专利名称：天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术分离处理方法，尤其涉及天然芸苔素内酯的生物酶解 制备方法，用于处理从蜂蜡中获得甾体类植物生长调节剂--芸苔素内酯类物质。
背景技术：
芸苔素内酯类物质(Brassinolide，简称BR)又名油菜素内酯，是美国Mirchdl 博士等人，于1970年首次从油菜花粉中分离发现。经深入研究证明，芸苔素内 酯有多种独特的调节植物生长的生理活性，与已知的生长素、细胞分裂素、赤 霉素(920)、脱落酸、乙烯等植物生长调节剂相比，生物活性更強，使用量更 低，安全性更高，在农业上增产增收的效果更好。1982年第八届国际植物生长 物质大会上，被一致公认为新一代农业生产资料即世界第六大植物生长调节剂。
Grand和Mandeve等各国科学家在600多种植物花粉中分离出这种具有生 理活性的芸苔素内酯化合物，并进一步证明具以下基本结构加上不同的侧链基 团，构成的4种同系物生理活性最强。芸苔素内酯的化学结构<formula>formula see original document page 3</formula>芸苔素内酯为特殊的立体化学结构，已经证实任何一种化学合成方法，只能得到一种与之相近而不是完全相同的化合物，化学合成无法在立体结构上做 到与天然物质的立体化学结构完全相同，这就大大降低了其效果。而且化学合 成法的生产工艺时间长，反应物不易提纯，对环境有污染，生产成本高。
从生物源中提取芸苔素内酯，如从蜂蜡、榨油后的饼渣中提取，专利
85102899以蜂蜡采用NaOH皂化，盐酸中和，硅胶柱层析分离的方法。但此方 法使用大量的四氯化碳、氯仿作萃取溶剂，消耗大量的酸碱，环保压力巨大， 严重危害工人健康，污染环境，而且生产消耗大，生产成本相对较高，副产物 作为废物不能综合利用，不能适应市场的需求。
发明内容
针对上述现有合成技术的不足，本发明的目的是提供一种原料易得，工艺 操作简便，生产过程能耗低，产品纯度高，环保节约的芸苔素内酯制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现的
芸苔素内酯的生物酶制备方法，经过下列步骤
A、 在培养基中接种假单胞菌液，调节液温至25 3(TC，搅拌40 50r/min;
B、 通气培养，发酵时间15 25h;
C、 发酵规模从2L放大至IOOL、 500L罐，加入发酵液体积从0. 8L、 40L扩 大到200L,酶活力达到900 1400U/L;
D、 反应发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体，获得粗酶液；
E、 粗酶液经中空纤维系统超滤浓縮，同时去掉无机盐及部分小分子物质， 得到2000 2500U/L的浓缩酶液；
F、 将浓縮酶液加到分散的蜂蜡乳化液中，调pH7.0 8. 5，搅拌，升温到30 40°C,定向水解不少于3h，水解接近终点时，加入适量的生成物萃取剂；
G、酶解液经乙醇萃取，板框压滤机过滤，浓缩罐浓縮后，采用吸附树脂柱分离纯化，真空浓縮，结晶，得到99%芸苔素内酯产品。
所述的步骤A中的培养基组成为，油脂0.75%， NaNO40.2%，酵母膏0. 5%,K2HP040.2%，消泡剂0. 010 0. 018%, pH7.5。
所述的步骤A中所用菌株为荧光假单胞菌(/>se^omo asy7"omsce s),购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保歲号为CGMCC No. 1. 867。
所述的步骤F中蜂蜡乳化液制作工艺为每100L水中，加入蜂蜡20 30kg，乳化剂0. 6 0. 9kg,在70 80。C搅拌50 60r/min ，乳化2 3h。
本发明所用原料蜂蜡是由高级一元醇和高级脂肪酸形成的酯，极具油溶性而非水溶性，选用乳化性极强而又不干扰酯酶定向水解活性的乳化剂，将蜂蜡制成高分散乳化液体。在酯酶的发酵过程中，采用低温延时发酵技术，酯酶在发酵液中获得最佳积累，以中空纤维超过滤系统浓缩发酵酯酶液，中空纤维超滤系统由若干空心纤维丝成束地装配组成，每根纤维丝即成为一个微细管型膜(相当于一个超滤单位)。纤维丝膜切面内壁的表层细密，向外逐渐疏松，形成各向异性微孔膜管结构，在除去发酵液中无机盐及部分小分子杂质的同时，获得高活性、高浓度的液体酯酶。假单胞菌产生的酯酶为一种专一水解蜂蜡中酯键的酶，对蜂蜡中的酯键产生高亲和性，加到高度分散的蜂蜡乳化液中，实现定向水解，在水解接近终点时，加入适暈的生成物萃取剂，打破酯酶催化的平衡点，使酯酶定向水解更彻底，水解率达到86%以上。
蜂蜡中含有多种芸苔素类似物，这些混合的类似物对农作物的效应没有加和作用。粗混合物活性很低，即使加大施用浓度也不会提高生物活性，而分离纯化的芸苔素在极低浓度下也表现出极高生物活性。因此，芸苔素的分离纯化及纯度是保障芸苔素产品质量的又一关键。本发明采用树酯吸附柱分离纯化技术取代硅胶柱分离纯化，获得高纯度的芸苔素产品。
产品经质谱检测分析，GC-EI-MS质图谱显示样品中属于芸苔素内酯的有3
个峰
对21.89峰言其碎片峰为479 (M-1)、 412、 398、 383、 380 (C22~C23断裂，H转移)、379、 365、 314 (M-1， C20-C22断裂,2、 3位羟基断裂，基峰)、299、 285、 271、 173。
对24.97峰言起碎片峰为479 (M-1)、 451、 412、 397、 380 (C20-C22断裂、H转移)、379、 314 (M-1, C20-C22断裂，2、 3位羟基断裂，基峰)、299、285、 271、 173。
对28.63峰言其碎片峰为479 (M-l)、 416、 401、 440、 380(C20-C22断裂、H转移)、379、 355、 337、 314 (M-l, C20-C22断裂，2、 3位羟基断裂，基峰)、299、 285、 271、 173。
即2L89， 24.91， 28.64,为芸苔素内酯的三个异构体。
本发明与现有技术相比有如下优点.-
1. 原料易于获得，成本低廉。本发明以十字花科植物(油菜等)蜂蜡为原料生产芸苔素。蜜蜂采食花粉分泌蜂蜡的过程是对芸苔素的富集过程，以蜂蜡为原料比用油菜花粉生产成本更低廉。作为四川的优势资源，油菜源蜂蜡年产5000吨。因此用蜂蜡作原料生产芸苔素，资源有保障。
2. 工艺先进。本发明以自主开发的生物酶解技术生产芸苔素内酯。采用专一水解蜂蜡中酯键的酯酶定向水解经高分散乳化处理的蜂蜡，并加入生成物萃取剂打破酯酶催化平衡点，提高酯酶水解率，最后采用强吸附型树脂柱取代硅胶柱，分离纯化制备得到芸苔素内酯。生物酶水解蜂蜡生产芸苔素内酯属于国内首创，是应用发酵工程、酶工程、化学工程技术的综合技术，达到国内领先和国际先进水平。
3. 产品纯度高质量好。酶解法制得的芸苔素内酯纯度》99%,产品至少可获得三个以上最具生理活性的结构'与天然产物完全一致的组分，与化学合成相比，具有特别突出的生理活性，最强的调控能力。其使用效果(按增产、增收的标准计)超过目前国内所有化学合成的同类产品，也优于包括脱落酸等其他植物生长调节剂。经广泛的试验检测证明，产品具有多种独特调节植物生长的生理活性功能，生物活性强，使用量低，增产效果明显，且能改善作物品质，没有化学合成植物调节剂的毒副作用。
4. 生产过程节能环保。生产过程中水解温度低(40°C),时间短(3h)，水解率达到86%以上，能耗少，对设备腐蚀小，产品收率高(99%)。用酒精取代了皂化法中使用的有害溶剂，酒精的回收率达到93%，同时加强了密封及冷却等设施的构建。生产设备均考虑了通风除尘、节约能源、降低耗能、循环利用水资源的问题，并予以实施，符合国家"三同时"制度的规定，不但减轻了环境污染，也降低了成本。废渣可提取三十烷醇和二十八烷醇，综合利用可进一步降低成本，基本实现废渣的零排放。
图1是本发明的生产工艺流程图。
具体实施方式
具体实施例
1. 高选择性酯酶的发酵及纯化；
发酵产酶培养基(油脂0. 75%， NaNOA 2%，酵母膏0. 5%， K2HPO40. 2%， pH7. 5)120。C灭菌30min，冷却至28。C接入种子，28 3(TC搅拌45r/min。通气培养，发酵时间为76h。
发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体获得粗酶液，通过板框压滤机过滤后进入中空纤维浓縮柱进行超滤浓缩，得到2000 2500U/L的浓缩酶液。
2. 蜂蜡的高分散乳化处理
每100L水中，加入蜂蜡30kg,乳化剂(食品用)0. 8kg, 8(TC搅拌(60r/min)乳化2h。
3. 酯酶对蜂蜡中酯键的定向水解
向蜂蜡乳化液中加入0.4倍量浓缩酶液(2500u/L),搅拌(45r/min),调pH7.2 (此酶的最适pH)，温度40°C (此酶的最适温度)，定向水解3h,加入生成物萃取剂乙醇，蜂蜡酯键的水解率达到86%以上。
4. 对芸苔素内酯的分离纯化(树脂分离纯化技术)
(1) 芸苔素的萃取
向酶解液中加入5.0倍(W/W) 95%乙醇，升温至65'C，回流20min，萃取时间2h，冷却至室温。
(2) 萃取液的压滤
经板框压滤机过滤蜂蜡渣，过滤压力0. 3Mpa。
(3) 萃取液的浓縮将滤液在75"C条件下真空浓縮，浓縮真空为0. 085Mpa,蒸去溶剂和水后得到胶状物。将胶状物溶于10倍(W/W)异丙醇中，加热至6(TC搅拌，冷却后过滤。滤液真空浓縮(75°C)至0.5倍体积得浓縮液。
(4)树脂分离纯化
选用山东鲁能集团树脂分厂生产的CD~180树脂作为分离纯化树脂，柱床体
积①0.5X8迈，洗脱液为乙酸乙酯甲醇乙酸=3: 16: 8混合液，用分光光
度计进行检测，收集紫外线吸收部分，真空浓縮，结晶，制得99%的高纯度芸苔
素内酯。
9
权利要求
1、天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于经过下列步骤A、在培养基中接种假单胞菌液，调节液温至25～30℃，搅拌45r/min；B、通气培养，发酵时间20h；C、发酵规模从2L放大至100L、500L罐，加入发酵液体积从0.8L、40L扩大到200L，酶活力达到900～1400U/L；D、反应发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体，获得粗酶液；E、粗酶液经中空纤维系统超滤浓缩，同时去掉无机盐及部分小分子物质，得到2000～2500U/L的浓缩酶液；F、将浓缩酶液加到分散的蜂蜡乳化液中，调pH7.0～8.5，搅拌，升温到30～40℃，定向水解不少于3h，水解接近终点时，加入适量的生成物萃取剂；G、酶解液经乙醇萃取，板框压滤机过滤，浓缩罐浓缩后，采用树脂吸附柱分离纯化，真空浓缩，结晶，得到99％芸苔素内酯产品。
2、 根据权利要求1所述的天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于 所述的步骤A中的培养基组成为，油脂0.75%， NaM)40.2%，酵母膏0. 5%， K風0.2呢，消泡剂0. 010 0. 018%, pH7.5。
3、 根据权利要求l所述的天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于 所述的步骤F中蜂蜡乳化液制作工艺为每100L水中，加入蜂蜡20 30kg,乳化 剂0.6 0.9kg，在70 80。C搅拌50 60r/min，乳化2 3h。
全文摘要
本发明涉及一种生物酶的制备方法，具体为天然芸苔素内酯的生物酶制备方法。本方法包括接种发酵，压滤，超滤，乳化，酶解，萃取，压滤，浓缩，树脂吸附，浓缩结晶，真空吸滤，干燥包装步骤。本发明工艺方法操作简便，生产过程能耗低，产品纯度高，环保节约。
文档编号C12P33/00GK101684483SQ20081004618
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月27日 优先权日2008年9月27日
发明者何其明 申请人:何其明