人犬尿氨酸酶基因的单核苷酸多态性组成的单倍型的制作方法

专利名称：：人犬尿氨酸酶基因的单核苷酸多态性组成的单倍型的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及人犬尿氨酸酶(kynureninase，KYNU)基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)组成的单倍型(haplotype)。本发明还涉及检测这些SNP组成的单倍型的方法和试剂盒。
背景技术：
：原发性高血压(essentialhypertension,EH)是最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已纟至成为目前研究的热点(HarrapSB.Hypertension:genesversusenvironment.Lancet,1994,344:169-171)。定位克隆法是研究EH遗传机制的主要研究之一，即利用一定数量的覆盖整个基因组的微卫星引物，对大样本家系或同胞对进行连锁分析，而将EH易感基因位点定位到某一染色体区域。上海市高血压研究所已完成对上海地区汉族高血压家系的全基因扫描，研究提示2ql4-q23区域与高血压存在紧密连锁关系(ZhuDL,WangHY，XiongMM,etal.Linkageofhypertensiontochromosome2ql4-q23inChinesefamilies.JHypertens2001;19:55-61),然而并没有确定该区域内哪个基因为EH易感基因。KYNU基因即该定位区域内的候选基因，但目前没有证实KYNU基因单倍型与原发性高血压相关性的报道。综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
发明内容本发明人经过多年研究，首次发现和证明了KYNU基因单倍型与高血压密切相关，而且发现了它的新功能KYNU基因的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在KYNU第-8091位的SNP1(A/T)、第一7974位的SNP2(G/A)、第70764位的SNP3(T/A)组成的单倍型在病例和对照组中的分布存在显著性差异。在此基础上完成了本发明。本发明的目的是提供一种检测KYNU基因的SNP1、SNP2和SNP3组成的单倍型的方法。本发明的另一目的是提供一种原发性高血压易感性检测试剂盒。本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。本发明人找到了与高血压关联的KYNU基因的SNP标记，所述SNP标记包括位点位于KYNU基因第-8091位的SNP1、第-7974位的SNP2和第70764位的SNP3。同时，获得了与高血压关联的KYNU基因的单倍型，其是上述的SNP标记组成的单倍型，包括A-G-T、A-G-A、A-A-T、A-A-A和T-G-T。本发明提供了一种测定个体中对高血压的易感性的方法，该方法包括检测上述与高血压关联的KYNU基因的单倍型。本发明还提供了一种测定个体中对高血压的易感性的方法，该方法包括以下步骤从所述个体中获得DNA样品；使用KYNUSNP1-3引物进行PCR扩增；纯化PCR产物并测序；和SNP基因分型和关联分析。本发明还提供了一种原发性高血压易感性检测试剂盒，该试剂盒包含KYNUSNP1正向引物，其序列为SEQIDNO:l;KYNUSNP1反向引物，其序列为SEQIDNO:2;KYNUSNP2正向引物，其序列为SEQIDNO:l;KYNUSNP2反向引物，其序列为SEQIDNO:2;KYNUSNP3正向引物，其序列为SEQIDNO:3;KYNUSNP3反向引物，其序列为SEQIDNO:4;PCR反应液含Taq酶、dNTP、镁离子和PCR反应緩冲液。本发明还提供了一种治疗高血压的药物组合物，该组合物包含KYNU蛋白或其多肽；药学上可接受的载体或赋形剂。6KYNU基因的详细序列可参见登录号为NM_003937.2的核苷酸序列(http:〃g;enome.ucsc.edii/cgi-bin/hgTracksSubmit-Submit&position=lJ577an基于本发明的新发现，KYNU蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括但不限于直接做为药物治疗KYNU蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进KYNU蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人KYNU蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人KYNU蛋白功能的多肽分子。另一方面，本发明还包括对人KYNUDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性，，是指抗体能结合于人KYNU基因产物或片段。优选地，指那些能与人KYNU基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人KYNU蛋白的分子，也包括那些并不影响人KYNU蛋白功能的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人KYNU基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似，表iiAKYNU蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。7本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人KYNU蛋白功能的抗体以及不影响人KYNU蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人KYNU基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人KYNU基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗人KYNU蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人KYNU蛋白。一种优选的抗KYNU抗体是不识别正常KYNU但识别突变KYNU的抗体，或者识别正常KYNU但不识别突变KYNU的抗体。利用该抗体对正常和异常KYNU蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。利用本发明KYNU蛋白，通过各种常少见筛选方法，可筛选出与KYNU蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。本发明KYNU蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH值通常约为5-8,较佳地pH值约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内或皮下给药。正常的KYNU多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明KYNU蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明KYNU蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶嚢之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶嚢宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的KYNU蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。人KYNU蛋白的多聚核普酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于KYNU蛋白的无表达或异常/无活性的KYNU蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带KYNU基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，etal.)。另外重组人KYNU基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核普酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。本发明还涉及定量和定位4企测人KYNU蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。一种斥企测样品中是否存在KYNU蛋白的方法是利用KYNU蛋白的特异性抗体进行;险测，它包括将样品与KYNU蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在KYNU蛋白。'KYNU蛋白的多聚核苷酸可用于KYNU蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，KYNU蛋白的多聚核苷酸可用于检测KYNU蛋白的表达与否或在疾病状态下KYNU蛋白的异常表达。如KYNUDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断KYNU蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用KYNU蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测KYNU蛋白的转录产物。检测KYNU基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。KYNU蛋白突变的形式包括与正常野生型KYNUDNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是表2所示的SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交^r测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1研究对象样本为来自24个核心汉族高血压家系、无亲乡彖关系的24例原发性高血压病人。所有受试者均为汉族。原发性高血压组(EH组)和正常血压组(NT组)各96例，均来自中国上海地区，彼此无亲缘关系。EH组为上海市瑞金医院高血压科住院病人，均为汉族，无亲缘关系，平均年龄为57.32±11.75岁。入选标准①收缩压^140mmHg和/或舒张压^90mmHg，或正在接受抗高血压药物治疗至少一年以上；②在30岁之前或60岁以后发病者除外；③临床上除外继发性高血压，如原发性醛固酮增多症、嗜铬细胞瘤、肾性高血压等。NT组为上海地区40岁以上居民，均为汉族，无亲缘关系，平均年龄56.39±6.45岁。收缩压<140mmHg且舒张压<90mmHg，无服用抗高血压药物史，排除肝、肾功能障碍、曱状腺疾病、糖尿病、冠心病史。ii样品收集和高血压群体KYNU基因的SNP发现(1)常规酚-氯仿法提取外周血白细胞DNA，并标化DNA浓度值至20ng/fa1。(2)PCR及测序引物的设计根据GenBank中KYNU的基因组序列，应用prime3软件(美国麻省理工生物医学白头研究所，http:〃www-gonome.wi.mit,edu/cgi-bin/primer/primer3—www.cgi)i殳i十引物。具体引物如下表所示。表l引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3)KYNU基因的调控区和编码区分段体外扩增以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为94。C预变性2分钟，94。C变性30秒，63。C退火40秒，72。C延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5°C;以后94。C变性30秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30个循环；最后72。C延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。(是同时进行三个引物的PCR反应，还是分别进行)(4)SNP的发现和才企测PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http:Vdroog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进4亍序列的判读和SNP确认。(5)SNP基因分型和关联分析用直接单向测序法进行SNP基因分型，即在425个高血压病人和429个正常血压对照组中进行分型和关联分析。统计学方法SNPs各基因型在病人和正常血压对照中分布的比较采用RxC表5C2检验。PO.05认为有统计学差别。研究结果(l)KYNU基因SNP的分布KYNU基因3个SNP分布情况见表2。表2中国人KYNU基因SNP的种类及其分布<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>说明(1)表中第一列为SNP的名称；第二列为SNP在KYNU基因序列中距离起始编码的位置；第三列为SNP所属基因区域，Promoter为启动子区，Intron为内含子区，；第四列为在等位基因中SNP的两个碱基；第五列为测序所用引物。(2)SNIM立点的基因分型在425例EH和429例NT中，对SNP01、SNP02、SNP03进行基因分型、关联分析和单倍型分析。关联分析结果提示，各SNP等位基因分布在两组中无显著差异(P均>0.05)。3个SNP位点，单倍型分析估计得5种单倍型(频率均>1%),单倍型分布在男性EH组和男性NT组间存在显著差异(见表3)，男性EH组A-A-A单倍型频率显著低于男性NT组(P=0.016)。表3KYNU基因单倍型在EH组和NT组分布比较SNPs单倍型EH组-425麵且=429P(男性/女性)(男性/女性)(男性/女性)-8091A>TA-G-T233(133/100)237(108/129)0.938(0.053/0.068)-7974G>AA-G-A30(15/14)18(9/9)0.057(0.172/0.228)70764T>AA-A-T54(28/26)49(33/16)0.548(0.513/0.094)A-A-A293(141/152)332(175/157)0.108(ft0膽.864)T-G-T138(68/69)131(65/67)0.514(0.771/0.566)EH:原发性高血压；NT:正常血压对照A-A-A单倍型个体的收缩压、舒张压及平均动脉压均低于其他单倍型(见表4)。表4AAA单倍型与其他单倍型个体血压水平比较AAA单倍型其他单倍型P收缩压(mmHg)129.13±2.50135.06±1.030.028舒张压(mmHg)84.00±1.4888.45±0.610馬脉压(mmHg)99.04±1.77103.%±0.730扁高血压是遗传因素与多种环境因素相互作用而导致的多基因疾病，其遗传机制的研究已经成为目前的研究热点。迄今研究者已经成功地确定了几种单基因遗传性高血压的候选基因，但占高血压约95%的原发性高血压的遗传方式和易感基因仍未确认。定位克隆法是研究15EH遗传才几制的主要研究之一，上海市高血压研究所已完成对上海地区汉族高血压家系的全基因扫描，研究提示2ql4-q23区域与高血压存在紧密连锁关系，KYNU即为该定位区域内的候选基因之一。由于多基因疾病表现型的复杂性、相关基因的微效性和人群的遗传异质性，其相关基因定位克隆研究一直是一个很大的挑战。在原发性高血压候选基因中筛选多态性标记，然后在病例-对照中进行相关分析是目前寻找疾病相关基因的重要方法之一。SNP数量多、分布广、密度高，是进行遗传连锁分析和关联研究最理想的遗传标记。犬尿氨酸酶基因(kynureninase，KYNU)定位于2q22.2,在肝脏、胎盘、肺、心脏、脑等多种组织器官中均都有表达(Alberati-GianiD,BuchliR,MalherbeP,etal.IsolationandexpressionofacDNAcloneencodinghumankynureninase.EuropJBiochem，1996,239:460-468)。其编码产物为犬尿氨酸酶，能水解L-犬尿氨酸和3-羟基L-犬尿氨酸为邻氨基苯甲酸，通过色氨酸代谢通路参与NAD辅因子的生物合成。犬尿氨酸是N-曱基-D-门冬氨酸(NMDA)受体阻滞剂，后者是最重要的中枢兴奋性氨基酸受体。本研究是第一次证实KYNU基因的单倍型位点与人高血压相关。我们对KYNU在中枢的血压调节的作用机制解释是KYNU参与色氨酸代谢通路，影响犬尿氨酸的代谢，后者通过氨基酸结合位点抑制NMDA兴奋性受体。当兴奋性受体和抑制性受体不平衡时，可能引起大脑功能的暂时失调，作为一种始动因素，通过植物神经的作用，导致血压升高。^研究对3个SNP在425例的高血压病例和429例对照人群中进行了基因分型，虽然没有发现单个位点的等位基因频率和基因型在两组之间有统计学差异，但发现A-A-A单倍型分布在男性EH组和男性NT组间存在显著差异，且A-A-A单倍型者收缩压、舒张压及平均动脉压均显著低于其他单倍型者，提示A-A-A为对高血压具保护作用的单倍型。实施例2原发性高血压易感性;险测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称序列(5'—3')编号浓度KYNUSNP1正向引物GATCTTTCTTCCTTCATTGTCTTGSEQIDNO:l干粉20D反向引物GCTCCTGCCCACCATTTCASEQIDNO:2干粉20DKYNUSNP2正向引物GATCTTTCTTCCTTCATTGTCTTGSEgIDNO:l干粉20D反向引物GCTCCTGCCCACCATTTCASE(JIDNO:2干粉20DKYNUSNP3正向引物TCCCCCGAGTTTGCTGTTSEQIDNO:3干粉20D反向引物ATTTTATATCGTTTTGGCGTAGGSEQIDNO:4干粉20DPCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应緩冲液抽取待检测高血压病人的血液3ml,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到lpmol^il,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序4义进4亍荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表.seq<110>上海市高血压研究所<120>人犬尿氨酸酶基因的单核苷酸多态性组成的单倍型<130〉DI08-1491-XC37<160〉4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>24〈212〉隨<213〉Artificial<220><223>人工序列<400>1gatctttcttccttcattgtcttg24〈210>2<211>19<212>腿<213>Artificial<220〉<223>人工序列<400>2gctcctgcccaccatttca19<210〉〈211〉<212><213>318■Artificial<220><223>人工序列<400〉3tcccccgagtttgctgtt18<210>4<211>23〈212〉DNA<213>Artificial<220><223>人工序列<400>4attttatatcgttttggcgtagg2权利要求1、与高血压关联的KYNU基因的SNP标记，所述SNP标记包括位点位于KYNU基因第-8091位的SNP1、第-7974位的SNP2和第70764位的SNP3。2、与高血压关联的KYNU基因的单倍型，其是权利要求1所述的SNP标记组成的单倍型，包括A-G-T、A-G-A、A-A-T、A-A-A和T-G-T。3、根据权利要求2所述的单倍型，其中所述A-A-A单倍型是对高血压具有保护作用的单倍型。4、一种测定个体中对高血压的易感性的方法，该方法包括检测与高血压关联的KYNU基因的单倍型，所述单倍型选自权利要求2中。5、根据权利要求4所述的方法，该方法包括使用SEQIDNO:l-4的引物进行检测与高血压关联的KYNU基因的SNP位点从而确定单倍型的步骤。6、根据权利要求4所述的方法，其中，检测所述单倍型的存在包括从个体中扩增样品的KYNU基因的步骤。7、根据权利要求4所述的方法，其中，检测所述单倍型的存在另外包括电泳分析步骤。8、一种测定个体中对高血压的易感性的方法，该方法包括以下步骤从个体中获得DNA样品；使用KYNUSNP1-3引物进行PCR扩增；纯化PCR产物并测序；和SNP基因分型和关联分析。9、一种原发性高血压易感性检测试剂盒，该试剂盒包含KYNUSNP1正向引物，其序列为SEQIDNO:l;KYNUSNP1反向引物，其序列为SEQIDNO:2;KYNUSNP2正向引物，其序列为SEQIDNO:l;KYNUSNP2反向引物，其序列为SEQIDNO:2;KYNUSNP3正向引物，其序列为SEQIDNO:3;KYNUSNP3反向引物，其序列为SEQIDNO:4;PCR反应液含Taq酶、dNTP、镁离子和PCR反应緩沖液。10、一种治疗高血压的药物组合物，该组合物包含KYNU蛋白或其多肽；药学上可接受的载体或赋形剂。全文摘要本发明公开了与高血压关联的KYNU基因的单核苷酸多态性组成的单倍型。基于该单倍型本发明开发了检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。文档编号C12Q1/68GK101671723SQ20081004280公开日2010年3月17日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者怡张,朱鼎良,高平进申请人:上海市高血压研究所