专利名称：：一种人肠道菌群连续培养的系统及方法
技术领域：
：本发明属于微生物学
技术领域：
和兽药残留分析
技术领域：
，具体涉及一种人肠道菌群连续培养系统及方法。
背景技术：
：人的胃肠道中定居着一个十分复杂和活跃的微生物群落，包括约1014个细菌，每克肠内容物含10"个细菌，约400-500种，互相作用极为复杂。大量研究表明，这个庞大的微生物菌群在人的肠道内达到一种平衡状态，对人的健康和疾病状况至关重要。抗菌药物在抑制病原菌生长的同时也会破坏肠道菌群的平衡状态，引起二重感染等。近年来研究发现，残留在动物性食品中的抗菌药会对人体肠道菌群产生不利影响，此外，随着越来越多商业化生产的调节肠道菌群的功能性食品大量涌现，对药物及这些益生元、益生菌类的产品安全性或功能性评价引起了越来越多人的关注。据文献报道，目前，国际上推荐用于评价抗菌药残留对人体肠道菌群影响的研究模型主要包括离体和活体两大类，离体模型主要有模拟肠道的静态模型、半连续和连续流动培养系统等；活体模型主要包括普通试验动物、悉生小鼠、携带人体肠道菌群的啮齿动物(HFA)以及人类志愿者。这些模型都各有优缺点，其有效性和可靠性还需进一步研究。最理想的模型是通过人体(志愿者)研究，但其中不仅存在道德问题，而且相关技术和条件也很复杂；与其他活体模型相比，HFA的肠道菌群与人体更为接近，并且由于其饮食是严格限制的，因而没有高背景的抗菌药抗性的问题，但存在植入后的菌群构成可能不稳定、所需设备和维护成本昂贵等问题。连续流动培养系统在所有离体肠道模型中更接近于人体肠道的微生态环境，尽管结构比较复杂，限制了同一处理组的重复数，相对成本高，也没考虑到寄主的代谢，但由于该模型接入的是健康人的粪便菌群，并且是连续流动的过程，更真实地模拟了人体的肠道环境，还考虑到了肠道不同菌群的相互作用，并能着眼于功能性终点如水解及还原反应，挥发性、非挥发性脂肪酸的形成，因此，被美国FDA推荐用于考察残留量的抗生素长期作用下对人体肠道菌群的影响。经过对现有技术的文献检索发现，目前，国外与本发明密切相关是美国FDA建立的一个离体的连续培养系统，FDA已采用该系统研究了环丙沙星、红霉素、四环素和新霉素对肠道菌群的影响，其结果表明，离体的连续培养系统可以用来评价低水平的抗菌药残留对人体肠道菌群的影响(CarmanRJandWoodburnMA.Effectsoflowlevelsofciprofloxacinonachemostatmodelofthehumancolonicmicroflora,iegwtoor少7b;c/co/ogy朋d/Vwr應co/ogv,2001，33:276-284)。但在其试验过程中暴露出了该系统的一些缺点，如温度控制不稳定、发酵罐内容物搅拌不均匀等，而影响了试验结果。未见有公丌发表的与本发明相类似的发明专利。目前，国内与本发明密切相关的专利文献仅有一篇，是中国国家知识产权局2008年1月30闩公开的一份申请号为200710028346.2(—种肠道菌群离体培养装置)的专利申请，该申请采用自行组建的发酵罐和其他配件构建了一种肠道菌群连续培养装置，其发明的目的是提供一种模拟肠道环境的肠道菌群离体培养装置，并称其优点是成功建立了人体肠道菌群连续培养恒化器模型，但是从公开的说明书和权利要求书来看，该申请没有提出充分的说明该发明效果的有关生物学实验数据，不能让人明了其实施的效果，也没有实施例说明模型具体的构建方法，即具体的菌群连续培养方法，仅有装置运行的简单操作说明，难以将模型真正推广应用，此外，该装置还存在体系相对不够稳定、R常维护相对复杂、条件不易控制等不足。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷和不足，提供一种能够真实地模拟人体肠道微生态环境，且稳定性好、适合推广应用的人肠道菌群连续培养系统及方法。本发明是通过如下技术方案实现的，本发明一种人肠道菌群连续培养系统，包括一组发酵罐，培养基输入、废液输出、液位控制系统和气路系统，所述的发酵罐包括罐体1、控温系统、pH自动控制系统和搅拌系统，搅拌系统由双螺旋桨的机械搅拌器2及配套控件组成；培养基输入、废液输出及液位控制系统主要由振荡器9、培养基贮存瓶8、培养基输送蠕动泵11、废液输送蠕动泵12和废液收集瓶10组成，培养基贮存瓶8放置在振荡器9上；气路系统包括高压氮气钢瓶15和废气收集装置17，培养基贮存瓶8分别与输送蠕动泵11和发酵罐罐体1相连，废液收集瓶10分别与废液输送蠕动泵12和发酵罐罐体1连通；pH控制电极4装在发酵罐内，且与pH控制器5和碱泵6相连，碱液贮存瓶7与发酵罐1连通；高压氮气钢瓶15与罐体1相连，罐体与废气收集装置17相连，其特征在于，所述的液位控制系统还包括一个液位计13、固定在发酵罐罐体金属密封盖19上的导线和液位控制器14与一个连接的计算机18构成一个辅助系统，液位计13装在发酵罐罐体内垂直高度l/2处，并与液位控制器14连接，液位控制器14和废液输送蠕动泵12通过电缆与计算机连接实施在线控制；所述的控温系统由套在发酵罐体外面的电热套2和发酵罐体内的由进水管和出水管构成的冷却系统组成；所述的振荡器是回旋振荡器。本发明所指人肠道菌群连续培养方法，其特征在于包括以下歩骤，l)制备健康人粪便菌悬液；2)预还原发酵罐中的新鲜培养基；3)向发酵罐中接种制备好的健康人粪便菌悬液，并进行分批培养；4)分批培养至菌群的对数生长期末期，开始连续培养。所述的新鲜培养基的组分按g/L计如下淀粉4.0-6.0，牛奶乳酪蛋白1.5-4.5，葡萄糖0.6-1.2，蛋白胨2.5-4.5，脂蛋白0.2-1.0，果胶0.2-1.0，木聚糖0.4-1.0，半胱氨酸0.3-0.6，胆固醇0.15-0.35，鹅脱氧胆酸0.15-0.35，胆酸O.15-0.35，氯化高铁血红素0.01-0.03，KH2P041.0-3.0，NaHC030.1-0.3，NaCL3,0-5.0，MgS04.7H200.4-0.8，FeS04'7H200.004-0.006，CaCL2.2H200.2-0.5，Tween80l-3ml，泛酸0.005-0.015，维生素H0.002-0.005，维生素K30.001-0.003，维生素B30.003-0.006，补充蒸馏水至1L，pH6.2-6.6。所述的发酵罐中新鲜培养基的预还原时间为24-48h。本发明与现有技术相比具有如下突出优点1、本发明主要通过以下几个方面充分确保各参数的准确性和稳定性，其具体体现在(1)液位控制系统不仅有蠕动泵的精密控制，还包括一个由液位计13、固定在发酵罐罐体金属密封盖19上的导线和与计算机18连接的液位控制器14构成的辅助系统，液位计13装在发酵罐罐体内垂直高度1/2处，并与液位控制器14连接，液位控制器14和废液输送蠕动泵12通过电缆与计算机18连接实施在线控制，能够更好地使发酵罐内的液体体积保持恒定，进而能够更精确地控制稀释率。(2)由套在玻璃罐体外面的电热套、罐体内部的冷凝水管和温度探头组成的控温系统使发酵罐内的培养物能够被均匀加热，且温差可控制在(±0.05°C)，从而较好地控制培养液的温度，还免去了水浴锅需要R常维护的麻烦，使操作更加简单。(3)采用了底部椭圆型的玻璃罐体和双螺旋浆的机械搅拌器，使发酵罐里的内容物能够充分被混匀，整体无死角。2、采用的回旋振荡器，其具有载重量大(最大载重量20kg)、稳固性高的优点，将培养基贮存瓶放置其上，不仅保证了培养基成份的均一性，而且可以一次放置至少10L的培养基，大大减少了更换培养基贮存瓶的次数，减少了污染几率和对体系的影响，从而更有利于维护体系的稳定。3、经过细菌培养计数方法和气相色谱技术的检测，结果表明人体肠道菌群能够在本体系中稳定生长，与未培养前的粪便相比，模型中的细菌数量达到稳态后各种主要优势菌数量和主要代谢产物浓度及比例都与之比较接近，且均在健康人正常的生理参数范围内。4、本发明克服了目前国内外建立同类模型时存在的搅拌不均匀、液位不稳定、操作复杂、条件不易控制而导致模型相对不够稳定等问题，具有使用方便、操作简单、稳定性好等特点，能够更好地模拟人体的肠道环境。本发明与申请号为200710028346.2的主要技术特征和实施效果的比较分析如表1所示。表l本发明与现有技术的主要技术差别<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>图1是模拟人肠道环境的连续培养系统的结构示意图。图2是计算机实时控制线路图。图3是连续培养过程中模型中的优势菌数量及变化趋势图。图4是连续培养过程中模型中的主要代谢产物SCFA浓度值及变化趋势图。图5是连续培养过程中模型中的主要参数值的变化趋势图。具体实施例方式下面通过实施例进-歩说明本发明。实施例1人肠道菌群连续培养系统及方法
技术领域：
：本发明的人肠道菌群连续培养系统的结构如图l所示，具体包括一组发酵罐，培养基输入、废液输出、液位控制系统和气路系统，所述的发酵罐包括罐l、控温系统、pH自动控制系统和搅拌系统，发酵罐罐体为底部椭圆的玻璃罐体，其上端密封盖19上设有进液管、出液管、进气管、尾气管、接种管、补碱管、pH电极插口、温度探头插口、液位计插口、冷凝水管进口和出口等；控温系统由套在发酵罐体外面的电热套2和发酵罐体内的由进水管和出水管构成的冷却系统组成，可使发酵罐内的培养物被均匀加热，从而较好地控制培养液的温度；pH控制器5与pH电极4、碱泵6和碱液贮备瓶7相连，可在试验过程中实现对培养液pH值的连续监测和自动控制，可以较好地控制培养液的pH值，使其在设定的范围内；搅拌系统由双螺旋桨的机械搅拌器2及配套控件组成，发酵罐内的液体能够被充分混匀，从而保证了罐体内部培养基成分的均一性。所述的培养基输入、废液输出、液位控制系统主要由振荡器9、培养基贮存瓶8、培养基输送蠕动泵ll、废液输送蠕动泵12和废液收集瓶10组成，培养基贮存瓶8是放置在振荡器9上的，以保证培养基成分的均一性；液位控制系统还包括-个液位计13、固定在发酵罐罐体金属密封盖19上的导线和液位控制器14与一个连接的计算机18构成一个辅助系统，液位计I3装在发酵罐罐体内垂直高度l/2处，并与液位控制器14连接，液位控制器14和废液输送蠕动泵12通过电缆与计算机连接实施在线控制；所述的气路系统包括高压氮气钢瓶15和废气收集装置17。其连接方式为通过培养基输送蠕动泵11和硅胶管将培养基贮存瓶8与发酵罐罐体1相连，从而将培养基以一定的流速输送到发酵罐内；液位控制器14和废液输送蠕动泵12通过电缆与计算机18连接，液位计13装在发酵罐罐体内垂直高度1/2处，并与液位控制器14连接，液位计13遇到液体可与固定在发酵罐罐体金属密封盖19上的导线构成回路，并将信号通过液位控制器14输送至计算机18，计算机18控制废液输送蠕动泵12的开启或关闭，进而实现对发酵罐内液位的在线控制；pH电极4装在发酵罐内，且与pH控制器5和碱泵6相连，碱泵再通过硅胶管将碱液贮存瓶7与发酵罐1连通，从而实现试验过程中对培养液pH值的自动控制；通过装有细菌过滤器16的硅胶管将高压氮气钢瓶15与罐体1相连，进而将无菌的高纯氮气通入发酵罐i内；罐体i通过输送尾气的硅胶管与废气收集装置n相连，将发酵罐内产生的含S02等成份的废气吸收至废气收集装置17。本发明人肠道菌群连续培养方法，包括以下歩骤(1)制备健康人粪便菌悬液取新鲜的健康人粪便，迅速悬浮于预还原处理过的稀释液中，混匀后用无菌纱布粗滤得到健康人粪便菌悬液。稀释液的组分为磷酸二氢钠4.5g,磷酸氢二钠6.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼月旨0.5g，吐温800.5mL，蒸馏水1000mL，调pH7.4-7.6(黎永学，姜明杰，一种改良大便双歧杆菌计数方法，中国微生态学杂志，2002，14(3):177-178)。(2)预还原发酵罐中的新鲜培养基配制500mL新鲜培养基，加入发酵罐1内，然后将pH电极4插入发酵罐1内，将输入培养基、输出废液、进氮气、出废气、补碱用的硅胶管一端分别与发酵罐的顶部相应端U相连，另一端包好，做好灭菌前准备；装有500mL培养基的发酵罐1和与发酵罐相连的输入培养基、输出废液、进氮气、出废气、补碱用的硅胶管和空气过滤器16等放在高压灭菌锅中121°C、30min灭菌，同时将碱液贮存瓶7、废液收集瓶10等一起灭菌；灭菌后，将发酵罐放置于已进行紫外照射灭菌的台面上，并将灭菌好的部件分别与发酵罐相应的控制器相连，准备运行。灭菌后，将发酵罐放置于己进行紫外照射灭菌的台面上，并将灭菌好的部件分别与发酵罐相应的控制器相连。打开高压氮气钢瓶15，使高纯氮气通过空气过滤器16除菌，之后以一定的流速通过发酵罐上的进口进入发酵罐1内，以保证发酵罐内的厌氧环境；将电热套2套在发酵罐罐体i的外围，并将温度传感器插入发酵罐上对应的插n，打开冷却水系统连接的自来水管，随后打开温度控制开关，通过电热套和冷却系统可使罐内培养物温度控制在37。C;打开发酵罐内的机械搅拌装置3，并预先设置一定的搅拌速度(300r/min)，从而使发酵罐l内的培养物被充分混匀。让系统在以上条件下预还原24-48h。(3)向发酵罐中接种，并分批培养将处理好的粪便菌悬液通过发酵罐1上端的接种口接入罐内；发酵罐内产生的废气通过罐体上端的尾气管及与之相连的硅胶管进入废气收集装置n，用以收集发酵过程产生的H2S;将碱液贮存瓶7与碱泵6相连，用1摩尔的NaOH调节酸碱度'打开碱泵6和pH控制器5的开关，以维持发酵罐1内6.2-6.6的pH条件。(4)分批培养至菌群的对数生长期木期时开始连续培养待发酵罐1内菌群生长进入对数生长期末期时，开启培养基输送蠕动泵U，以恒定的速率连续不断地向发酵罐中输入所述的新鲜培养基，以补充菌群生长所需要的营养，同时打开废液输送蠕动泵12的电源和液位控制器14，液位控制器14会依据液位计13传递的发酵罐1中的液位信息自动调控废液输送蠕动泵12的开启或关闭，废液便从发酵罐1中不断被抽出，并输送至废液收集瓶IO，并始终保持发酵罐l中液位的恒定，开始连续培养。连续流入发酵罐的所述的新鲜培养基为菌群生长提供了合适的营养条件，其配方为(g/L):淀粉5.0，牛奶乳酪蚩白3.0，葡萄糖0.8，半胱氨酸0.4，蛋白胨3.0，脂蛋白0.6，果胶0.6，木聚糖0.6，胆固醇0.2，我鸟脱氧胆酸0.2，胆酸0.2，氯化高铁血红素0.02，KH2P042.0,NaHCO30.2,NaCL4.5,MgSO4.7H2O0.5，FeSO4.7H2O0.05，CaCL2.2H200.4,Tween801.5ml，泛酸O.Ol，维生素H0.003,维生素K30.001，维生素1330.004，补充蒸馏水至1L，pH6.2-6.6。本发明成功建立了一种人肠道菌群连续培养系统及方法，构建了一种模拟人肠道环境的离体模型，经过细菌培养计数方法和气相色谱技术的检测，结果表明人体肠道菌群能够在本体系中稳定生长，与未培养前的粪便相比，模型中的细菌数量达到稳态后各种主要优势菌数量和牛.要代谢产物浓度及比例都与之比较接近，且均在健康人正常的生理参数范围内(结果详见表2、表3、表4和表5)，可以满足和应用于抗菌药残留对人体肠道菌群影响的安全评价研究，还可用于功能性食品和其他药品食品的功能和安全评价研究。表2模型中优势菌数量与未培养前粪便及健康人正常生理范围比较比较项目_优势齒数M(Lgcfu/mL)___脆弱拟杆菌_双歧杆菌_大肠杆齒.__肠球菌达稳态时的模型7.79±0.096.27±0.075.84±0.065.00±0.06未培养前的粪便8.08±0.126.71±0.075.75±0.025.65±0.02健康人生理参数范围8.00-10.006.50-10.004.50-7.005.00-10.00表3模型中主要SCFA浓度与未培养前粪便及健康人正常生理范围比较比较项目__主要SCFA浓度(mmol/L)__乙酸(AC)_丙酸(PC)_丁酸(BC)达稳态时的模型29.92±0.6813.98±0.966.64±0.]]未培养前的粪样3CU3士0.8014.04±0.207.04±0.16健康人生理参数范围30.00-66.0010.00-20.006.00-11.50表4连续培养过程中模型中细菌数量的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注同一列中相同的扁标字母a表示差异不显苦(P>0.05)。表5连续培养过程中模型中主要SCFA的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注同一列中相同的油'标字母a表示差异不显著(P>0.05)。实施例2不同培养基组分及配比对离体连续培养的人肠道菌群的影响根据实施例1提供的操作歩骤，本实施例比较了不同培养基组分及配比对离体连续培养的人肠道菌群的影响，设计了如表6所示的培养基配比。在三组对比试验中，第二组的相对营养成分，如碳源、氮源等含量较低，其菌群数量和SCFA浓度均低于其他两组，但均在健康人生理参数范围内；第三组的相对营养成分含量较高，其菌群数量和SCFA浓度均在健康人生理参数范围内，但明显低于第一组；相对于其他两组，第一组的菌群数量和SCFA浓度均高于其他两组，且均在健康人生理参数范围内，结果详见表7和表8。表7三组试验模型中优势菌数量与未培养前粪便及健康人正常生理范围比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种人肠道菌群连续培养系统，包括一组发酵罐，培养基输入、废液输出、液位控制系统和气路系统，所述的发酵罐包括罐体1、控温系统、pH自动控制系统和搅拌系统，搅拌系统由双螺旋桨的机械搅拌器2及配套控件组成；培养基输入、废液输出及液位控制系统主要由振荡器9、培养基贮存瓶8、培养基输送蠕动泵11、废液输送蠕动泵12和废液收集瓶10组成，培养基贮存瓶8放置在振荡器9上；气路系统包括高压氮气钢瓶15和废气收集装置17；培养基贮存瓶8分别与输送蠕动泵11和发酵罐罐体1相连，废液输送蠕动泵12与废液收集瓶10连通；pH控制电极4装在发酵罐内，且与pH控制器5和碱泵6相连，碱液贮存瓶7与发酵罐连通；高压氮气钢瓶15与罐体1相连，罐体与废气收集装置17相连；其特征在于所述的液位控制系统还包括一个由液位计13、固定在发酵罐罐体金属密封盖19上的导线和与计算机18连接的液位控制器14构成的辅助系统，液位计13装在发酵罐罐体内垂直高度1/2处，并与液位控制器14连接，液位控制器14和废液输送蠕动泵12通过电缆与计算机18连接实施在线控制，所述的控温系统由套在发酵罐体外面的电热套2和发酵罐体内的由进水管和出水管构成的冷却系统组成。2、根据权利要求l所述的培养系统，其特征在于，所述的振荡器是回旋振荡器。3、一种人肠道菌群连续培养方法，其特征在于，包括以下歩骤1)制备健康人粪便菌悬液；2)预还原发酵罐中的新鲜培养基；3)向发酵罐中接种制备好的健康人粪便菌悬液，并进行分批培养；4)分批培养至菌群的对数生长期末期，丌始连续培养；所述的新鲜培养基的组分按g/L计如下淀粉4.0-6.0，牛奶乳酪蛋白1.5-4.5，葡萄糖0.6-1.2，蛋白胨2.5-4.5，脂蛋白0.2-1.0，果胶0.2-1.0，木聚糖0.4-1.0，半胱氨酸0.3-0.6，胆固醇0.15-0.35，鹅脱氧胆酸0.15-0.35，胆酸0.15-0.35，氯化高铁血红素0.01-0.03，KH2P041.0-3.0，NaHC030.1-0.3，NaCL3.0-5.0，MgS04'7H200.4-0.8，FeS04.7H200.004-0.006，CaCL2'2H200.2-0.5，Tween80l墨3ml，泛酸0.005陽0.015，维生素H0.002-0.005，维生素K30.001-0.003和维生素830.003-0.006，补充蒸馏水至1L，pH6.2-6.6。4、根据权利要求3所述的培养方法，其特征是，所述的发酵罐中新鲜培养基的预还原时间为24-48h。5、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的新鲜培养基的组分按g/L计如下淀粉5.0，牛奶乳酪蛋白3.0，葡萄糖0.8，半胱氨酸0.4，蛋白胨3.0，脂蛋白0.6，果胶0.6，木聚糖0.6，胆固醇0.2，鹅脱氧胆酸0.2，胆酸0.2，氯化高铁血红素0.02，KH2PO42.0，NaHC030.2，NaCL4.5，MgS04.7H200.5，FeS04.7H200.05，CaCL2.2H200.4，Tween801.5ml，泛酸0.01，维生素H0.003，维生素K30.001，维生素B30.004和维生素B,0.004，补充蒸馏水至1L，pH6.2-6.6。全文摘要本发明涉及一种人肠道菌群连续培养系统及方法。系统包括一组发酵罐，培养基输入、废液输出、液位控制系统和气路系统。建立了一种人肠道菌群连续培养系统及方法，构建了一种模拟人肠道环境的离体模型，连续培养的装置通过电脑控制，模型具有操作简单、使用方便、体系稳定性好等特点，经检测表明人肠道菌群不仅能在系统中稳定生长，且优势菌数量和主要的代谢产物(SCFA)浓度也与健康人相似。该模型的建立不仅为抗菌药残留对人肠道菌群影响的安全性评价构建了平台，也为新药、功能食品等的安全评价研究提供了更科学的方法和途径。文档编号C12N1/20GK101368154SQ20081004806公开日2009年2月18日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者刘振利,敏姚,姚俊平,彭大鹏,戴梦红,旭王,王玉莲,袁宗辉,谢长清,郝海红,郭文韬,陈冬梅,陶燕飞,魏亚静,黄玲利申请人:华中农业大学