环，72'C延伸8min。 反应结束后，取5^1反应产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；取lO(Hil PCR产物， 琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；将回收的PCR产物用Nhe I和BglII双酶切。再次回收以备连接使用。结果显示，克隆得到单一的特异性 条带(图l)。
3) 连接反应
将经过双酶切的pGL3-Basic载体和MDR1基因启动子片段在0.2ml的离心 管中进行连接反应，16'C过夜反应。
4) 筛选重组子
取lOpl连接产物直接转化100nl感受态大肠杆菌。经过含有氨苄青霉素的 LB培养基中选择培养。从转化子的平板上随即挑取10个菌落，扩增培养后用碱 裂解法少量提取质粒备用；经过酶切(图2)、 PCR、测序鉴定。结果显示，重 组载体中含有插入的MDR1基因启动子片段并且未发现有碱基突变。
2、 检测热处理及EGCG对MDR1基因启动子活性的影响 ' 1)细胞的培养
8人结肠癌细胞株敏感型HCT-8和耐长春新碱型HCT-8/VCR培养于含有10 %新生牛血清、100U/ml青霉素、100pg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基(37 °C 5% C02、饱和湿度)中，并使之维持单层贴壁生长。HCT-8/VCR细胞的培 养基中添加2mg^的长春新碱以维持其耐药性。
2) 细胞的药物处理
按5Xl()5个细胞/孔的量在6空板中接种指数生长期的细胞，在37°C 5% C02培养箱中过夜培养，直到细胞到80%汇片。将细胞分别经过热(40°C, 0、 15、 30、 60、 120分钟)和10ng/mlEGCG (0、 3、 6、 12、 24小时)处理。
3) 共转染
在EP管中配置DNA/脂质体符合物如下稀释质粒DNA(比例)至1 ml RPMI 1640-SF中，在涡旋混合器上振荡lmin。然后加入脂质体悬液4 ng/well(6-we11 plates)，再次旋起混匀。在室温温育5-10min，使DNA与脂质体结合。
分别将处理过的的细胞，吸去培养板中的培养液，用RPMI 1640-SF洗一次， 在每个孔中加入1 ml的DNA/脂质体混合物。在37'C 5% C02培养箱中培养 3-5hour。向孔中加入DMEM完全培养液。在37°C 5% C02培养箱中培养 16-24hour。吸去DNA/脂质体/DMEM混合物，每孔加入2 ml新鲜培养液，在37 。C 5% C02培养箱中培养24-48 hour。 4)荧光素酶活性检测
按照试Kenreal剂盒说明书指导配制工作液(工作液l: A液(2 ml) +B液 (40^1)十C液(10^1)混合均匀，用于测定萤火虫荧光素酶活性；工作液2: D液(2 ml) +E液(10 nl)混合均匀，用于测定海肾荧光素酶活性)。转染有 pGL-MDR Vector和pRL-TK Vector的细胞经过一定时间的培养后收集。细胞的 裂解取出培养基，用PBS洗一次。加入裂解液500 jil/孔，室温摇动15 min。 取15-20 nl细胞裂解液于1.5 ml的离心管中。加入工作液l，设定延迟2sec，发 光仪测读10sec。加入工作液2，设定延迟2sec，发光仪测读10sec。
实验结果显示，在耐药细胞中MDR1基因启动子活性高于敏感细胞活性十 余倍。热处理能够明显增强敏感的HCT-8细胞中MDR1基因启动子的活性，而 对耐药的HCT-8/VCR细胞中MDRl基因启动子的活性没有影响。结果M^，热 处理2h后敏感的HCT-8细胞中MDR1基因启动子的活性基本达到耐药的HCT-8/VCR细胞中的水平。EGCG没有改变敏感的HCT-8细胞中MDR1基因启动子的活性，但是，EGCG能够抑制耐药的HCT-8/VCR细胞中MDRl基因启动子的活性。在10mg/ml EGCG处理3h后，MDR1基因启动子的活性既有明显降低，在处理24h后MDR1基因启动子的活性降低至约是HCT-8细胞中活性的二倍。表明本发明的重组质粒可应用于以MDR1基因启动子为靶点的逆转或诱导肿瘤多药耐药药物筛选方法。
权利要求
1、一种含有MDR1基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
2、 权利要求1所述的含有MDR1基因启动子和报告基因的重组质粒的制备方法， 其特征是通过下述步骤-1) 扩增、抽提pGL3-basic和pRL-TK质粒用pGL3-basic质粒转化DH5a感受态细胞，扩增；碱裂解法制备pGL3-basic 质粒，电泳检测质粒的纯度和含量；用NheI和Bgin对质粒进行酶切，试剂盒 凝胶回收大片段的酶切产物2) MDR1基因启动子序列的克隆、酶切及纯化 根据人的MDR1基因启动子序列设计两端引物引物1: 5，-GCO￡I^￡CTAGAGAGGTGCAACGGA-3，， 引物2:5，-GCAQ^EeiGCGGCCTCTGCTTCTT-3，；以基因组DNA为模板，PCR扩增；反应条件为94'C变性5min;循环为94 。C 30s， 52'C 30s， 72'C 30s，共进行35个循环，72。C延伸8min，反应结束后， 取反应产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；取PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后，切 胶，凝胶回收，将回收的PCR产物用NheI和BglII双酶切，回收备用；3) 连接反应将上述经双酶切的pGL-3-Basic载体和MDRl基因启动子片段在离心管中进 行连接反应，16'C过夜反应；4) 筛选重组子取上述连接产物转化感受态大肠杆菌，经含有氨苄青霉素的LB培养基中选 择培养，挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；经酶切、PCR、测序 鉴定。
3、 权例要求1所述的含有MDR1基因启动子和报告基因的重组质粒在耙向 筛选肿瘤多药耐药逆转剂或诱导剂中的用途。
4、 按权例要求3所述的的用途，其特征是其中所述的用途是含有MDR1 基因启动子和报告基因的重组质粒检测MDR1基因抑制剂对MDR1基因表达的中的用途。
5、按权例要求3所述的的用途，其特征是其中所述的用途是所述的含有 MDR1基因启动子和报告基因的重组质粒检测MDR1基因诱导剂对MDR1基因 表达中的用途。
6、按权利要求3的用途，其特征是其中所述的靶向筛选肿瘤多药耐药逆转 剂或诱导剂的方法通过下述步骤1) 细胞培养人结肠癌细胞株敏感型HCT-8和耐长春新碱型HCT-8/VCR培养于含有10 %新生牛血清、100U/ml青霉素、10(Hig/ml链霉素的RPMI1640完全培养基中， 所述的HCT-8/VCR细胞培养基中加2mg/L长春新碱；2) 药物处理细胞按5乂105个细胞/孔的量在6空板中接种指数生长期的细胞，37°C 5% C02 培养箱过夜培养至细胞80%汇片；将细胞分别经过热40°C， 0、 15、 30、 60、 120分钟和lOpg/mlEGCG 0、 3、 6、 12、 24小时处理；3) 共转染稀释质粒DNA比例至1 ml RPMI 1640-SF中，振荡lmin后，加入脂质体悬 液4ng/we11,再旋起混匀，室温温育5-10min，使DNA与脂质体结合，得DNA/ 脂质体符合物；分别将处理过的的细胞，吸去培养板中的培养液，用RPMI 1640-SF洗一次， 每孔中加入1 ml DNA/脂质体混合物，37'C 5% C02培养3-5hour，孔中加入 DMEM完全培养液，37'C 5% 0)2培养16-24hour，吸去DNA/脂质体/DMEM 混合物，每孔加入2ml新鲜培养液，37'C 5% C02培养24-48hour; 4)荧光素酶活性检测配制工作液工作液l: A液2ml+B液40^+C液10nl混合均匀，用于测定萤火虫荧光 素酶活性；工作液2: D液2ml+E液10nl混合均匀，用于测定海肾荧光素酶活性； 转染有pGL-3-M Vector和pRL-TK Vector的细胞经培养后收集； 细胞的裂解取出培养基，PBS洗一次，加入裂解液500 nl/孔，室温摇动,15 min，取15-20 pl细胞裂解液于1.5 ml的离心管，加入工作液1 ，设定延迟2 sec, 发光仪测读10sec;加入工作液2，设定延迟2sec，发光仪测读10sec。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及筛选肿瘤多药耐药逆转剂的方法，该方法是通过克隆多药耐药(MDR1)基因的启动子特异性序列并重组到萤火虫荧光素酶报告基因载体启动序列中，从而构建MDR1报告基因载体。将构建的载体与海肾荧光素酶报告基因载体共转染到敏感和耐药型的结肠癌细胞系中。通过同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性反应MDR1基因启动子启动转录的活性。从而建立靶向筛选肿瘤多药耐药逆转剂的方法。该方法在筛选肿瘤多药耐药逆转剂、研究肿瘤多药耐药逆转剂的作用机理以及研究化疗药物诱导肿瘤细胞产生耐药的机理等方面就有极佳的应用前景。
文档编号C12N15/85GK101481706SQ20081000215
公开日2009年7月15日 申请日期2008年1月12日 优先权日2008年1月12日
发明者于有军, 刘建文, 珏 孙, 孙丽娟, 山冬梅, 文 徐, 房一时, 琦 李, 李长龙, 劲 王, 芳 王, 范忠泽, 许建华, 邓皖利, 鲍文磊 申请人:上海中医药大学附属普陀医院