专利名称：：一种缩短北虫草子实体生长周期的培育方法
技术领域：
：-本发明涉及快速培养北虫草子实体的方法，进一歩将是提供一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，属于生物菌类培养方法
技术领域：
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背景技术：
：北虫草(Cordycepsmilitaris)是指真菌的菌丝通过各种方法侵染鳞翅目昆虫，以昆虫体内的物质行寄生生活，通过不断的发育和分解后最终伸出昆虫体表，而形成的一种真菌与虫体外壳共存的生物体。其主要功效成份虫草素明显高于冬虫夏草。随着人们生活水平的提高及保健意识的增强，做为保健、药品主要原料之一的虫草需求量R益增加，加之虫草的采集，严重破坏了野生植被。虫草属国家明令禁止野外采集并加以保护的野生物种资源。为了满足市场的需求，人工培养北虫草已成为当前的发展趋势。而目前国家普遍采用cordycepsmiltitaris菌株为北虫草生产菌，该菌株在固体培养子实体的生长过程中存在着生长周期长，大约40d到50d左右，给生产管理及提高单位产量都带來了一定的制约。
发明内容本发明提供一种可以縮短北虫草子实体生长周期的培育方法,应用纳米技术使植物生长素缓慢释放，目的旨在快速高产培养固体北虫草子实体，在保证北虫草子实体的营养成份不变的基础上縮短生长周期同时，将植物生长素的喷洒次数降至最低，从而提高北虫草子实体的产量，减低劳动。本发明的技术解决方案包括以下操作歩骤1.北虫草的培宵①马铃薯培养基②将北虫草菌株接种于PDA斜面，26'C恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成浓度约为3*107个/11^的孢子悬液。③栽培培养基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分装于玻璃瓶内，121°C35分钟灭菌备用。④用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，每罐头瓶培养基加2mL孢子悬液(孢子浓度为3"(^个/mL)，后用灭过菌的竹筷将米饭搅拌均匀，用封口膜封好，转入培养室培养。温度控制在23t:左右，空气相对湿度为60%左右，黑暗培养，菌丝封底后室内增加散射光，培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期。⑤菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度19-25°C，相对湿度60-80%，每天通风10min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，在500-700lx的散射光照，温度保持23'C左右，空气湿度65%左右，每天通风换气3次，每次10min。2.羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素制备及喷洒①溶液配置溶液A配制准确称取无水乙酸钙0.705g，加重蒸水定容至10ml，摇匀备用；溶液B配制准确称取磷酸二氢铵1.381g,乙酸铵4.008g，加重蒸水45ml，用浓氨水调节pH值在7.6左右，补加重蒸水定容至50ml，摇匀备用；②羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素制备步骤l准确称取赤霉素lmg，溶液B溶解，缓慢搅拌；步骤2将溶液A逐渐滴加到溶液B中，保持反应体系温度在37±rC，pH值7.4±0.2之间，缓慢搅拌l小时；步骤3反应液4。C下10000rpm/min离心15分钟；步骤4离心后沉淀室温下干燥48小时，4'C保存。③称取羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素0.28，用水定容1000ml，备用。④在培养瓶培养大约7天左右，即己从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将0.1%的植物生长素喷洒在菌表面。由于羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素具有缓慢释放作用，因此在北虫草生活周期中只需要喷洒一次。⑤培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。为表明本发明的积极效果，通过以下单因素实验(包括不同培养原料、培养基含水量、PH值和不同温度、光照对子实体干重及质量的影响)对北虫草固体培养条件进行比较原料选择不同的原料，复合原料均为9份大米+l份的其他原料(大米+蛹、大米、麦粒、玉米饈、大米+麦鼓、大米+豆粉)，每条件处理10瓶。计算平均产量，即子实体的干重(g/瓶)。蛹粉浓度优化在原料优化的基础上，进一步考察蛹粉不同浓度对栽培的影响，每条件处理10瓶。原料含水量选择85份大米+15份蛹粉作为原料，每瓶固体原料40g，加不同体积的水设置不同含水量，每条件处理10瓶。pH值栽培原料为85份大米+15份蛹粉。用in/。NaOH和P/。HCl调节水的pH。使原料起始pH分别为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，每条件处理10瓶。温度将接种的栽培瓶分别在23'C,暗恒温培养至瓶底转色后，分别置不同温度，室内散射光培养出草，每条件处理10瓶。光照强度采用不同密度的遮阳网设置不同强度的光照，将黑暗发菌至瓶底转色的栽培瓶，置不同光照下培养出草，每条件处理10瓶。实验结果及讨论1、不同栽培原料对虫草生长的影响栽培原料对北虫草生长影响很大，结果表明(表.l)，大米和大米复合原料所产了实体的综合质量明显好于其他原料；从产量上看，单一原料以大米为最好，平均每瓶(40g原料)产干虫草3.84g;复合原料以大米+蛹粉产量最高，平均每瓶(40g原料)产干虫草《76g。表1栽培原料对北虫草生长的影响海瓶子实体干重<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、不同蛹粉浓度对北虫草生长的影响由实验可知，添加蛹酚可有效增加北虫草子实体产量，在此基础上进一步考察不同蛹粉浓度对虫草生长的影响(结果见表2)。结果表明，蛹粉的浓度在5%-15%时虫草栽培的子实体质量好，产量均有明显的提高，15%时产量最高，子实体干重为4.79g;浓度为25%时，表现出草迟缓，产量降低。表.2蛹粉不同浓度对北虫草生长的影响/%_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>子实体评价+++++++++++子实体产量/g4.394.644.794.421.023、不同原料含水量对北虫草生长的影响含水量对虫草子实体产量影响很大(表3)，以大米+蛹粉为原料栽培生产，分析实验数据知含水量在65%时有较高的子实体产量，质量也好。表3原料含水量对北虫草生长的影响含水量455055606570菌丝体发育周期/d333435353543子实体质量评价++++++++++++++子实体产量/g4.074.334.394.694.853.194、不同pH值对虫草生长的影响以85份大米+15份蛹粉为原料栽培生产，含水量定为65%，从表4.4数据可知，虫草对pH的适应范围较广，在原料起始pH在3.5-8.5均可生长出子实体，其最适宜pH为7.5。表4不同pH值对北虫草生长的影响3.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5子实体质量评价+++++++++++++++++++++++++子实体产量/g0.851.483.254.024.444.564.794.754.923.761.745、不同温度对北虫草生长的影响应用前面优化出的最佳条件培养，考察不同温度变化对北虫草子实体产量的影响。由表4.5知在温度为13-27°〇范围均可出草，23'C为虫草最适温度，此时北虫草子实体干重为4.93g。表5温度对北虫草生长的影响温度1315171921232527子实体质量评价+++++++++++++++++++子实体产量/g1.952.863.424.224.734.933.841.426、不同光照强度对北虫草生长的影响光照对北虫草了实体的生长影响很大(表6)。黑暗处理不产生子实体；连续光照与问隔光照均能产生子实体；在500-700lx的散射光照处理的子实体产量最高。表6光照对北虫草生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>得到人工栽培北虫草菌株的最优培养条件为原料为85份大米+15份蛹粉，原料的最适含水量为65%，子实体最适生长温度为23°C;最适pH为7.5，黑暗培养不利于子实体生长，在500-7001x的散射光照时产量最高。7、喷洒赤霉素与不喷洒赤霉素北虫草固体培养子实体效果比较制备羟基磷灰石纳米粒子一赤霉素，可使赤霉素包裹在羟基磷灰石纳米粒子孔径中，起到缓慢释放的作用，从而在整个北虫草生长周期中，仅需喷洒羟基磷灰石纳米粒子一赤霉素一次。分别在培养瓶培养大约7天，将羟基磷灰石纳米粒子—赤霉素喷洒在菌表面；继续在培养室内进行培养，直至子实体生长己有2cm高左右时，在子实体表面喷洒一次。表7喷洒赤霉素对北虫草固体培养子实体有效成分的有效成分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在北虫草子实体生长过程中添加植物生长素后，培养时间縮短14天左右。菌丝体在PH6.5—一7.5时生长较快。产量可增加1/3左右(即原来可生产100公斤情况下，喷洒赤霉素好后生产130公本发明相对现有北虫草子实体的培养工艺优点在于可促进北虫草的生理代谢机能，加快生长速度，縮短了北虫草培养周期，可由目前的常规培养周期50天左右缩短到26天左右，产量可提高30%，可进一步满足市场对北虫草的需求。图1为发明培养的北虫草子实体照片。图2为常规方法培育的北虫草子实体照片。具体实施方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1一、北虫草的培养①马铃薯培养基(PDA培养基)配置②将北虫草菌株接种于PDA斜面，26'C恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成浓度约为3"(^个/mL的孢子悬液。③栽培培养基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分装于玻璃瓶内，121°C35分钟灭菌备用。④用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，每罐头瓶培养基加2mL孢子悬液(孢子浓度为3"(^个/mL)，后用灭过菌的竹筷将米饭搅拌均匀，用封口膜封好，转入培养室培养。温度控制在23"C左右，空气相对湿度为60%左右，黑暗培养，菌丝封底后室内增加散射光，培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期。⑤菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度19-25'C，相对湿度60-80%，每天通风10min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，温度保持20-23'C左右，空气湿度60-85%左右，每天通风换气3次，每次10min。二、添加植物生长素羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素制备及喷洒①溶液配置溶液A配制准确称取无水乙酸f丐O.705g，加重蒸水定容至10ml，摇匀备用；溶液B配制准确称取磷酸二氢铵1.381g，乙酸铵4.008g，加重蒸水45ml，用浓氨水调节pH值在7.6左右，补加重蒸水定容至50ml，摇匀备用；②羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素制备步骤l准确称取赤霉素lrag，溶液B溶解，缓慢搅拌；步骤2将溶液A逐渐滴加到溶液B中，保持反应体系温度在37±rC，pH值7.4±0.2之间，缓慢搅拌l小时；步骤3反应液4。C下10000rpm/min离心15分钟；步骤4离心后沉淀室温下干燥48小时，4'C保存。③称取羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素0.2g，用水定容1000ml，备用。④在培养瓶培养大约7天左右，即已从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将0.1%的植物生长素喷洒在菌表面。由于羟基磷灰石纳米粒子一植物生长素具有缓慢释放作用，因此在北虫草生活周期中只需要喷洒一次。⑤培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。北虫草子实体产量:每40g固体培养基得北虫草子实体干重5.16±0.4g。参见图1权利要求1、一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，具体操作步骤包括1)北虫草的培育①马铃薯培养基②将北虫草菌株接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成浓度约为3*107个/mL的孢子悬液；③栽培培养基85份大米+15份蛹粉，含水量65％，分装于玻璃瓶内，121℃35分钟灭菌备用；④用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，每罐头瓶培养基加2mL孢子悬液，孢子浓度为3*107个/mL，后用灭过菌的竹筷将米饭搅拌均匀，用封口膜封好，转入培养室培养；温度控制在23℃左右，空气相对湿度为60％左右，黑暗培养，菌丝封底后室内增加散射光，培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期；⑤菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度19-25℃，相对湿度60-80％，每天通风10min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，在500-700lx的散射光照，温度保持23℃左右，空气湿度65％左右，每天通风换气3次，每次10min；2)喷洒植物生长素羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备及喷洒①溶液配置溶液A配制准确称取无水乙酸钙0.705g，加重蒸水定容至10ml，摇匀备用；溶液B配制准确称取磷酸二氢铵1.381g，乙酸铵4.008g，加重蒸水45ml，用浓氨水调节pH值在7.6左右，补加重蒸水定容至50ml，摇匀备用；②羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备步骤1准确称取赤霉素1mg，溶液B溶解，缓慢搅拌；步骤2将溶液A逐渐滴加到溶液B中，保持反应体系温度在37±1℃，pH值7.4±0.2之间，缓慢搅拌1小时；步骤3反应液4℃下10000rpm/min离心15分钟；步骤4离心后沉淀室温下干燥48小时，4℃保存；③称取羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素0.2g，用水定容1000ml，备用；④在培养瓶培养大约7天左右，即已从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将0.1％的植物生长素喷洒在菌表面；⑤培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。全文摘要本发明提供一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，将北虫草菌株接种于PDA斜面，恒温箱中培养制成孢子悬液；用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，转入培养室培养；在营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将羟基磷灰石纳米粒子—赤霉素喷洒在菌表面，应用纳米技术达到缓慢释放赤霉素的目的，在整个北虫草生长周期中，仪需喷洒一次；子实体生长已有2cm高左右时，将羟基磷灰石纳米粒子—赤霉素喷洒在子实体表面喷洒一次；培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。本发明培育的北虫草子实体生长周期缩短14天左右，产量可提高30％，可进一步满足市场对北虫草的需求。文档编号C12N1/14GK101215528SQ200810050239公开日2008年7月9日申请日期2008年1月11日优先权日2008年1月11日发明者孟繁宇申请人:孟繁宇