专利名称：：Vbnc沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，确切地说是“活的非可培养状态”沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法。
背景技术：
：细菌活的非可培养状态(ViablebutNon-culturable，VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，常被看作VBNC细菌鉴定、检测所用的最能客观评价VBNC的基本技术手段。目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在AppliedandEnvironmentalMicrobiology刊物上的一篇题为《ResuscitationofSalmonellaentericaSerovarTyphimuriumandEnterohemorrhagicEscherichiacolifromtheViablebutNonculturableStatebyHeat-StableEnterobacterialAutoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30％牛血清和50μmol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/LNH4NO3，1.84mmol/LKH2PO4，3.35mmol/LKCl，1.01mmol/LMgSO4，2.77mmol/L(pH＝7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下首先将SAPI培养基6000r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有102～103个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37℃厌氧培养至OD620＝0.4时，细菌数量增多，浓度可接近108个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达1年的细菌恢复为可培养状态。从总体上讲，该种方法复苏效果较好，但存在的缺点也较多。(1)复苏液所涉及的材料种类多，至少需要8种不同成份；(2)某些材料取材不便，如羊血需要新鲜采集，现采现用；(3)各种成份浓度配比需要足够精确，否则严重降低复苏效率，有时甚至使VBNC菌得不到复苏。随着VBNC细菌研究领域的不断扩大和深入，原有复苏方法中存在的缺陷需要进一步得到克服和解决。
发明内容本发明目的在于提供一种用料少、取材方便的VBNC沙门氏菌的复苏液。它是由下列的重量份组成血清1份、灭菌纯水1～3份。所述的血清是指牛血清或胎牛血清，所述的灭菌纯水是选自经过高压蒸汽灭菌的纯净水、双蒸水或用微孔滤器除去水中杂质的普通蒸馏水。优选为血清1份、灭菌纯水2份。本发明另一个目的是提供本发明VBNC沙门氏菌的复苏液制备方法该方法包括血清和灭菌纯水，按所述的比例，混合搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌。为了保证本发明VBNC沙门氏菌复苏液质量，需对其进行无菌检验，检验用按常规方法配制的SS琼脂平板，将过滤除菌的VBNC沙门氏菌复苏液均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养1～2天，无任何菌落生长，表明复苏液合格，分装，置于-20℃保存。本发明又一个目的是提供VBNC沙门氏菌的复苏方法。该方法包括(1)将进入VBNC的沙门氏菌，用灭菌生理盐水清洗，6000～8000r/min离心3～5min，弃上清；(2)将步骤(1)菌体沉淀物和本发明VBNC沙门氏菌的复苏液混匀，置于热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；(3)将菌体沉淀物倒入适于沙门氏菌液体培养基中培养；步骤(3)所述的培养基为SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min，培养8～48h。步骤(2)所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，是从5℃开始直到36℃，每个整数温度热处理2min，37℃热处理1h。所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为5℃温育20～30min，10℃温育20～30min，10℃温育20～30min，25℃温育20～30min，37℃温育1～1.5h。所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为15℃温育20～30min，25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。采用本发明复苏后的沙门氏菌，取10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养18～24h。按菌落计数法记录复苏后细菌数量，并与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果相差102～103个CFU/mL，均表示复苏成功。采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后沙门氏菌16sRNA同源序列，为同一株菌。本发明克服现有技术存在的用料多，取材不便等缺点，解决了细菌VBNC检测及研究领域中的技术难题，本发明仅仅采用一种材料，利用程序性升温，自行建立了一套复苏方法，对处于VBNC近1年之久的沙门氏菌实现了复苏。不但所用原料较少，操作简便，而且复苏菌浓度在12h内就能达到108个CFU/mL，各项复苏指标(时间、细菌数等)也较原有技术大幅度提高。具体实施例方式实施例1VBNC鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株(S578)的制备取可培养菌数为106～107个CFU/mL的鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株(S578)菌液1mL至无菌离心管中，8000r/min离心3min，弃上清，然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清，然后将菌体沉淀接于VBNC诱导液中，于4℃需氧条件培养，定期计量可培养菌数，活菌数与总菌数，待可培养菌数为零时，证明沙门氏菌进入VBNC。实施例2VBNC沙门氏菌的复苏液制备及检验将牛血清和双蒸水(经高压蒸汽灭菌处理)，按1∶1～3比例轻轻搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌；得复苏液；按常规方法配制SS琼脂平板，将过滤除菌的血清均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养1～2天，无任何菌落生长，表明复苏液合格；复苏液分装，置于-20℃备用。实施例3VBNC沙门氏菌复苏取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀物溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶3配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序1设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养24h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表2。复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC57816sRNA同源序列，结果见SEQIDNO.1、2。表1热程控循环仪编制复苏升温与温育时间程序表2复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较实施例4VBNC沙门氏菌复苏取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶1配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序2设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，200r/min，培养8h；取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养18h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表3。复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQIDNO.1、2。表3复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较实施例5VBNC沙门氏菌复苏取实施例1进入VBNC的细菌2mL，6000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶2配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序3设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养18h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表4。复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQIDNO.1、2。表4复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较实施例6VBNC沙门氏菌复苏取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶2配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序4设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养24h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表2。复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQIDNO.1、2。表5复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较SEQUENCELISTING<110>吉林农业大学<120>VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法<160>2<210>1<211>1106<212>RNA<213>复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株16sRNA序列<400>1<210>2<211>1447<212>RNA<213>正常状态鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株16sRNA序列<400>权利要求1、VBNC沙门氏菌的复苏液，它是由下列的重量份组成血清1份灭菌纯水1～3份。2、根据权利要求1所述的VBNC沙门氏菌的复苏液，其特征在于，它是由下列的重量份组成血清1份灭菌纯水2份。3、根据权利要求1所述的VBNC沙门氏菌的复苏液制备方法，该方法包括血清和灭菌纯水，混合搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌。4、VBNC沙门氏菌的复苏方法，该方法包括(1)将进入VBNC的沙门氏菌，用灭菌生理盐水清洗，6000～8000r/min离心3～5min，弃上清；(2)将步骤(1)菌体沉淀物和本发明VBNC沙门氏菌的复苏液混匀，置于热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；(3)将菌体沉淀物倒入适于沙门氏菌液体培养基中培养。5、根据权利要求4所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于步骤(3)所述的培养基为SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min，培养8～48h。6、根据权利要求4或5所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于步骤(2)所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，是从5℃开始直到36℃，每个整数温度热处理2min，37℃热处理1h。7、根据权利要求4或5所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为5℃温育20～30min，10℃温育20～30min，10℃温育20～30min，25℃温育20～30min，37℃温育1～1.5h。8、根据权利要求4或5所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为15℃温育20～30min，25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。9、根据权利要求4或5所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。全文摘要本发明公开了一种VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法，复苏液是由血清1份、灭菌纯水1～3份组成，经混合搅拌混匀，用微孔滤器过滤除菌制得；将进入VBNC的沙门氏菌置于复苏液中，在热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；然后接种于SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min培养；本发明克服现有技术存在的用料多，取材不便等缺点，本发明仅仅采用一种材料，利用程序性升温，对处于VBNC近1年之久的沙门氏菌实现了复苏；不但所用原料较少，操作简便，而且复苏菌浓度在12h内就能达到108个CFU/mL，各项复苏指标(时间、细菌数等)也较原有技术大幅度提高。文档编号C12R1/42GK101423808SQ20081005155公开日2009年5月6日申请日期2008年12月9日优先权日2008年12月9日发明者影李,钱爱东,锐段,王伟利申请人:吉林农业大学