专利名称：能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物性别签定的特异性能标记，尤其涉及一 种能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，利用这些分子标记可以快速有效地鉴定海带 配子体性别，也可运用于单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别的鉴定。
背景技术：
对于大多数植物来说，性别鉴定主要是通过植物的外部形态、生理生化差异、化学药 剂处理、同工酶图谱、特异蛋白、染色体组型、核酸等方面来进行的。随着分子生物技术 的发展，特别是分子标记技术的日趋成熟，使得分子标记在植物性别鉴定中的作用显得越 来越重要。因为分子标记能够直接从基因组DNA水平上来反映植物的差异，其测定过程 不受植物发育阶段和时间的影响，极大地提高经济效益。
自1974年Grozdicker等人首创第一代DNA分子标记——限制性片断长度多态性标 记(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)以来，各种分子标记如雨后春黄般 地发展起来，到目前为止，已经发展到近几十种。如随机扩增产物多态性DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA， RAPD)、简单重复序列[(Simple Sequence Repeat, SSR，又 称微卫星(Microsatellite)序列)]、表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)、扩增 的限制性片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、锚定简单序 列重复(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)、单链构象多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism, SSCP) 等，这些标记技术在植物分子遗传图谱构建、植物遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺 性状基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种等方面发挥重要作 用。目前，用于鉴定植物性别的分子标记主要有RAPD、 AFLP、 SSR等。
但是在藻类上利用分子标记鉴定其性别的报道非常少。在藻类研究领域中，Haring 等利用衣藻(C/z/amyc/omomw ewgameto)性别相关的一些性状，构建了一个具有15个RAPD 标记，3个形态学标记和一个RFLP标记的部分连锁图谱，为运用遗传图谱研究与性相关 的性状工作打下了基础。Martinez等利用RAPD来鉴定红藻门江蓠属江蓠(Gra"7an'" grac/fc)的性别，利用OPD13 (5，-TCGTCACCCC-3，) 一条引物就同时在江蓠雌、雄个体 中扩增出两个差异片断，并成功地应用于早期性别鉴定。
海带具有明显的世代交替生活史。大型的孢子体阶段即双倍体阶段，海带雌雄同体。微型的配子体阶段，即从游孢子的放散到雌、雄配子体的形成，以及精、卵的排出，这是 海带的单倍体阶段，雌雄异体，进行有性生殖。目前，国内外尚无有关海带雌雄性子体特 异性分子标记的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，为海带配子体 性别鉴定、单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别鉴定以及从细胞或分子水平上研究 海带性别分化等问题提供依据。
本发明利用特别设计的两对引物Rf(SEQ.ID.N01)和引物Rm(SEQ.ID.N02)，分别对海 带雌、雄配子体中提取的DNA进行PCR扩增。结果表明，用引物Rf进行扩增，从海带 雌配子体基因组DNA扩增产物中得到一条大约800bp的特异条带(见图l所示)，而且，此 谱带仅在海带雌配子体基因组DNA扩增中出现，在海带雄配子体基因组DNA中没有此扩 增条带，有非常好的重复性。用引物Rm进行扩增，从海带雄配子体基因组DNA扩增产 物中得到一条大约250bp的特异条带(见图2所示)，而且此谱带仅在海带雄配子体基因组 DNA扩增中出现，在海带雌配子体基因组DNA扩增中没有此扩增条带，有非常好的重复 性。
经测序，海带雌配子体特异条带的大小为763bp，序列为SEQ.ID.N03，作为海带雌 配子体特异性分子标记，记为Rf-763。海带雄配子体特异条带的大小为239 bp，序列为 SEQ.ID.N04，作为海带雄酏子体的特异性分子标记，记为Rm-239。
本发明所提出的可以辨别海带雌、雄配子体的特异性分子标记的获得步骤如下.-(1)在17士1。C、 30-40 pmolm々^光照条件下培养海带雌、雄性配子体无性繁殖系， 收集并提取配子体的基因组DNA;
(2) 根据GenBank上序列登录号为EU663626和EU663627的海带雌、雄配子体//zc/B 基因的5，-侧翼序列设计两对引物SEQ.ID.N01和SEQ.ID.N02，分别对海带雌、雄配子体 基因组DNA进行PCR扩增；
(3) 回收特异扩增片段的DNA。利用购于Takara公司的pMD19-T载体、大肠杆菌 (五"/ en'c/n'a co/0感受态菌株JM109,进行克隆(根据Takara公司连接转化试剂盒说明书)；
挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小，将含有目的片段的菌液进行 测序，获得两个特异分子标记，记为Rf-763和Rm-239，前者为海带雌配子体特异性分子 标记，后者为海带雄配子体特异性分子标记，见图1和图2所示，它们的序列分别是 SEQ.ID.N03和SEQ.ID.N04。
本发明提出的辨别海带雌、雄配子体的特异性分子标记，可用于海带配子体性别鉴定、 单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定，也可以用于从细胞或分子水平上研究海带性别分化等问题。
图l 海带雌配子体特异分子标记Rf-763电泳图谱。M: DL250DNA大小标准；O泳道
空白对照；l-10泳道雌配子体；11-20泳道雄配子体。
图2海带雄配子体特异分子标记Rm-239电泳图谱。M: DL250 DNA大小标准；O泳道
空白对照；l-10泳道雌配子体；11-20泳道雄配子体。
具体实施例方式
1) 取鲜重为0.1 g的海带配子体无性繁殖系。
2) 在液氮中轻柔地将配子体无性繁殖系研磨成粉末后，立即转移入预热的0.6 ml CTAB提取缓冲液中，该缓冲液中含有重量体积比为3%的CTAB、 1.4 M NaCl、 20 mM EDTA、 10 mM pH为7.8的Tris-HCl和重量体积比为2%的巯基乙醇，于涡旋混匀仪上混 勻1 min。
3) 在65 。C水浴锅中温浴30-60 min，每5 min动作轻缓地颠倒摇动1次。
4) 加入等体积的体积比为24:1的氯仿:异物醇混合液，轻轻颠倒混匀3-5 min，至出现 乳化层为止。
5) 在室温下12 000rpm (转/分钟)离心10min，上清液转移到另一灭菌的离心管中。
6) 向离心管中加入2/3体积-20。C下预冷的异丙醇，颠倒混匀，至出现沉淀为止。
7) 于-20 。C下放置15 min左右后，0-4 。C下8 OOOrpm离心10 min。
8) 沉淀于70%乙醇洗涤并在无菌操净台中通风干燥后，溶解于200 ^灭菌的TE缓冲 液中，该缓冲液内含有1 mM EDTA和10 mM且pH值为8.0的Tris-HCl。
9) 待完全溶解后加入1/3体积的7.5 M的醋酸铵和2倍体积-20 。C下预冷的无水乙醇。 颠倒混匀，至出现沉淀为止。
10) -20 。C下放置30 min以上，0-4 。C下12 000rpm离心10 min后，再用70%的乙醇 洗涤沉淀。最后将沉淀溶解于40-100 nl左右的TE缓冲液中，-20。C保存备用。
11) 根据GenBank数据库中登录号为EU663626和EU663627的海带雌、雄配子体中/&/6 基因5'-侧翼序列设计两对引物SEQ.ID.N01和SEQ.ID.N0.2，利用下列反应体系和反应程序 对海带雌、雄配子体基因组DNA进行特异性扩增。20pl反应体系包含50mMKCl、 10 mM pH为8.3的Tris-HCl缓冲液、2.5mMMg2+、 100nMdNTPs、 0.2pM引物、1.0U7hgDNA聚 合酶及50ng模板DNA。扩增程序包括94 。C预变性5 min，紧接着按94 。C变性30 s、 57。C退 火45s、 72。C延伸l min这个程序进行30个循环，最后72。C延伸10 min。扩增结果在1.5%的 琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察并拍照。12)使用购于上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，参照试剂 盒实验步骤说明操作。将海带配子体性别特异扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳， 使雌、雄差异片段与其他扩增尽可能分开，然后用干净的刀片割下差异片段，放入2.0ml 离心管中。
13) 每100mg凝胶加入700 pl吸附缓冲液，置于50-60 。C水浴中15min，使凝胶彻底融 化，每2 min颠倒混匀一次。
14) 将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温放置2min，室温下8 000 rpm的速度离 心l min。
15) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加 入500 pl漂洗液，室温下8 000 rpm离心l min。
16) 重复步骤15) —次。
17) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室 温下12 000 rpm的速度离心15 s。
18) 将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加40 pl溶解液，室温 放置2 min。
19) 室温下12 000rpm离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片断，保存于-20 。C
备用o
20) 在微量离心管中加入l filpMD19-T质粒载体，0.1-0.3 pmol待插入DNA片段，再加 去离子水至5 pl。
21) 加入5pl的连接混合液后，16。C反应30min。
22) 将上述10 pl反应液加入至lOO pl的大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰中放置30 min。 轻轻摇动离心管2-3次，以充分混匀。
23) 冰浴后将离心管转入42。C水浴中热激90s，然后立即冰浴3-5 min。
24) 加入890ixl的LB液体培养基，37 。C下150 rpm的速度振荡培养45-60 min。每升LB 液体培养基含IO g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，最后用5 M的NaOH调节pH到7.0 后，用单蒸水定容至一升，灭菌即可。
25) 取O.l ml含有连接产物的菌液涂布于LB琼脂平板培养基上培养，37。C培养过夜， 形成单菌落。LB琼脂平板制备在每100mlLB液体培养基中加1.5g琼脂，待灭菌的琼脂 培养基冷却到50 。C左右时加入4 mg的5-溴-4-氯-3-吲哚-P-半乳糖苷(X-Gal)、 2.4 mg的异丙 基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)和10mg的氨苄青霉素(Amp)，制作成X-Gal、 IPTG、 Amp 平板培养基，摇匀后倒平板。26) 挑取转化后在含氨苄青霉素的LB固体培养基上生长的白色菌落，接种到0.5-lml 的含IOO ngml"氨苄青霉素的LB液体培养基中。
27) 37。C下150rpm的速度震荡培养过夜。
28) 取100nl菌液于12 000rpm的速度离心2min。
29) 弃去上清液，向沉淀中加入40 pl5。/。的TritonX-100水溶液。
30) 煮沸5min，冰上放置5 min, 12 000 rpm离心5 min。
31) 取2 pl上清液作为模板DNA，进行PCR反应。25plPCR基本反应体系组成包含50 mMKCI， 10mMpH为8.3的Tris-HCl缓冲液、2.0mMMg2+、 200pMdNTPs、 M13正向和反 向通用引物各0.2(aM、 1.0Ur叫DNA聚合酶及30ng模板DNA。基本扩增程序包括94 。C预 变性3min，紧接着按照94 。C变性45 s、 57。C退火45 s、 72 。C延伸1.5 min的程序进行30个循 环，最后72。C延伸10min。 4。C保存扩增产物。PCR反应结束后，取产物6 ^1在1.5%的琼脂 糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1XTAE,该缓冲液包括40mMTris-HAc和2mMEDTA。电压 为5Vcm—、紫外灯下观察并拍照。
32) 将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。 两个特异分子标记Rf-763和Rm-239，其序列分别是SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4。
SEQ.ID.NOl (引物Rf):
正向引物5 ，-GGTCTGTTTGGTCAAGGTTAT-3' 反向弓I物5' -TTTAGGTTGGGTTGGGGATT-3'
SEQ.ID.N02 (引物Rm):
正向弓l物5，-GTGCTTGAGGCTAAAGAAACC-3， 反向弓I物5 ，-TGGAAGTGGAGATGAGAGAGG-3'
SEQ.ID.N03 (Rf-763):CAACCCAACCTAAAT SEQ.ID.N04 (Rm-239):
ATCTCCACTTCCA
权利要求
1. 一种能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，其特征在于海带雌配子体的特异性分子标记为Rf-763，其序列为SEQ.ID.NO3，海带雄配子体的特异性分子标记为Rm-239，其序列为SEQ.ID.NO4。
2、 一种用于扩增海带雌、雄配子体基因组DNA的引物，其特征在于用于扩增海带 雌配子体基因组DNA的引物对为Rf，序列为SEQ.ID.NOl，用于扩增海带雄配子体基因 组DNA的引物对为Rm，序列为SEQ.ID.N02。
3、 一种如权利要求1所述的能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记的提取方法， 其特征在于具体步骤如下(1) 在17il。C、 30-40 nmol m'2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体无性繁殖系， 收集并提取配子体的基因组DNA;(2) 根据GenBank上序列登录号为EU663626和EU663627的海带雌、雄配子体// q/6 基因的5'-侧翼序列设计两对引物SEQ.ID.NOl和SEQ.ID.N02，分别对海带雌、雄配子体 基因组DNA进行PCR扩增；(3)回收特异扩增片段的DNA，利用pMD19-T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109,进 行克隆；挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小，将含有目的片段的 菌液进行测序，获得两个特异分子标记，记为Rf-763和Rm-239，前者为海带雌配子体特 异性分子标记，后者为海带雄配子体特异性分子标记，它们的序列分别是SEQ.ID.N03和 SEQ.ID.N04。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种能辨别海带雌、雄配子体的特异性分子标记。该特异性分子标记由下述方法获得根据海带雌、雄配子体1hcf6基因的5'-侧翼序列设计两对引物SEQ ID No1和SEQ ID No2，对海带雌、雄性配子体基因组DNA进行PCR扩增，回收特异扩增片断的DNA，利用pMD19-T载体，大肠杆感受态菌株JM109进行克隆，得到海带雌配子体特异性分子标记Rf-763和雄配子体特异性分子标记Rm-239，其序列分别为SEQ ID No3和SEQ ID No4。利用该特异性分子标记，可以对海带配子体性别、单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别进行鉴定，也可以在细胞和分子水平上对海带性别分化进行研究。
文档编号C12N15/10GK101280340SQ20081003822
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者刘艳省, 周志刚, 李利华, 毕燕会 申请人:上海海洋大学