专利名称：定向积累杀念菌素单一组份fr-008-iii的基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的菌株，特别是一种定向积累杀念 菌素单一组份FR-008-III (Candicidin D)的基因工程菌株。
技术背景链霉菌属原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。 很多聚酮类抗生素产生于这类细菌，并且己广泛应用于医用、兽用及农用，这包 括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)和纳巴霉素(免 疫抑制剂)等。聚酮合酶(PKS)是可以催化合成一大类长度、功能基团和环化状态不同的 聚酮大环内酯类天然产物的多功能酶类。PKS催化模式类似于经典的脂肪酸合成 酶(FAS)的功能模式。聚酮合酶分为I型(Type I PKS)和II型(Type II PKS) 两类。大环内酯类化合物如杀念菌素、红霉素以及夹竹桃霉素等由I型聚酮合酶 负责合成。I型聚酮合酶体系由几个多功能酶组成，每个多功能酶都包含参与聚 酮生物合成过程所需的各种催化功能域，这包括酰基转移酶(AT)、酮基合成 酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)或烯醇还原酶(ER)。其中KS、 AT、 ACP是负责聚酮链延伸所必须的功能域，其余非必须的功 能域(KR、 DH、 ER)则负责聚酮链上功能基团(酮基，羟基，碳碳单键或双键) 的变化。由于每一功能域只参与整个聚酮碳链合成中的一步生化反应，这样聚酮 链的长短以及功能团的变化便取决于聚酮合酶上功能域的数量，种类及其排列组 合。II型聚酮合酶与I型聚酮合酶的差别仅在于前者的功能域在聚酮链延伸的 反应步骤中被重复使用。七烯大环内酯类抗生素杀念菌素(FR-008/Candicidin)由链霉菌FR-008(Str印tomyces sp. FR-008)产生，其合成机制已被阐明，属于典型的I型聚 酮合酶工作模式。文献报道七烯大环内酯类抗生素对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。杀念菌素是治疗人类严重系统性真菌感染最重要的抗生素之一。杀念菌素复合物的主要包含 三个组份FR-008-III (Candicidin D)、 FR-008-V和FR-008-VI，其中以 FR-008-III (Candicidin D)为主要活性组份。根据杀念菌素生物合成模型以及杀念菌素3个组份的结构差异，推测杀念 菌素生物合成过程中的两个催化功能域(KR21和DH18)的非完全活性可能导致 了杀念菌素3个组份的同时生成。通过在染色体上定点突变的方法使KR21和 DH18功能域失去催化活性，从而得到相应的突变株。对突变株发酵产物的高压 液相和质谱分析(LC-MS)结果印证了这一推论，即KR21功能域的突变失活导致 了 FR-008-V的丢失；DH18功能域的突变失活导致了 FR-008-VI的丢失；KR21和 DH18功能域均突变失活后，仅定向积累FR-008-III (Candicidin D)。发明内容本发明的目是获得能单一积累杀念菌素复合物中最具药用价值的定向积累 杀念菌素单一组份FR-008-ni的基因工程菌株，使得本发明可以大规模生产高 纯度的杀念菌素有效组份。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在杀念菌素产生菌链霉菌 FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮 合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位 点均发生了突变，KR21突变为聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸突变为苯丙氨 酸；DH18突变为聚酮合酶FscE第3084位组氨酸突变为酪氨酸以及第3083位 天冬氨酸突变为缬氨酸。该基因改造所得到的工程菌株ZYJ-6仅生产杀念菌素活 性组份FR-008-111，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。该基因工程菌株的构建方法 (一)确定功能域KR21 (存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶 FscE)的催化活性位点。(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位 点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572。(三)把pJTU573通过接合 转移导入菌链霉菌FR-008进行同源重组。(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛 选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株。(五)同样方法，把pJTU572导入KR21突变株进行同源重组，最终筛选 到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。本发明定向生产杀念菌素单一组份FR-008-III,其产量是野生型菌株该组 份产量的120-130%，而FR-008-III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值 的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份，所以具有显 著的工业应用价值。本发明定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其工程菌 ZYJ-6己提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏登记编号 为CGMCC NO. 2394，保藏期限为2008. 03. 07日起的30年。
图1:突变株ZYJ-6和野生型菌株(链霉菌FR-008)之间的衍生关系。KR21 属于聚酮合酶FscF的一个功能域。聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸(Y)突变为 苯丙氨酸(F)，从而导致功能域KR21活性位点发生了突变。DH18属于聚酮合 酶FscE的一个功能域。聚酮合酶FscF第3084位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y) 以及第3083位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)，从而导致功能域DH18活性位 点发生了突变。突变株ZYJ-6则包含了上述功能域KR21和DH18的双突变。星号 表示突变后的功能域。Apol和BsrGI分别代表突变后引入的限制性酶切位点。 方框内的碱基序列表示限制性酶识别序列。图2:突变株ZYJ-6和链霉菌FR-008野生型菌株发酵产物的HPLC (高压液 相)检测结果。V， III以及VI分别代表FR-008-V， FR-008-III和FR-008-VI。 ZYJ-6突变株仅生产FR-008-in，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保 护范围不限于下述的实施例。实施例一通过先引入KR21突变后再引入DH18的突变从而获得双突变株 ZYJ-6(一)质粒的构建(用于导入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变)(1)用于KR21功能域突变的质粒构建EcoRI和Kpnl酶解链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220后回收3615-bp EcoRI-KpnI DNA片段作为PCR模板，引物Pl和P3用来扩增528-bp DNA片段； P4和P2用来扩增618-bp DNA片段。P3和P4有18-bp的重叠，在该重叠区域引 入突变位点(Y1526F),同时引入DNA限制性酶切位点(ApoI)以便该突变的筛 选(如图l所示)。通过第二次PCR (引物为P1和P2;模板为琼脂糖胶回收后的 两个PCR产物各取1/100加入PCR体系)得到1146-bp DNA片段。1146-bp DNA 片段被克隆在T-vector (得到质粒pJTU566)上并经过测序确认正确后又被酶解 成849-bp SacI-Sf il DNA片段。849-bp SacI-Sf il DNA片段被用来替换3615-bp EcoRI-Kpnl DNA片段(由EcoRI-Kpnl酶解pHZ220后回收得到，并克隆在pIJ2925 载体上而得到质粒pJTU569)内部对应的区域从而得到质粒pJTU571。重组后的 3615-bp EcoRI-Kpnl DNA片段包含了目标突变位点和分布于突变位点两边的用 于和染色体发生同源交换的两个臂(分别为1948-bp和1667-bp)。该3615-bp DNA重组片段最终被克隆在pHZ1358 (大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒)BamHI位点， 从而得到用于和染色体发生同源重组的质粒pJTU573。PCR反应引物PI, 5' -CCGCCTCACCCAACTGCC-3' P3， 5' -GCGACGAAATTTGCCTGGCCG-3' P4, 5，-CCA GGCAAATTTCGTCGCCGC-3'P2, 5'-GGGGAG CCGCTGTCGTAGA-3'(下划线表示引入的限制性酶切位点 Apol)PCR反应体系0. 1 模板DNA，引物各50 pmol， 4 W DMSO， 2 W Mg2+ ， 5 W dNTP， 5 W缓冲液和1个单位KOD DNA聚合酶(TOYOTA)，加纯水到50 Pl。 PCR反应的循环条件为95°C (5分钟)；32个循环的95°C (30秒)，60°C (306秒)和68。C (36秒)；最后是68。C 5分钟。(注引物为Pl和P2的第二轮PCR 延伸时间为66秒)。PCR产物末端加A (以便于克隆在T-Vector)碱基的条件为50 PCR产 物，5 W dATP， 2个单位Tag DNA聚合酶，5 W缓冲液，2 W Mg2+，加纯水至 50 Pl. 72°C 20分钟。(2)用于DH18功能域突变的质粒构建用于DH18功能域活性位点相应编码碱基突变的两个同源交换臂分别由PCR 扩增获得。PCR模板为链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220的DNA。扩增1475-bp DNA片段所用引物为DH18P1和DH18P2;扩增1203-bp DNA片段所用引物为 DH18P3和DH18P4。突变位点分别通过引物DH18P2和DH18P3引入，同时又引入 限制性酶切位点BsrGI以便于突变筛选(如图1所示)。1475-bp PCR产物插入 pBluescript II SK(+) EcoRV位点后得到质粒pJTU568,并进行了测序验证。 1203-bp PCR产物克隆在T-Vector上而得到质粒pJTU565,并进行了测序验证。 从pJTU565酶解得到的1. 2 kb BsrGI-Kpnl DNA片段被插入到pJTU568相应位点 后得到质粒pJTU570，从而使得两个同源交换臂在BsrGI位点拼接.该2. 6 kb 重组片段又被BamHI从pJTU570上切出，进而又插入到pHZ1358载体BamHI位点 而得到同源重组质粒pJTU572。PCR引物DH18P1， 5，-GACACGGAGTCCCCCGAGCCCCAGG-3' DH18P2， 5， -CCG ACGGTGTACACGGCGAGCCAGG -3' DH18P3， 5，-CCTGGCTCGCCGTGTACACCGTCGG-3'DH18P4, 5'-CGCCCGAGAGCGGACCGAGGAGTTG-3'(下划线表示引入的限制性酶 切位点BsrGI) PCR条件1475-bp PCR产物(引物为DH18P1和DH18P2)由KOD DNA聚合酶 (TOYOTA)扩增。PCR反应体系同上。PCR反应的循环条件为95°C (5分钟); 32个循环的95 °C (30秒)，57°C (30秒)和68 °C (90秒)；最后是68 °C 5分钟。1203-bp PCR产物(引物为:DH18P3和DH18P4)由Tag DNA聚合酶扩增。PCR条件PCR反应体系0. 1 Pg模板DNA，引物各40 pmol， 3 W DMSO, 2 Pi Mg2+ ， 3 W dNTP， 4 W缓冲液和1个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到40 W。 PCR反 应的循环条件为95°C (5分钟)；32个循环的95。C (30秒)，60°C (30秒)和 72°C (20秒)；最后是72。C 5分钟。(二) 把用于和染色体发生同源重组的质粒导入野生型宿主 通过电转把PHZ1358衍生质粒(pJTU572或pJTU573)分别导入大肠杆菌ET12567 (携带接合转移辅助质粒pUZ8002)中，以便于pJTU572或pJTU573在辅助 质粒pUZ8002的协助，通过接合转移进入受体链霉菌FR-008细胞中。先在合适 的抗生素存在下培养携带pUZ8002和待转移质粒的大肠杆菌，12小时后收集菌 体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预 萌发处理。将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(5ml 0.05mol/L， pH8.0)中，在 5(TC水浴中热激5min，冷却至室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基(Difco 酵母粉1%， Difco酪蛋白氨基酸1%， CaCl2 0.01mol/L)， 37。C摇床(250rpm)培 养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按108:108与大肠 杆菌细胞等量混合后涂在培养平板(2%琼脂糖，2%甘露醇，2%黄豆饼粉， pH7.2 7.5)上，进行细菌双亲接合转移。11小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆 菌的生长)和硫链丝菌素(导入质粒带有此抗性)的lml无菌水覆盖平板(终浓 度萘啶酮酸50ng/mL;硫链丝菌素25 ng/mL)，置3(TC培养3天后即可看到 转移接合子。(三) 突变株的筛选和验证 从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到抗性(硫链丝菌素)平板上进一步确认抗性，再转接到不加抗生素(硫链丝菌素)的平板上进行松弛培养，进而通 过抗性平板和非抗平板影印实验筛选到若干硫链丝菌素敏感的菌株(突变株的备 选株)。以备选株总DNA作为PCR模板；引物Pl和P4用于KR21突变的筛选， 1146-bp源自于突变株KR21突变的PCR产物可以被ApoI酶解为528-bp和618-bp DNA片段，而源自于野生型的同样大小PCR产物不能被Apol酶解；引物DH-test-L 和DH-test-R用于DH18突变的筛选，706_bp源自于DH18突变的PCR产物可以 被BsrGI酶解为244-bp和462_bp DNA片段，而源自于野生型的PCR产物不能被BsrGI酶解。源自于KR21突变和DH18突变的PCR产物被分别克隆在T-Vector 上进行测序验证，从而最终确证了目标突变的正确性。KR21突变株PCR筛选条件弓1物P1禾口P4。PCR反应体系:0.05 Pg模板DNA，引物各20 pmol， 1 W DMSO, 1 W Mg2+， 2 Hi dNTP， 2 W缓冲液和0. 5个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到20 Pl。 PCR 反应的循环条件为95°C (5分钟)；32个循环的95°C (30秒)，60°C (30秒) 和72'C (22秒)；最后是72°C 5分钟。DH18突变株PCR筛选条件引物DH-test-L， 5'-GCTCTACCGTCCGCTTCGCC-3' DH-test-R， 5， -CTGTGTCCAGGTGGCGTCCG-3，PCR反应条件复性64'C，延伸15秒.其余同KR21突变株筛选.(四) 双突变株(ZYJ-6)的获得先把同源重组质粒pJTU573通过接合转移导入链霉菌FR-008细胞中发生同 源重组，筛选并得到KR21突变株。再把质粒pJTU572导入KR21突变株细胞内通 过同源重组对DH18进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。(五) 突变菌株的发酵培养平板发酵2%琼脂糖，2%甘露醇，2%黄豆饼粉(煮沸熬制后过滤去渣)， pH7.2 7.5，孢子接种，30°C， 6天。 (六)抗生素的分离纯化刮取平板孢子，称量后用10倍体积甲醇超声萃取3次。合并萃取液4(TC旋 转蒸干后重溶于少量体积甲醇，0. 25uM滤膜过滤后-2(TC避光保存以备检测。 (七)LC-MS对发酵产物检测高压液相色谱-质谱联用(LC一MS)检测结果表明突变株ZYJ-6仅生产 FR-008-III (Candicidin D)，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。 HPLC检测结果如图2所示。LC一MS是在安捷伦公司的Agilent 1100 series LC/MSD Trap system上进 行。高压液相工作条件为柱子(agilent Eclipse XDB-C18， 4.6X250 mm);流速0. 6 ml/min;流动相45%乙晴和55% 5. 5 mM NH4AC (pH 4. 5);检测波长 380 nm;柱温25°C。质谱工作条件负离子模式；干燥气流10 1/min;喷雾器压力50psi; 干燥气温350°C;轰击电压1. 0-1. 8 V。实施例二先把同源重组质粒pJTU572通过接合转移导入链霉菌FR-008细胞中发生同 源重组，筛选并得到DH18突变株。再把质粒pJTU573导入DH18突变株细胞内通 过同源重组对KR21进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。
权利要求
1.一种定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其特征在于，在杀念菌素产生菌链霉菌FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，所述的菌种保藏编号为CGMCC NO2394。
2. 根据权利要求l所述的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-I11的基因工 程菌株，其特征是，所述的KR21突变为聚酮合酶FscF上第1526位酪氨酸突 变为苯丙氨酸。
3. 根据权利要求l所述的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-I11的基因工 程菌株，其特征是，所述的DH18突变为聚酮合酶FscE上第3084位组氨酸突 变为酪氨酸以及第3083位天冬氨酸突变为缬氨酸。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III(Candicidin D)的基因工程菌株。在染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，KR21突变为第1526位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)；DH18突变为第3084位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)以及第3083位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)。本发明定向生产杀念菌素单一组份FR-008-III，其产量是野生型菌株该组份产量的120-130％，而FR-008-III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份。
文档编号C12P19/00GK101260380SQ20081003582
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月10日 优先权日2008年4月10日
发明者周永军, 李家良, 由德林, 白林泉, 邓子新 申请人:上海交通大学