专利名称：一种快速检测沙门菌的方法
技术领域：
本发明涉及种特异性引物在环介导等温DNA扩增反应检测沙门菌中的用途。这些引物可 用于检测食品中沙门菌的污染。
背景技术：
沙门菌是(&/mo^//flSpp.)是一类广泛分布于自然界，可使人和动物发病的具有极大危 害的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状。目前全世界已分离出 2 000多个血清型,我国已发现216个。根据国家食源性疾病监测网的统计资料显示，食品中 污染的微生物是引起食源性疾病的主要因素之一。近十年来，在我国由微生物引起的食源性 疾病事件中，沙门菌始终是最常见和最主要的病原因子，尤其在生肉及熟食制品中。因此， 检测沙门菌对有效控制其传播和预防食物中毒非常重要。
目前鉴定沙门菌主要有细菌学检査和免疫学方法。前者作为我国国标检测沙门菌的方法，
虽然结果可靠，但是操作烦琐、耗时，已经不能满足大量样品的检测需要，而后者虽然可以
快速检测，但容易出现假阳性。
新兴的分子生物学的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、依耐核酸序列的扩增(NASBA)，
自主序列复制(3SR)以及链置换技术(SDA)等，每种扩增技术都有自己的创新处来启始
的DNA合成。例如，PCR利用双链DNA的热变性来促进下 一轮的DN A的合成。3 SR和NASB A
利用一系列的转录和反转录反应消除热变性来扩增靶序列。同样的，SDA利用一组限制酶酶
切来消除热变性步骤，用修饰的核酸作为底物来进行链置换DNA合成。这些方法都能扩增
靶核酸到相似的数量级，都有较高的检出限以及都在一个小时左右，但是它们仍然有一些缺
陷不能克服。它们有的需要精密的仪器来扩增，有的因为对靶序列的选择特异性不高而需要
精细的方法来检测扩增产物。尽管操作简单，但需要高精度的热循环仪使得PCR这一有力的
技术没有被广泛的应用。另一方面，不使用热循环仪的NASBA和3SR，在特异性上又大打
折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40。C来进行扩增。SDA利用四种引物在等温
条件下扩增很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄落的环节必须利用昂贵的修饰核
苷酸作为底物来进行扩增反应。
综合以上原因，研究一种快速、准确、简便的方法来检测沙门菌是非常必要的。
本发明选用沙门菌高度保守的z'WA基因，设计了 4条能在6CTC 65'C的温度条件下扩增
沙门菌一段DNA序列的特异性引物。/肌A是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与
3该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。该扩增反应依赖于一组针对耙基因的引物，包括一 组内引物FIP和BIP，以及一组外引物F3和B3，利用具有链置换活性的BW DNA聚合酶的 大片段，在64'C左右的恒温条件下即可完成对靶基因的特异性扩增。由于其针对/m;A基因 的6个区段，所以特异性高;且其反应温度恒定，不需要PCR仪，仅需一个水浴锅即可完成； 另外，在反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生 一种焦磷酸镁的沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就可判定扩增结果，无需进行凝胶电泳。 实验证明，通过该法检测食品中污染的沙门菌，其特异性良好，操作简单，无需昂贵仪 器和试剂，且灵敏度比常规PCR高。 主要参考文献 Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA .Nucleic Acids Res， 2000, 28(12) : e63.
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发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种简单方便的快速检测沙门菌的方法。
(二) 技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是
1. 样品DNA的提取样品按照GB -20031525处理，经增菌培养后，取培养物lmL于12 000r/min离心5min;沉淀用0.8mLlxTE (100mmol/L Tris-Cl， 10mmol/L EDTA， pH8.0)洗 涤，12 000r/min离心5min，沉淀加入100pL无菌水，混匀后，于100°C沸水浴15min,立 即冰浴5min， 12 000r/min离心5min，上清液即为提取的DNA模板。
2. LAMP反应体系为
在25^L反应体系中分别加入以下物质 10xLAMPbufffer2.5(iL
410mmol/LMg" 5.0nL 10mmol/LdNTP 2.0|iL 10mmol/L betaine 2.0nL 0.5pmol/L的FIP和BIP各2pL 0.25(_imol/L的F3和B3各0.5pL 超纯水2.5^L
样品中提取的DNA模板5.0nL
BWDNA聚合酶8U/^L lpL 3.反应条件63。C 65。C水浴锅温浴60min， 80。C加热2 10min。 (三)有益效果
本发明以沙门菌/肌A基因为靶基因，设计了一组用于扩增该基因部分序列的特异性引物， 研究了反应体系和反应条件，能检出10fg/反应的DNA，克服了目前所用细菌培养法和免疫 检测法繁琐费时、易出现假阳性及一些分子生物学方法需要特殊仪器和试剂等缺点。
具体实施例方式
实施步骤
l.引物的设计
外引物F3 ( forward outer primer): TGTTACGGCTATTTTGACCA 外引物B3 (forward outer primer): TCGAGATCGCCAATCAGT
内引物FIP (backward inner primer ):
AGAGTACGCTTAAAACCACCGA-TTTCAATGGGAACTCTGCC 内弓I物BIP ( backward inner primer ):
TAGCGCCGCCAAACCTAAAA-CCTAACGACGACCCTTCT 2..样品的处理
样品按照GBZT4789.4-2003处理，经增菌培养后，取培养物lmL于12 OOOr/min离心 5min;沉淀用0.8mLlxTE (100mmol/L Tris-Cl， 10mmol/LEDTA， pH8.0)洗涤，12 OOOr/min 离心5min，沉淀加入lOO^L无菌水，混匀后，于100'C沸水浴15min，立即冰浴5min， 12 OOOr/min离心5min,上清液即为提取的DNA模板。 3. LAMP反应体系
在25pL反应体系中分别加入以下物质 10xLAMPbufffer2.5nL10mmol/LMgz+ 5.0^L lOmmol/LdNTP 2.0|aL 10mmol/L betaine 2.0|iL 0.5^mol/L的FIP和BIP各2|iL 0.25|imol/L的F3和B3各0.5pL 超纯水2.5^L
样品中提取的DNA模板5.0pL DNA聚合酶8U/pL IjaL
4. 反应条件63。C 65'C水浴锅温浴60min， 80'C加热2min。
5. 检测结果直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果， 如果未出现上述现象，则为阴性结果。
另一种检测结果的方法取反应后的混合液2pL，加入0.5jiL溴酚蓝上样缓冲液，在2% 的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于紫外检测系统检测电泳条带。如果出现 梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。
权利要求
1. 一种沙门菌核酸环介导等温扩增检测方法，包括设计沙门菌invA特异性引物，其特征在于，其中外引物F3(forward outer primer)为TGTTACGGCTATTTTGACCA；外引物B3为(forward outer primer)TCGAGATCGCCAATCAGT；内引物FIP(backward inner primer)为AGAGTACGCTTAAAACCACCGA-TTTCAATGGGAACTCTGCC；内引物BIP(backwardinner primer)为TAGCGCCGCCAAACCTAAAA-CCTAACGACGACCCTTCT。
2. 根据权利要求1所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括样品DNA的 提取细菌培养物lmL于12 000r/min离心5min;沉淀用0.8mLlxTE (100mmol/LTris-Cl， 10mmol/LEDTA， pH8.0)洗涤，12 000r/min离心5min，沉淀加入lOO^L无菌水，混匀后， 于100。C沸水浴15min,立即冰浴5min， 12 000r/min离心5min，上清液即为DNA模板。
3. 根据权利要求2所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，25pL扩增反应体 系包括10xLAMP bufffer 2.5pL， 10mmol/L Mg2+4.0-6.(VL， 10mmol/LdNTP 1.5-2.5|xL， 10mmol/Lbetaine 1.5-2.5pL， 0.5pmol/L的FIP和BIP各2fiL, 0.25pmol/L的F3和B3各 0.5^L,样品中提取的DNA模板2.0-5.0pL， DNA聚合酶8U4iL lpL，不足部分用超纯 水补足。
4. 根据权利要求3所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，扩增反应条件为 63。C 65。C水浴锅温浴60min， 8(TC加热2min-10 min终止反应。
5. 根据权利要求4所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，扩增结果的检测 可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果，如果 未出现上述现象，则为阴性结果。
6. 根据权利要求5所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，另一种检测结果 的方法是取反应后的混合液2pL，加入0.5pL溴酚蓝上样缓冲液，在2%的琼脂糖凝胶中电 泳，电压100V，时间30min，在0.5吗/mL溴化乙锭溶液中浸泡20min，置于凝胶成像系统 照相，如果出现梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。
全文摘要
本发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BstDNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴氛蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速、无需特殊仪器试剂且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101497923SQ200810046809
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月29日 优先权日2008年1月29日
发明者朱胜梅, 陈福生 申请人:陈福生;朱胜梅