专利名称：：免疫富集丝检测细菌的方法及免疫富集刷的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品检验检疫领域，具体的说是免疫富集丝检测细菌的方法及免疫富集刷。技术背景在我国加入WTO的今天，各种商品的流通范围越来越大，速度加快，各种食品、畜产品、卫生用品等商品的检验，尤其是关系到人类到生命健康及动物安全的致病性细菌的检验，如沙门氏菌、志贺氏菌、出血性大肠杆菌0-157、李斯特氏菌、空肠弯曲菌等的检验要求也进一步提高；这些项目的检测是我们检验检疫机构的主要工作内容，是国内市场及进出境把关的主要任务和目的，因其关系到人类及动物的卫生健康安全，成为食品检疫的必检项目。用于从食品中分离致病性细菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是不相同的。至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，致病性细菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰致病性细菌的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的致病细菌受到了尚不致命的损伤或称"致伤"。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出致病性细菌的食品分析来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养"致伤，，的致病性细菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。这些方法本身证明是可靠的，基于上述原因，我国的现行标准，无论是GB标准还是SN标准，都采用比较传统的做法，每个项目总体可分4个不同阶段或步骤1、都要将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，前增菌(4-6小时)；2、选择适合检测目的菌生长，又能使样品中其他微生数量减少的培养基，进行选择性增菌(24-48小时)；3、选择性培养物在琼脂平板上划线分离培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认(24-48小时)——挑选特征菌落进行纯培养(24小时)，4、生化培养鉴定(24小时)和血清鉴定。做出以阳性或未检出报告结果。整个过程大约七天。这种方法经过几十年的应用，证明比较可靠，但检验操作繁瑣、检验周期长。选择性增菌的时间大约24小时——48小时，占到检验流程的三分之一时段，不但费时而且浪费人力物力，不适应现在检样数量大，检验出具报告快速、样品结果重复性高的要求。目前国内外应用免疫学方法的实验所用固相载体多为各种材质的微珠，比如金胶体、乳胶体、磁性珠等，还有常用的绵羊红血球等微颗粒固相载体，抗体所反应的目的抗原也多为病毒或其他小分子可溶性抗原及半抗原(如药物、激素等)，出现沉淀凝集反应，微载体需要反应后，通过磁场或离心沉淀，再从样品中分离出来，进行示踪检查或微流控仪器检查，这些方法不适用于要培养微生物活菌，进行分离鉴定无菌操作的要求；微颗粒固相载体越来越小有的甚至达到纳米级，成本也随之增高，并且需要特别的造价昂贵仪器设备。用免疫学技术对很多病毒的检测，或各种可溶性抗原进行检测，在酶标ELISA试剂盒的研制与开发,在国际有许多大公司开发了大量产品，技术成熟、得到了广泛的应用,不但快速敏感,而且价廉，容易操作，机器数据读取,结果客观重复性高，适应大批量快速检测的需求,而对微生物的免疫学方法检测现在所研究的多是针对其核酸检测,因为微生物在加工中灭杀时，其基因仍残存，而我们要求看有无具繁殖能力的活菌存在，活菌和死菌难以区分，影响报告结果。因此核酸检测要靠核酸量大祛除非特异性，量大只能是在菌分离培养之后，所以免疫学方法的应用，基本局限在最后的鉴定时用，及部分代替生化实验，往往还需要价格昂贵的仪器，不适合在食品卫生检测中大规模推广和应用。另外，用单一免疫方法检测致病细菌，由于细菌表面结构复杂，其抗原较多，同属细菌中有致病菌也有非致病菌，如A族链球菌为致病菌，而粪链球菌一般不致病，此外，不同细菌之间，细菌与宿主之间也可能存在共同抗原，故实际所开展的研究方面很少根据抗原检测判断致病细菌。现在有免疫磁珠法包现行标准虽然比较可靠，但是样品前增菌过程，细菌只是恢复或修复损伤，也有细菌数不增或者下降的。选择增菌时以鸡肉检验沙门氏菌为例是取十倍稀释液前增菌再十倍稀释选择性增菌，也就是说25克样品要有25个细菌以上才有可能检出，从另一方面讲细菌经选择性增菌会繁殖大约N/100x220-Nx24G，相当于Nxl()5—1012，而这些菌分布在100ML或250ML之内，即Nxl03—101()/ML分离培养量沙门氏菌是用10uL,相当于1ML的1(T2，目的菌大约NxlO—108,而这些菌数是理论上的数字，由于微生物繁殖到一定数量，其代谢产物就会阻止繁殖，营养消耗殆尽引起细菌死亡，而使菌数繁殖进入平台期，尤其是在样品为多相菌液时，会各种菌争夺营养，或代谢产物拮抗作用，目的菌繁殖代数会更少一些。3M试剂3MPetrifilmTMPlates微生物快速检测法，通过了许多国际相关组织和机构的认证认可，比如AFNOR-France、AOAC、Canada,是直接对样品进行呈色计数培养，也可以进行进一步的分离鉴定，是目前检测培养微生物最快捷的方法，比较常见的致病微生物项目基本都有培养基试纸片，这种方法对固体样品的检出线在10个菌以上/克，而现在国标行标MPN法的检出线是30个/每100克，这种检出差距在30多倍，而且这种3M试剂的菌检有苛刻的菌量限量要求，在杂菌多或菌量大时，培养的菌落容易融合一片，看不出结果，对下一步的分离鉴定都有影响，其检测成本也较高。
发明内容本发明的目的是为了克服上述现有技术的不足，引进免疫学方法来代替标准检验的选择性增菌的过程，减少检验环节，缩短现行标准的流程，而提供免疫富集丝^f企测细菌的方法。具体操作步骤如下A、按现行的标准采样，需要前增菌的进行前增菌；B、将富集丝直接或间接包被针对要检测的特定细菌的单克隆或多克隆抗体，制成免疫富集丝，免疫富集丝放入待检样品中0.5-1小时富集^r测目的细菌，将免疫富集丝取出后，用灭菌生理盐水进行洗涤，机械卸载细菌到适当的选择培养基平板上，分离培养24士3小时，或直接放到适当的选择培养基平板上分离培养24士3小时，其间培养到4-6小时时，弃掉免疫富集丝；所述的富集丝选自聚乙烯丝、尼龙丝、锦纶丝中的一种；C、挑选典型菌落，以下按现行标准继续操作，报告检出或未检出。在做组织样品检测时，采用三层拍打袋，中间有一层滤网，组织放在滤网一侧，免疫富集丝放在另一侧富集细菌。本发明又一目的是提供免疫富集刷，它包括刷柄和刷头，刷头是由刷板和刷毛组成，刷毛植在刷板上，刷柄和刷板可拆装，与富集丝同样材料制成，刷毛是所述的免疫富集丝。所述的免疫富刷的刷板长为15mm，刷毛为单排。所述的刷毛在包被抗体前，为0.1-0.2毫米直径的白色透明原丝，刷毛端部经过磨细打毛。所述的免疫富集刷的刷板或刷毛带有代表包被不同抗体的标记。所述的免疫富集刷，还包括一个刷架，刷架中间有一刷架孔，刷架柄通过刷架孔与刷架连接，刷架上带有2-6个刷头，刷架柄、刷架、刷头三部件，可以自由组装和拆卸。本发明又一目的是提供免疫富集网，它是由所述的免疫富集丝制成的网。所述免疫富集网为圆形，网隔为3-5mm,直径小于所使用平皿直径6-10mm,有弹性框架。聚乙烯、聚丙稀和尼龙材料，有着良好的吸附抗体IgG的作用，使用时，先将刷头包被抗体，刷板插入刷架槽内，把刷架放入样品中富集细菌，然后刷柄插入刷架孔与刷架固定，拿出后，用生理盐水洗涤，去掉非特异性吸咐，手握刷柄，刷毛在选择平板上划线；长1.5厘米的单排聚乙烯或尼龙材料的刷毛，可以方便的进行活化和抗体包被处理，刷架、刷柄为聚丙稀材料，有与刷架连接的刷柄，这两种部件无生物活性作用，可以方便的进行煮沸消毒，组装成方便适用的免疫富集刷，免疫富集刷有毛针结构，毛端经过磨细打毛，纤维的表面有些细微的粗糙，有利于吸附作用，也使毛在琼脂上的硬度和接触角度更为适宜；免疫富集刷的作用和操作如同细菌分离常规使用的白金尔，使目的菌在培养基上分离和增殖形成典型菌落；视情况菌量少划全板；菌量多时划部分板，再用白金尔从富集刷划过的区域打到清净区域，以获得好的单个菌落；免疫富集刷的刷板或刷毛带有代表包被不同抗体的标记，可以同时检测不同细菌。在做组织样品检测时，采用三层拍打袋，中间有一层滤网，组织放在滤网一侧，富集丝放在另一侧富集细菌，防止肌肉组织纤维缠绕在免疫富集丝上。免疫富集网也是由聚乙烯或尼龙材料丝做成的孔径适宜的方格网，由弹性良好的框架固定，在前期的准备和操作中免疫富集网可以折叠，体积减小，方便包被抗体清洗等各项操作，对样品细菌富集反应清洗后，直接放分离琼脂上，打开折叠，框架支撑使每个网线均匀分布和紧贴在分离琼脂上，富集的菌在接触培养基后，繁殖定植后(4-6小时)，取下免疫富集网，菌落的培养形态和特征不会受到影响，达到分离目的菌的目的。本发明免疫富集丝检测细菌的方法，适用于所有要求检测沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌0-157等各种致病微生物检验的样品，其原理是采用抗原抗体在电解质溶液中能够特异性结合的性质，用聚苯乙烯丝或其他不带表面电荷的有相对弹性的固相载体(免疫分离介质)分别包被需检测的项目高效价抗体，制成免疫富集丝，直接放入到检验制备的样品中或经复苏的样液中，经过短时间的醉育，捕捉相对应的病原微生物(靶抗原)，经过生理盐水洗去非特异性吸附，然后机械卸载或直接进行分离培养，抗原抗体复合物对微生物的正常生长没有影响，免疫富集丝富集目的菌，代替了部分前增菌和选择性增菌，省去选择增菌，缩短了检测时间，达到了现行标准检验的效果，对于某些种细菌来说优于现行标准；是对现行标准的改良；使用免疫富集刷、免疫富集网操作更方便、效果更佳。图1为本发明免疫富集刷刷头的结构示意图图2为本发明免疫富集刷各组件的装配图图3为本发明免疫富集刷的结构示意4为本发明免疫富集刷法和现行标准检测沙门氏菌的流程5为本发明免疫富集网放在平皿上的结构示意图其中1、为免疫富集丝2、为弹性框架3、平皿具体实施方式实施例l免疫富集刷请参见图1、图2、图3，免疫富集刷包括刷柄4、刷架3、刷毛l和刷板2组成的刷头，刷架上带有刷架孔31和3个刷架槽32，刷板2插入刷架槽32中，刷柄4的一端41插入刷架孔31中。使用时，先将刷头包被抗体，刷板2插入刷架槽32内，把刷架3放入样品中富集细菌，然后刷柄4插入刷架孔31与刷架3固定，用生理盐水洗涤刷架3、刷板2及刷毛1，手握刷柄4，刷毛l在选择平板上划线。实施例2免疫富集刷和免疫富集网抗体包被将免疫富集刷和免疫富集网，用100ml0.04mol/LpH8.6的巴比妥緩冲液内加0.2%鸡蛋清，浸泡，4。C过夜，倒去液体PBS清洗3次,控干；或用用O.lmol/LPH9.6碳酸盐緩沖液配置浓度为2Q/。的戊二醛,加入戊二醛浸泡4。C过夜，倒去液体PBS清洗3次，控干；取预处理后的富集刷和富集网，浸泡于提纯的免疫球蛋白IgG溶液中，该溶液用0.05mol/LpH4.8柠檬酸緩冲液稀释成需要的2mg/ml浓度，4"C冰箱过夜,第二天甩去液体，PBS清洗3次，然后加2%甘油作为保护剂浸泡，控干，自然干燥。实施例3标准方法和免疫富集刷法及免疫富集网检测沙门氏菌的对比试验，请参见附图5。实验室收到具有代表性的，而且运输或储存过程中没有损坏或改变的冻鸡肉，同时用标准方法和免疫富集刷法及免疫富集网法进行沙门氏菌^r测1、国标检测肉食品中样品的检测标准方法A、制备测试样品进行非选择增菌将用无菌的剪子、镊子，以无菌方法取多点交叉位的瘦肉25g(确保样品的代表性)十225mlBPW，拍打袋进行拍打30秒，置37。C水浴中将原始悬浮液于37士rC培养18士2h。进行前增菌，确保濒于死亡的细菌进行复活；B、选择增菌将上述的非选择增菌培养物0.1ml接种到10mlRVS肉汤的试管中；另取lml接种到10mlMKTTn肉汤试管中。接种到RVS肉汤的试管于41.5士1。C培养24土3h;接种到MKTTn肉汤试管于37士rC培养24士3h。进行选择性增菌，使目的菌优胜出来；C、划线与鉴定将培养后的增菌培养物摇匀，在超净工作台中，以无菌方法分别取3mm接种环一环，分别划线于表面无凝结水的第一种选择性平板XLD和第二种选择性平板DHL平板，以获得好的单个菌落。倒置平板，使底部位于上面，于37。C培养24土3h进行分离培养，用选择性的平板，使目的菌分离出来，(如果没有可疑菌，可继续培养24士2h)确定平板上典型的沙门氏菌菌落或可能的非典型沙门氏菌菌落，在平板的底部标示它们的位置；D、确认实验在每种选择性平板中各选取2-3个典型菌落，如果选择性平板中为阴性，则要选择4个以上的菌落来进行确认试验，接种于TSI、赖氨酸脱羧酶琼脂或尿素酶琼脂上，于37士rC培养24士3h，记录高层和斜面的颜色、培养基变黑、有气泡或培养基开裂显示产气以及斜面上划线处的菌落生长；检查直立培养的TSI和U琼脂；丟弃或重新划线分离任何最初培养时生长过于密集的试管，丢弃所有在U琼脂斜面上显红色的试管，分离显示典型沙门氏菌反应的菌林，分离沙门氏菌反应不典型的菌林，需要结合生化试验和血清学试验进行确认。2、免疫富集刷法A、将用无菌的剪子、镊子，以无菌方法取多点交叉位的瘦肉25g(确保样品的代表性)+225r^BPW，放中间带滤网的三层拍打袋进行拍打30秒，置37。C水浴中将原始悬浮液于37士rC培养4h，进行前增菌；然后将免疫富集刷放到三层拍打袋样品的另一边，感做45分钟；B、将免疫富集刷取出用灭菌生理盐水进行洗涤，富集刷分别划线于表面无凝结水的第一种选择性平板XLD和第二种选择性平板DHL平板，视情况划全板(菌量少)或部分板(菌量多时用白金尔从富集刷划过的区域打到清净区域，以获得好的单个菌落)，于37。C培养24士3h;确定平板上典型的沙门氏菌菌落或可能的非典型沙门氏菌菌落，在平板的底部标示它们的位置C、和标准方法相同方法做确认性试验。3、免疫富集网法A、将用无菌的剪子、镊子，以无菌方法取多点交叉位的瘦肉25g(确保样品的代表性)十225m旧PW,放中间带滤网的三层拍打袋进行拍打30秒，置37。C水浴中将原始悬浮液于37士l。C培养4h;进行前增菌；然后将富集网放到三层拍打袋样品的另一边，感做45分钟；B、将免疫富集网取出用灭菌生理盐水进行洗涤，免疫富集网分别放置于表面无凝结水的第一种选择性平板XLD和第二种选择性平板DHL平板，使底部位于上面，于37。C培养4士2h进行分离培养，弃取免疫富集网，继续培养至24士3h，使目的菌分离出来，确定平板上典型的沙门氏菌菌落或可能的非典型沙门氏菌菌落，在平板的底部标示它们的位置；C、和标准方法相同方法做确认性试验共检测200例，检出阳性5例，三种方法结果相同。免疫富集刷法及免疫富集网;f企测沙门氏菌比标准方法节省时间40小时。实施例4标准方法、3M试剂3MPetrifilmTMPlates微生物快速检测法、和富集法进行分离培养鉴定实验比较。结果如下表对食品肉制品等固体样品金黄色葡萄球菌检测<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5:对检测添加菌的最低检出线敏感性实验将埃希氏大肠杆菌标准菌抹放到生理盐水中，250毫升加一白金尔，菌量计数后稀释到10tfU/m1,菌液作10倍递减稀释至1(T5,每个稀释度用免疫富集刷和富集网进行捕获，分离培养，计算检出率，并与标准方法和3MpetrifilmTMpiates微生物快速检测法分离作比较，大肠菌群行业标准MPN方法的检出线为固体样品100gZ30CfU，液体样品100mlZ3Cfb,富集刷和富集网检出无显著差异，均在10Cfb/ml以上时能100%检出，菌液检出的状况详见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3MpetrifilmTMPlates微生物快速检测法、富集法与标准方法检出的差别很大，在用标准方法检测时，由于有双料培养基，可以取10倍量样品，所以检出差别如此，这是由于单纯标准菌液无干扰，无濒死或损伤菌，检测液稀释和取样不均衡造成的差别，富集刷和富集网无明显差别，略优于3MpetrifilmTMpiates微生物快速检测法。我们在做检样标阳对照时，用225毫升稀释液加入一白金尔标阳菌抹相当于5微升，100%可检出，我们用富集刷法100%可检出，在225毫升加入1微升添加时亦可100%检出。标准方法的前增菌时间为几小时到拾几小时，然后是选择性增菌24-48小时，而用富集刷法，刷在多相裣，样液体内孵育和富集，可以相应缩短部分前增菌时间，富集刷在分离平板上进行涂抹，视样品状况涂抹平板的面积l/2—全部，比如如果样品潜在目的菌少-全涂，目的菌多则少面积涂，然后用白金尔划线平板的其余部分，比标准方法的节省30-50多个小时。实施例6:从混合菌液中分离细菌利用沙门氏菌培养基分离培养沙门氏菌，利用PB琼脂平板分离培养金黄色葡萄球菌，从制备的分别含有104CFU/ML沙门氏菌和金黄色葡萄球菌混合菌液，菌液作IO倍递减稀释至10"，每个稀释度用免疫富集刷进行捕获，分离培养和菌落计数，计算检出率。项|^\_10JCfu/ml10'Cfu/ml10'Cfu/ml10"Cfu/ml10-lCfu/ml金黄色葡萄球*集刷7/77/77/73/70/7沙门氏菌富集刷7/77/72/70/70/7致病性金黄色葡萄球菌含有葡萄球菌A蛋白，葡萄球菌A蛋白具有与哺乳动物抗体IgG的结合作用，所以在我们用免疫学方法固化抗体去特异性捕获目的抗原时，如杲在多相检样中同时存在致病性金黄色葡萄球菌时，会有干扰，好在选择培养基会对这种干扰的抑制效果理想，但对除金黄色葡萄球菌以外的其他致病性的^^r出有一定影响。实施例7:从组织模拟样本中分离菌在出口肉鸡企业目的菌阴性样本，在无菌操作下取25克样品，IO倍稀释，拍打袋拍打30秒，加入标准埃希氏大肠杆菌液5微升，轻轻震荡混匀，做不同稀释度，利用相应的免疫富集刷(网)进行朴获，分离培养，并与直接分离培养做检验分析，在做组织样品检测时，由于组织样品中的肌肉组织纤维，容易缠绕在刷上，因此我们这里用三层拍打袋，中间有一层滤网，组织在一边免疫富集刷(网)在另一边；特异性鉴定利用鉴定培养基的显色反应，菌落形态，血清凝集实验及纯培养的生化实验进行鉴定和数据计算。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例8富集时间对吸附的影响。朴获细菌的灵敏度利用已经确定的免疫富集刷的最佳朴获条件，检测免疫富集刷朴获特异性细菌的灵敏度，将含有104CFU/ML菌液，将免疫富集刷放入，在室温下轻轻震荡搅拌感做不同时间5分钟、IO分钟、20分钟、30分钟，然后洗涤3次，每个样本分别接种选择平板，观察记录分离结果如下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、免疫富集丝检测细菌的方法，具体操作步骤如下A、按现行的标准采样，需要前增菌的进行前增菌；B、将富集丝直接或间接包被针对要检测的特定细菌的单克隆或多克隆抗体，制成免疫富集丝，免疫富集丝放入待检样品中0.5-1小时富集检测目的细菌，将免疫富集丝取出后，用灭菌生理盐水进行洗涤，机械卸载细菌到适当的选择培养基平板上，分离培养24±3小时，或直接放到适当的选择培养基平板上分离培养24±3小时，其间培养到4-6小时时，弃掉免疫富集丝；所述的富集丝选自聚乙烯丝、尼龙丝、锦纶丝中的一种；C、挑选典型菌落，以下按现行标准继续操作，报告检出或未检出。2、根据权利要求1所述的免疫富集丝检测细菌的方法，在做组织样品检测时，采用三层拍打袋，中间有一层滤网，组织放在滤网一侧，免疫富集丝放在另一侧富集细菌。3、免疫富集刷，其特征在于它包括刷柄和刷头，刷头是由刷板和刷毛组成，刷毛植在刷板上，刷柄和刷板可拆装，与富集丝同样材料制成，刷毛是所述的免疫富集丝。4、根据权利要求3所述的免疫富集刷，其特征在于所述的免疫富刷的刷板长为15mm,刷毛为单排。5、根椐权利要求4所述的免疫富集刷，其特征在于所述的刷毛在包被抗体前，为0.1-0.2毫米直径的白色透明原丝，刷毛端部经过磨细打毛。6、根据权利要求3、4或5所述的免疫富集刷，其特征在于刷板或刷毛带有代表包被不同抗体的标记。7、根据权利要求3、4或5所述的免疫富集刷，其特征在于还包括一个刷架，刷架中间有一刷架孔，刷架柄通过刷架孔与刷架连接，刷架上带有2-6个刷头，刷架柄、刷架、刷头三部件，可以自由组装和拆卸。8、根据权利要求6所述的免疫富集刷，其特征在于还包括一个刷架，刷架中间有一刷架孔，刷架柄通过刷架孔与刷架连接，刷架上带有2-6个刷头，刷架柄、刷架、刷头三部件，可以自由组装和拆卸。9、免疫富集网，它是由所述的免疫富集丝制成的网。10、根据权利要求9所述的免疫富集网，其特征在于为圆形网，网隔为3-5mm,直径小于所使用平皿直径6-10mm，有弹性框架。全文摘要本发明涉及食品检疫检验领域，具体的说免疫富集丝检测细菌的方法及免疫富集刷，是对现行标准的改良，富集丝直接或间接包被针对要检测的特定细菌的单克隆或多克隆抗体，制成免疫富集丝，直接放入到检验制备的样品中或经复苏的样液中，富集相对应的细菌，经过生理盐水洗去非特异性吸附，然后直接进行分离培养，抗原抗体复合物对微生物的正常生长没有影响，免疫富集丝富集目的菌，代替了部分前增菌和选择性增菌，缩短了检测时间，达到了现行标准检验的效果，对于某些种细菌来说优于现行标准；使用免疫富集刷或免疫富集网操作更方便、效果更佳。文档编号C12Q1/04GK101215598SQ20081005024公开日2008年7月9日申请日期2008年1月11日优先权日2008年1月11日发明者于师宇,刘和平,李训德,肖成蕊,阳蔡申请人:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局