一种星形孢菌素提取纯化的方法

文档序号:596428阅读:812来源:国知局

专利名称::一种星形孢菌素提取纯化的方法
技术领域
:本发明涉及一种星形孢菌素提取纯化的方法。
背景技术
:星形孢菌素(staurosporine,以下简称STS)—种广谱非特异性蛋白激酶C抑制剂,可强有力地抑制蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)。可用于抵抗酵母和真菌引起的许多感染性疾病,抑制细胞增殖,诱导细胞程序性死亡,废除细胞周期检査点,抑制血管增生等。还具有极强的抗肿瘤活性,在临床上对12种人肿瘤细胞平均ICs。为0.016pg/ml(U.S.Patent4735039)。另外,STS的衍生物UCN-01等作为抗肿瘤药物已经进入临床二期(EP0238011Bl,EP0575955Al)。U.S.Pat.No.4,107,297描述了从放线菌AM-2282发酵液中提取STS的工艺。方法为发酵液用氨水调节发酵液pH10.0,再用乙酸丁酯萃取,乙酸丁酯相转移到0.1N盐酸中,萃取后,用氨水调节水相pH为10.0,然后用乙酸乙酯萃取两次,合并萃取相加入充水硫酸钠干燥,然后真空浓縮,硅胶柱(Merk,KiesdgelG)层析分离,洗脱剂为氯仿甲醇(60:1,v/v),生物碱跟碘化铋钾发生颜色反应,利用薄层层析检测(氯仿甲醇=10:1)。收集生物碱部分,并真空浓縮干燥得到淡黄色粉末。粉末利用氯仿甲醇(50:1,v/v)重结晶得到淡黄色针状晶体。该工艺操作复杂,收率很低,最终获得的产品很少。Morioka等描述了从发酵液中提取STS的工艺(参考文献Morioka,H.,Ishihara,M.,Shibai,H.&Suzuki,T.Staurosporine-induceddifferentiationinahumanneuroblastomacellline,NB國l.所o/.CA亂1985,49,1959-1963)。4萃取液真空浓縮,浓縮物用乙酸乙酯萃取,然后上两次硅胶柱层析纯化,两次重结晶,得到STS。此方法操作容量有限,耗时多,收率低,也不适应于生产。
发明内容因此,本发明要解决的技术问题就是针对现有的星形孢菌素提取纯化的方法存在的高纯度和高收率不能兼得的不足,提供一种不但产品纯度高,而且收率也较高的星形孢菌素提取纯化的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是,一种星形孢菌素提取纯化的方法,可包含以下步骤1)将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性,然后离心、取上清;2)上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取;3)萃取液浓缩后,进行硅胶柱层析。根据本发明,步骤l)将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性,然后离心、取上清。所述的提取液较佳的为星形孢菌素产生菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取所得,此步骤可采用现有技术,如上述Morioka的工艺。其中,所述的碱性条件为pH8.0-14.0,较佳的为pH10.013.0,更佳的为pH12.0,可以加入氨水或氢氧化钠达到上述碱性条件。星形孢菌素产生菌菌体较佳的可由星形孢菌素产生菌的发酵液离心而得,通常选用湿菌体即可。提取时采用的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液的用量较佳的为星形孢菌素产生菌的发酵液体积的0.5倍以上,或者其用量可以使星形孢菌素产生菌菌体在其中的浓度不超过1g/ml。所述的亲水性有机溶剂较佳的可选自醇、酮和四氢呋喃。所述的醇较佳的为Cw的低级脂肪醇,更优选自甲醇和乙醇。所述的酮较佳的为丙酮。所述的亲水性5有机溶剂的水溶液较佳的可为85100%甲醇水溶液、85~100%乙醇水溶液或85~100%丙酮水溶液,更佳的可为90°/。的甲醇水溶液、90%的乙醇水溶液或95%的丙酮水溶液,上述百分比为重量百分比。所述提取液更佳的可以是星形孢菌素产生菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取两次或多次所得。该提取液在除去其中的亲水性有机溶剂后加入酸溶液至酸性,所述酸溶液较佳的可选自盐酸和草酸,优选0.1N盐酸。所述酸性较佳的为pH15,优选pH23。根据本发明,步骤2)将得到的上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取。较佳的所述的亲脂性有机溶剂可选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯和丙酸甲酯。所述的碱性条件为pH8.014.0,较佳的为pH10.0~13.0,更佳的为pH12.0。可以加入氨水或氢氧化钠到上述碱性条件。根据本发明,步骤3)将所得的萃取液浓縮后,进行硅胶柱层析。较佳的所述的萃取液加入无水硫酸钠除去水分,蒸馏除去有机溶剂后进行硅胶柱层析。所述的硅胶柱层析较佳的包括步骤用体积比为100:150:l的氯仿-甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱,分步收集洗脱梯度为60:1的目标物。较佳的用薄层层析-碘化铋钾跟踪检测。本发明的星形孢菌素提取纯化的方法较佳的还可以包括将硅胶柱层析得到的目标物进行浓縮或重结晶的步骤。本发明上述步骤2)的亲脂性有机溶剂萃取、步骤3)硅胶柱层析及浓縮或重结晶等的方法均可采用现有技术,如
背景技术
中提及的两份文献中公开的星形孢菌素分离纯化过程中的相应技术。本发明的上述各个步骤,如步骤2)的亲脂性有机溶剂萃取,步骤3)的硅胶柱层析,以及其后的浓縮或重结晶步骤等都可以重复两次或多次,以得到更好的结果。本发明所述的各原料或试剂均市售可得。相比于现有技术,本发明的优点是-成本低,周期短,方法简单,易于掌握,高。本发明星形孢菌素提取纯化的方法不但产品纯度高,而且产品收率也具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。下述的内容中除特别说明之外,所用的百分比都是重量百分比。实施例1将&cc/araf/w^A:aeraco/om^gew&ssw6平加wrawweaCGMCC4.1708(购于中国普通微生物菌种保藏中心)种子取出活化后接种斜面培养基(ISP4培养基可溶性淀粉1.0%、K2HP040.1%、MgS04'7H200.1%、&aCl0.1%、(NH4)2SO40.2%、CaCO30.4%,余量为水,pH7.2,121。C灭菌20min),将接种菌种的斜面置于28。C恒温培养箱中,培养10天,得到成熟的孢子,然后成熟的孢子接种于装有30ml种子培养基(葡萄糖2.0%,蛋白胨0.5%,牛肉膏0.5%,酵母粉0.3%,CaCO30.4%,余量为水,pH7.0,121。C灭菌20min)的250ml摇瓶中,在28。C、220rpm摇床上培养3天,得到成熟的种子,得到的种子以5%的接种量接入装有100ml发酵培养基(葡萄糖3.0%,大豆饼粉2%,碳酸钙0.4%,余量为水,pH7.0)的750ml摇瓶中,置于28°C、220rpm摇床继续培养60小时,得到发酵液。1L发酵液离心(转速4000rpm,时间10分钟)处理,弃上清液。湿菌体0.45kg先加入lL的甲醇,用0.1N氢氧化钠调节pH值12.0,常温搅拌浸泡2小时后过滤,菌体再用0.5L的甲醇以同样方法再提取一次。两次提取得到的滤液混合,蒸馏除去滤液中的甲醇,得到浓縮液。在浓縮液中加入200ml0.1NHC1,使溶液的pH值为3,搅拌,离心,取上清。然后再加入100ml0.1NHCl,使溶液的pH值为3,重复上述操作。合并所有上清液,调节pH值至12.0,然后分别用300ml和200ml乙酸乙酯萃取两次,合并所有的萃取液,加入10g无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去乙酸乙酯至淡黄色油状物。油状物用乙酸乙酯充分溶解后上硅胶柱层析,用体积比为100:1~100:20的氯仿-甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱,流速为0.3ml/min,分步收集。用薄层层析-碘化铋钾跟踪检测,当洗脱梯度为60:1时目标物流出。收集含目标物的洗脱液,真空浓縮得到淡黄色粉末,室温下用氯仿热溶,4°C冷却过夜结晶,得到纯度为96.1%的化合物19.8mg。换算成收率为61%。实施例2菌体先用1.5L卯。/。(wt)甲醇溶液提取,再用0.6L90。/。(wt)甲醇溶液溶液提取,萃取所用的亲脂性有机溶剂为氯仿,其他同实施例1,最后得到94.5%纯度的产物17.31mg。换算成收率为52.4%。实施例3菌体先用95。/。(wt)乙醇溶液提取两次,用量分别为1.5L、0.6L,其他同实施例l,最后得到纯度89.3%的产物19.93mg。换算成收率为57.06%。实施例4菌体先后用1.5L、0.8L95Q/。(wt)丙酮溶液提取两次,其他同实施例1,最后得到纯度94.1%的产物13.17mg。换算成收率为39.7%。实施例5菌体先用85。/。(wt)乙醇溶液提取两次,用量分别为l.OL、0.5L,其他同实施例2,最后得到纯度91.3n/。的产物17.93mg。换算成收率为52.5%。实施例6菌体先用四氢呋喃在pH8.0条件下提取两次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的四氢呋喃后,加入0.1N盐酸溶液至酸性为pH3.0,搅拌,离心,取上清。上清液调节至pH值lO.O,用乙酸丁酯萃取。其他同实施例l,最后得到纯度94.1%的产物9.34mg。换算成收率为29.8%。实施例7菌体先用90。/。(wt)的乙醇水溶液在pH14.0条件下提取两次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的有机溶剂后,加入0.1N盐酸溶液至酸性为pHl.O,搅拌,离心,取上清。上清液调节pH值14.0,用氯仿萃取。其他同实施例l,最后得到纯度92.24。/。的产物18.67mg。换算成收率为55.21%。实施例8菌体先用乙醇在pH10.0条件下提取两次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的有机溶剂后,加入草酸溶液至酸性为pH4.0,搅拌,离心,取上清。上清液调节pH值10.0,用二氯甲烷萃取。其他同实施例l,最后得到纯度93.5°/。的产物17.31mg。换算成收率为51.89%。实施例9菌体先用85。/。(wt)的甲醇水溶液在pH13.0条件下提取一次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的有机溶剂后,加入0.1N盐酸溶液至酸性为pH5.0,搅拌,离心,取上清。上清液调节pH值13.0,用乙酸丙酯萃取。其他同实施例1,最后得到纯度92.91%的产物15.24mg。换算成收率为45.39%。实施例10菌体先用85。/。(wt)的丙酮水溶液在pH12.0条件下提取两次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的有机溶剂后,加入0.1N盐酸溶液至酸性为pH2.0,搅拌,离心,取上清。上清液调节pH值12.0,用丙酸乙酯萃取。其他同实施例1。最后得到纯度89.37%的产物14.26mg。换算成收率为40.86%。实施例11菌体先用乙醇在pH12.0条件下提取两次。提取得到的溶液混合,蒸馏除去溶液中的有机溶剂后,加入0.1N盐酸溶液至酸性为pH3.0,搅拌,离心,取上清。上清液调节pH值12.0,用丙酸甲酯萃取。其他同实施例1。最后得到纯度89.24%的产物14.91mg。换算成收率为42.66%。实施例124L同实施例1的发酵液分成4份,取其中一份进行如下操作。9发酵液离心(转速4000rpm,时间10分钟),弃掉上清,收集菌体。加入500ml甲醇,用氨水调节pH12.0,室温搅拌lh,过滤,用100ml甲醇重新洗涤滤饼并过滤,合并滤液,真空浓縮除去甲醇,得到100ml左右浓縮液。在浓縮液中加入1/2体积0.1NHC1,搅拌,离心,取上清。调节上清液pH为12.0,加入乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯萃取相,加入无水硫酸钠除水。然后蒸馏除去乙酸乙酯,得到淡黄色油状物。油状物中STS含量为84%(wt)左右。油状物用乙酸乙酯充分溶解后上硅胶柱层析,用不同比例的氯仿-甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱,流速为0.3ml/min,分步收集。用薄层层析-碘化铋钾跟踪检测,当洗脱梯度为60:1时目标物流出。将收集的洗脱液真空浓縮得到淡黄色粉末,室温下用氯仿热溶,4'C冷却并静置过夜,得到淡黄色针状晶体。纯度为96.5%,收率为64.9%。实施例13取实施例12中4份发酵液中的另一份进行如下操作。菌体先后用500ml和100ml丙酮提取,其他步骤同实施例1。即实施例1中,除菌体先后用500ml和100ml甲醇提取的步骤中所用的甲醇被丙酮代替外,其他步骤都与实施例2相同。对比例1U.S.Pat.No.4,107,297描述的酸碱提取法。取实施例12中4份发酵液中的第三份进行如下操作。发酵液用氨水调节pH值lO.O,加入500ml乙酸乙酯萃取,静置分液,离心,分出有机相;在有机相中加入250mL0.1NHCl,萃取水相。再用稀氨水调水相pH值为10.0,并用100mL的乙酸乙酯抽提两次,分液漏斗除去水相,加无水硫酸钠脱水后,减压蒸馏浓縮有机相至浆状粗提物,粗提物中STS含量为75。/。(wt)左右。粗提物用乙酸乙酯充分溶解后上硅胶柱层析,用不同比例的氯仿-甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱,收集含目标化合物的洗脱液,浓縮,结晶,得到化合物。纯度为94.5%,收率为35.2%。对比例2Morioka描述的甲醇提取法取实施例12中4份发酵液中的最后一份进行如下操作。发酵液离心,菌体先后用500ml和300ml甲醇提取,然后将所有甲醇溶液合并,减压浓縮除去甲醇后,得到100ml左右浓縮液,浓縮液用乙酸乙酯萃取,在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠脱水,减压浓縮至浆状物。浆状物中STS含量为55。/。(wt)左右,杂质很多。桨状物用乙酸乙酯溶解后上硅胶柱层析一次,但仍有较多杂质不能分离,因此纯度较低。实施例12是本发明的甲醇-酸碱处理提取。实施例13本发明的丙酮-酸碱处理提取。对比例1是U.S.Pat.No.4,107,297描述的酸碱提取法。对比例2是Morioka描述的甲醇提取法。这四种提取方法的结果见表1,有表可知本发明的两种方法的提取效果明显的要好于两种现有的提取方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种星形孢菌素提取纯化的方法,其特征在于,包含以下步骤1)将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性,然后离心、取上清;2)上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取;3)萃取液浓缩后,进行硅胶柱层析。2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的提取液为星形孢菌素产生菌菌体在碱性条件下用亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取所得。3、根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的星形孢菌素产生菌菌体由星形孢菌素产生菌的发酵液离心所得。4、根据权利要求3所述的方法,其特征在于,提取时采用的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液的用量为星形孢菌素产生菌的发酵液体积的0.5倍以上。5、根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述的亲水性有机溶剂选自醇、酮和四氢呋喃。6、根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的醇选自甲醇和乙醇,所述的酮为丙酮。7、根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的亲水性有机溶剂的水溶液为85~100%甲醇水溶液、85~100%乙醇水溶液或85~100%丙酮水溶液,上述百分比为重量百分比。8、根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的亲水性有机溶剂的水溶液为90%的甲醇水溶液、90%的乙醇水溶液或95%的丙酮水溶液,上述百分比为重量百分比。9、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的酸性为pHl~5。10、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤l)所述的酸溶液选自盐酸和草酸。11、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述的亲脂性有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲垸、乙酸丙酯、丙酸乙酯和丙酸甲酯。12、根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述的碱性条件为pH8.014.0。13、根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述的碱性条件为pH10.0~13.0。14、根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的碱性条件为pH12.0。15、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述的硅胶柱层析包括步骤用体积比为100:1~50:1的氯仿-甲醇混合液为洗脱剂进行梯度洗脱,分步收集洗脱梯度为60:l的目标物。16、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括将硅胶柱层析得到的目标物进行浓縮或重结晶。全文摘要本发明公开了一种星形孢菌素提取纯化的方法,包含以下步骤1)将星形孢菌素产生菌菌体的亲水性有机溶剂或亲水性有机溶剂的水溶液提取液除去有机溶剂后加入酸溶液至酸性,然后离心、取上清;2)上清在碱性条件下用亲脂性有机溶剂萃取;3)萃取液浓缩后,进行硅胶柱层析。本发明星形孢菌素提取纯化的方法成本低,周期短,方法简单,易于掌握,不但产品纯度高,而且产品收率也高。文档编号C12P17/18GK101580515SQ20081003751公开日2009年11月18日申请日期2008年5月16日优先权日2008年5月16日发明者琴张,张海红,胡海峰申请人:上海医药工业研究院
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