诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及专用培养基的制作方法

专利名称：诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导人胚胎干细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种体外 诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及其专用培养基。
背景技术：
由各种原因(病毒、药物、肿瘤及遗传性疾病等)引发的终末期肝病严重威胁人 类健康。据统计，全国每年仅死于终末期肝衰竭的患者就超过ll万人。目前，这类 疾病的治疗主要依赖于原位肝移植，但是，供体的极度短缺、移植及手术本身相关的 死亡、终生服用免疫抑制剂及其所致的致死性并发症等一系列问题极大地限制了这一 治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓 解上述问题，但其来源细胞同样也面临着存活期短，难以大量扩增，特别是随着培养 时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻求合适的肝细胞来源已属迫在眉睫。
1998年，人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hES cells)的成功建系打 开了体外生产可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。因此，体 外定向诱导人ES细胞分化为肝脏细胞成为目前研究的热点。
拟胚体(embryoid body, EB)是ES细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期 胚胎的球体结构，其三胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞分 化的过程，可以作为研究哺乳动物胚胎发育尤其是早期谱系决定、胚层相互诱导等现 象的理想体外模型。
活化素A (activinA)是TGF P家族成员之一，研究发现，在低血清的条件下
它能高效诱导胚胎干细胞向定型内胚层的分化。
碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,简称bFGF或FGF2)是 成纤维细胞生长因子家族的基本成员，在多种细胞(成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌 细胞、神经细胞等)的增殖、迁移、分化和生存中起到重要的支持作用，尤其在启动 肝芽形成的过程中发挥不可忽视的基础性作用(Jung J, et al. Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblasts growth factors. Science 1999; 284(5422): 1998-2003)。人bFGF有五个亚型，分别为18、 22、 22.5、 24和34ku，其中18ku为基本亚型，其通过旁分泌和自分泌途径来促进细胞增殖和迁 移。慢病毒载体(lentiviral vectors)系统具有如下特点病毒不具备自身复制能 力，具有自身灭活机制；宿主范围广，人、鼠等多种属多类型细胞都能被高效感染； 在稳定整合宿主基因组的基础上增加了高效感染静止期细胞，高效表达外源蛋白，同 时还能逃避甲基化抑制的特点。

发明内容
本发明的目的是提供用于体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hES cells)定向分化为肝细胞的专用培养基。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于体外诱导人胚胎干细胞定 向分化为肝细胞的专用培养基，包括以下4种培养基其中，分化培养基I (拟胚体 分化培养基)是在DF-12培养基的基础上添加了 15-25% (体积百分浓度，V/V)血 清替代物，0. 05-0. 15mM p-巯基乙醇和0. 5-1. 5mM谷氨酰胺，pH 7. 2-7. 6;分化培养 基II (定型内胚层分化培养基)是在DF-12培养基的基础上添加了 0.5-1.5% (体积 百分浓度，V/V)胎牛血清(FBS) ， 0.05-0. 15raM p-巯基乙醇，0. 5-1. 5mM谷氨酰胺 和lOOng/ mL活化素A (activin A) ， pH 7.2-7.6;分化培养基III (肝细胞诱导条件 培养基)是按体积比l-4: 4-1比例混合的FLSC条件培养液与H叩atoZYME-SFM(可购 自GIBCO公司)，pH 7. 2-7. 6，所述FLSC条件培养液的配方为每lOOmL培养基含HDMEM 培养基45mL， DF-12培养基45mL，胎牛血清lOraL;分化培养基IV (肝细胞诱导分化 培养基)是在分化培养基UI的基础上添加了 15-25ng/mL肝细胞生长因子(HGF)， 5-15ng/mL制瘤素(0SM)禾P 10—6-10—8M地塞米松(DEX) ， pH 7.2-7,6。
上述用于体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的专用培养基的配方中，分化 培养基I和分化培养基II中P-巯基乙醇的浓度均优选为0. lmM，谷氨酰胺的浓度均优 选为lmM;分化培养基III中FLSC条件培养液与HepatoZYME-SFM的混合比例优选为 1: 1;分化培养基IV中肝细胞生长因子HGF的浓度优选为20ng/mL，制瘤素OSM的浓 度优选为10ng/mL，地塞米松DEX的浓度优选为10—7mM。
所述分化培养基I和分化培养基II中还添加有作为营养物质的0. 5-1. 5% (体积 百分浓度，V/V)非必需氨基酸。
本发明的第二个目的是提供一种体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法。
本发明所提供的体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法，可包括以下步
骤
1)拟胚体(EB)的形成及向定型内胚层的分化将人胚胎干细胞用分化培养基I
(拟胚体分化培养基)悬浮，再将细胞悬液移入低吸附性细菌培养皿中，在37"C、 5
5% C02下培养l-3天形成拟胚体后，再将拟胚体用分化培养基II (定型内胚层分化培养 基)在相同条件下培养2-4天后分化为定型内胚层细胞；
2)诱导定型内胚层细胞向肝细胞分化将步骤1)分化的定型内胚层细胞接种到 表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞(FLSCs)饲养层上，加入 分化培养基III (肝细胞诱导条件培养基)，在37"、 5% C02下共培养4-6天后，再 更换为分化培养基IV (肝细胞诱导分化培养基)，在相同条件下继续培养5-20天， 得到肝细胞。
在上述体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法中，为了提供足够的细 胞数量，所述步骤l)中将人胚胎干细胞进行分化培养前，还包括对其进行传代扩增 的步骤，方法为将人胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层上，用培养基V (无血清人胚胎干细胞培养液)，在37。C、 5%0)2下培养，每天更换培养液，培养至第5-7天细胞呈集落状汇合生长，然后用 机械法 (Methods for expansion of human embryonic stem cells. Stem Cell, 2005， 23:605-609)分离克隆进行传代，即按1:4-6的比例接种于新的含MEF 词养层的培养mi中，在相同条件下进行培养；所述培养基V是在分化培养基I的基 础上添加了 4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) ， pH 7.2-7.6。
步骤l)中拟胚体的形成培养时间优选为2天，由拟胚体分化为定型内胚层细 胞的培养时间优选为3天。
为提高分化效率，步骤2)中将定型内胚层细胞接种到表达碱性成纤维细胞生 长因子的人胎肝基质细胞(FLSCs)饲养层之前，还包括先对其用体积/体积(V/V)百 分比浓度0. 1-0. 4% (优选为0. 25% )的胰酶消化成单个细胞的步骤。
步骤2)中表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转化有碱性成纤 维细胞生长因子基因的转基因人胎肝基质细胞；所述碱性成纤维细胞生长因子基因 优选为18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子基因。
可按照常规方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染人胎肝基质细胞，如通过含 有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统等将碱 性成纤维细胞生长因子基因导入人胎肝基质细胞。
所述利用慢病毒载体系统将碱性成纤维细胞生长因子基因导入人胎肝基质细胞 的方法，可包括以下步骤
A) 将碱性成纤维细胞生长因子基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体 中，得到携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体；
B) 将携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统
6中的两种包装质粒和包膜质粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1. 5-2. 5:2. 3-3. 3的重量份数比 混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有碱性成纤维细胞生长因子 基因的重组慢病毒；
C)将携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒转染人胎肝基质细胞， 得到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。
在上述表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的构建方法中，所述步骤 A)中的碱性成纤维细胞生长因子基因优选为18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子基 因；慢病毒载体系统中的目的基因转移载体为pBPLV，是将pMAl载体(该载体参考文献 (Amendola M， et <3义 Coordinate dual—gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat
Biotechnol, 2005， 23(1) :108-116))用限制性内切酶尸"I和5W I进行双酶切(切除 两个酶切位点之间的基因片段)后与正义链为5， -ggctagcatgctctagagcgctg-3，， 反义链为3' -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5'的多克隆位点序列连接得 到。)。
步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒可为pLPl和pLP2 (均可购自 Invitrogen公司)，该包装质粒主要起到病毒包装作用，其转录表达后形成病毒衣壳 结构蛋白及酶蛋白；包膜质粒可为pLP/VSVG (可购自Invitrogen公司)，该包膜质 粒转录表达后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包装细胞可为293-FT细胞(可购自 Irrvitrogen公司)。
用上述方法诱导得到的肝细胞也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种利用人胚胎干细胞高度自我更新和增殖的生物学特性，将其体 外定向诱导分化为肝细胞的方法。该方法是利用专用培养基，第一步先将胚胎干细胞 形成类似早期胚胎的球体结构一拟胚体并向定型内胚层细胞分化(这是肝脏发育的必 经阶段，通过activinA的作用使定型内胚层细胞在这一阶段达到高度富集)，第二步 再通过与转bFGF基因的人胎肝基质细胞(饲养层)共培养，以进一步诱导定型内胚 层细胞向肝细胞分化，从而实现体外定向分化为肝细胞的目的(这里有两点因素在起 作用，其一，分泌的bFGF因子促进了向肝细胞的分化；其二，共培养的基质细胞由
于是胎肝来源，因而能够提供更适于肝细胞发育分化的微环境。此外，在这一阶段的 后期，在培养基中又添加了一些常规的促肝细胞成熟的因子HGF、 0SM和DEX。)。本 发明提供的将人胚胎干细胞高效诱导分化为肝细胞的方法提供了一个肝细胞损伤缺 失后的补充来源，并具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，为千细胞移植、 用生物人工肝治疗重症肝炎及肝衰竭等疾病奠定了基础。本发明将在医学领域发挥重
7要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为人胚胎干细胞(hES)与经activin A作用3天的拟胚体(EB)
图2为经activin A作用后的拟胚体表达的胚层标志基因的半定量RT-PCR检测
结果
图3为经activin A作用后的拟胚体表达的胚层标志蛋白的免疫荧光检测结果 图4为FLSCs的流式细胞分析
图5为稳定表达bFGF的FLSCs与转空载体的FLSCs (对照)经Co,照射后作为饲
养层
图6为稳定表达bFGF的FLSCs与转空载体的FLSCs中bFGF基因的半定量RT-PCR 检测结果
图7为稳定表达bFGF的FLSCs与转空载体的FLSCs中bFGF蛋白的Western检测
结果
图8为稳定表达bFGF的FLSCs、转空载体的FLSCs及它们经C,照射后生长曲线 的检测
图9为定型内胚层细胞与FLSCs/bFGF共培养后的细胞形态学观察结果
图10为诱导分化末期细胞表达肝细胞特异性的基因的半定量RT-PCR检测结果
图11为诱导分化末期细胞表达肝细胞早期标志AFP与成熟肝细胞特异性标志ALB
的免疫荧光检测结果
图12为ICG摄取、排泌实验结果
图13为PAS实验结果
图14A和图14B为白蛋白分泌实验结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别均为常规方法，所用引物均由上海英俊合成，所
述百分比浓度均为质量/体积(w/v)百分比浓度或体积/体积(v/v)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物 材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的同类生物材料都可以按
照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物 的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有 文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。实施例1、体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞实施例中使用以下培养基-
分化培养基K拟胚体培养基)在DF-12培养基(Gibco)的基础上添加20%( 15-25%均可，体积百分浓度，V/V)血清替代物(SR， Gibco)， 0. lmM (0. 05-0. 15mM均可)卩-巯基乙醇(Gibco)和lmM (0.5-1. 5mM均可)谷氨酰胺(Gibco) ， pH 7.2-7.6。为增加营养，该分化培养基I中可再添加0.5-1.5% (体积百分浓度，V/V)的非必需氨基酸(HyClone)。
分化培养基II (定型内胚层分化培养基)是在DF-12培养基的基础上添加1%(0. 5-1.5%均可，体积百分浓度，V/V)胎牛血清(FBS) ， 0. lmM (0. 05-0. 15raM均可)p-巯基乙醇，lmM (0. 5-1. 5mM均可)谷氨酰胺和100ng/mL活化素A (activin A)，pH 7. 2-7. 6。
分化培养基III (肝细胞诱导条件培养基)按体积比l: 1 (1-4: 4-l比例均可)
混合的FLSC条件培养液与H印atoZYME-SFM(可购自GIBC0公司)，pH 7. 2-7. 6; FLSC条件培养液的配方为每lOOmL培养基含HDMEM培养基45mL， DF-12培养基45mL，胎牛血清lOmL。
分化培养基IV (肝细胞诱导分化培养基)在分化培养基III的基础上添加20ng/mL(15-25ng/mL均可)肝细胞生长因子(HGF) ， 10ng/mL (5-15ng/mL均可)制瘤素(0SM)和10 7M (10—6-10—、均可)地塞米松(DEX) ， pH 7.2-7.6。
培养基V (无血清人胚胎干细胞培养液)用于人胚胎千细胞的培养扩增，是在分化培养基I的基础上再添加4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Chemicon) ， pH7. 2-7. 6。
用本发明的方法体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells， hEScells)定向分化为肝细胞，具体过程包括以下步骤一、人胚胎干细胞的传代扩增
将人胚胎干细胞(hES，H9，购自WiCell公司)接种在小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast, MEF)饲养层(经Y射线照射灭活有丝分裂活性，然后按3X105个细胞/3.5cm培养皿的密度接种在0. 1%明胶包被的培养皿中，置于37T:培养箱中培养12-24小时，得到用于培养人胚胎干细胞的饲养层)上，用培养基V (无血清人胚胎干细胞培养液)，在37'C、 5%0)2的条件下培养，每天更换培养液，培养至第5-7天细胞呈集落状汇合生长，然后用机械法(Methods for expansion of humanembryonic stem cells. Stem Cell, 2005， 23:605-609)分离克隆进行传代，即按1:5(1:4-6均可)的比例接种于新的含MEF饲养层的培养皿中，在相同条件下进行培养。型内胚层的分化与验证
1、 拟胚体的形成及向定型内胚层的分化
人胚胎干细胞呈集落状生长，用机械法分离步骤一汇合生长的人胚胎干细胞，离 心，将细胞沉淀用分化培养基I (拟胚体分化培养基)悬浮，再将细胞悬液移入35mm 的低吸附性细菌培养皿(购自Greiner公司)中，在37。C、 5% 0)2条件下培养2天(1-3 天均可)形成拟胚体后，再将拟胚体用分化培养基II (定型内胚层分化培养基)在低 血清(体积/体积(V/V)百分比浓度为0.5-1.5X)条件下培养3天(2-4天均可)，使 之分化为定型内胚层细胞。在光学显微镜下观察的人胚胎干细胞(hES)与经activin A作用3天的拟胚体(EB-activin A)如图l所示。
2、 转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证
用TRIzol(Invitrogen公司)试剂并按照说明书中记载的方法提取步骤1中经 activin A作用3天的拟胚体的总RNA,然后反转录其中的mRNA为cDNA，反转录体系 为5XAMV反转录酶缓冲液(购自Takara公司)4nl， dNTPs(10mM) 2yl，腦Ase inhibitor (购自Takara公司)1 w 1， AMV反转录酶(购自Takara公司)0. 5 lU， mRNA2ul，水11.5yl。然后，以反转录形成的cDNA为模板，以人胚胎干细胞(hES) 为阴性对照，分别在引物P1 (上游引物)5' - ATACGCCAGTGACGACCA -3，和P2 (下 游引物)5， - CGACTTGCCCAGCATCTT -3'的引导下PCR扩增目的基因S0X17,在引物 P3 (上游引物)5， - TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA -3'和P4 (下游引物)5，-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA -3，的引导下PCR扩增目的基因AFP，在引物P5 (上游 引物)5， - GTACTCCTCGGTCCCTTTCC -3，和P6 (下游引物)5， - CAAAAACCCTGGCACAAACT -3，的引导下PCR扩增干性基因0CT-4，在引物P7 (上游引物)5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG -3，禾P P8 (下游引物)5， - AAGTGTGACGTTGACATCCG-3，的 引导下PCR扩增参照基因0 -acfi/7， PCR反应体系均为10XPCR缓冲液2u]， dNTPs(2. 5mM) 1.6ul，上、下游引物各liU，模板lyl, rTaq酶O. 2yl，水14.2 yl。 RT-PCR检测结果如图2所示，经分化培养基II (定型内胚层分化培养基)作用 3天后的拟胚体(EB-activin A)中定型内胚层细胞标志基因5ttW7获得表达，而作为 阴性对照的人胚胎干细胞(hES)未检测出该基因，而且脏壁内胚层标志基因 达缺失(因为作为阴性对照的hES细胞是最全能的干细胞(a7W强阳性代表它的全能 干性，A^和6'ftU7阴性代表它没有向下分化)，它有可能向定型内胚层分化，也有可 能向脏壁内胚层分化，后者也表达许多与肝细胞相似的基因，但却不能向前者一样形 成肝脏等实质器官，AFP阴性能排除向它的分化)，证明用本发明的诱导方法已将人胚 胎干细胞分化为定型内胚层细胞。
103、免疫荧光(Immunofluorescence)验证
用免疫荧光(Immunofluorescence)的方法做进一步验证，方法为先用4%多 聚甲醛固定步骤1中经activin A作用3天的拟胚体半小时，然后用0. 1%的Triton X-100破膜30分钟，用正常山羊血清封闭，添加一抗， 一抗为S0X17和AFP (购自R&D 公司)，4。C过夜，用PBS洗涤3次，每次5分钟，再加入二抗，二抗为FITC标记的 山羊抗小鼠的抗体(购自北京中杉公司)，用PBS洗络3次，每次5分钟，用DAPI衬 染细胞核。免疫荧光检测结果见图3所示(FITC表示表达绿色荧光(即该标志阳性) 的细胞，DAPI表示细胞核，Merge表示将前两张图合并之后的情况)，经分化培养基 II (定型内胚层分化培养基)作用3天后的拟胚体(EB)中定型内胚层细胞标志S0X17 获得表达，而作为阴性对照的人胚胎干细胞未检测出该标志物，而且脏壁内胚层标志 AFP表达缺失，从而进一步证明用本发明的诱导方法已将人胚胎干细胞分化为定型内 胚层细胞。
三、稳定表达18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞 (FLSCs)的获得、鉴定及其饲养层的建立
以稳定表达18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞为例，说明本 发明利用慢病毒载体系统构建稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞 的方法，具体方法包括以下步骤
1、 骨髓间充质干细胞(bone mar， mesenchymal stem cells, BMSCs)的分 离、纯化及原代、传代培养
取14周胎龄流产胎儿股骨骨髓，加入DMEM-F12培养液中充分混合，离心弃上 清及脂肪层，加入完全培养基充分混匀后，将骨髓液轻轻叠加到密度1.073g/mL的 Percoll分离液上，900rpm离心30分钟(室温下)，取白细胞膜层以上的部分，加 入含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)中充分混匀， 离心洗涤备用，将分离的细胞按2X107cm2的浓度接种于50mL塑料培养瓶中，置于 37°C， 5%0)2和饱和湿度的孵箱中进行培养，48h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞， 以后每2-3天换液一次。细胞长到80%融合时用0.25%的胰蛋白酶消化传代，细巴 斯德吸管吹打成单细胞悬液后以1X107mL种植于新培养液中，每2-3天换液一次。
以上具体介绍了实验中获取骨髓间充质干细胞的一种方法，不构成对获取骨髓 间充质干细胞的限制。实际应用中，胎儿骨髓间充质干细胞BMSCs可从商业途径购 买或从细胞库中获取，如胎儿来源的骨髓间充质干细胞可以购自北京裕恒丰科技有 限公司，货号7500。
2、 18kDa亚型bFGF基因的扩增根据18kDa亚型bFGF基因的核苷酸序列(GenBank号丽一002006)设计RT-PCR 引物，引物序列如下Pl (正向引物):5， -AACTGCAGATGGCAGCCGGGAGCATC-3'(带 下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)；
P2 (反向引物)5， -ACGCGTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAA-3'(带下划线碱 基为限制性内切酶&7 I识别位点)
提取步骤1获得的胎儿骨髓间充质干细胞的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为 模板，在引物Pl和P2的引导下PCR扩增18kDa亚型bFGF基因，并在所扩增的bFGF 基因的两端分别添加上限制性内切酶尸"I和&7 I识别位点，其中退火温度为54°C。 反应结束后，对PCR扩增产物进行1X琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了大小为486bp 的DNA片段，与预期结果相符。回收并纯化该目的片段，将其连入T载体pGEM-T (购 自Promega公司)中，对该重组T载休用限制性内切酶I进行酶切鉴定，对酶 切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切获得了约500bp的DNA片段，与预 期结果相符，再对该重组T载体进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确 的18kDa亚型bFGF基因。该重组T载体用尸W I和5"W I双酶切，回收并纯化获得的 486bp的DNA片段，将其连入经同样酶双酶切的慢病毒载体系统中的目的基因转移载 体pBPLV (pBPLV是通过将pMAl载体(该载体参考文献(Amendola M, et a义Coordinate dual-gene tr肌sgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol, 2005， 23(1): 108-116))用限制性内切酶尸"I和5"a〗I进行 双酶切(切除两个酶切位点之间的基因片段)后与正义链为 5， -ggctagcatgctctagagcgctg-3，，反义链为
3， -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5'的多克隆位点序列连接而得到的新的慢 病毒载体)中，对得到的重组慢病毒载体用限制性内切酶尸"I和I进行酶切鉴定， 对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切获得了约486bp的DNA片段， 与预期结果相符，表明获得了携带有18kDa亚型bFGF基因的重组慢病毒载体，将其 命名为pBPLV-bFGF。 3、慢病毒包装
培养293-FT (购自Invitrogen公司)慢病毒包装细胞，培养基为添加10% FBS， 0.1 mmol/L NEAA， 2 ramol/L L-谷氨酰胺，1%青-链霉素，500吗/mL G418的高糖 DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat井D5648)。用步骤2构建的携带有18kDa亚型bFGF 基因的重组慢病毒载体pBPLV-bFGF以及空载体pBPLV分别和包装质粒pLPl (购自 Invitrogen公司)、pLP2 (购自Invitrogen公司)及包膜蛋白质粒pLP/VSVG (购自 Invitrogen公司)按5ug: 4. 2ug: 2ug: 2. 8ug的比例混合后加入1. 5mL无血清Opti-MEM*
12I培养基(购自Invitrogen公司)中，轻轻混匀，在另一个无菌的5mL管中将42uL lipofectamine 2000 (购自Invitrogen公司)稀释于1. 5mL的无血清Opti-ME, I培 养基中，室温静置5分钟，混合以上两种液体，室温孵育20分钟以形成 DNA-lipofectamine 2000复合物。用0.25%胰酶(Gibco公司产品，Cat# 25200-056) 消化收集培养的293-FT细胞，计数约6X106个细胞，将其重悬到5mL不含抗生素的 生长培养基(在高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat# D5648)的基础上添加10 %胎牛血清(FBS) (Biochrom公司产品，cat# S0115) ， 0.1 mmol/L非必需氨基酸 (Non-Essential Amino Ac ids, NEAA)(购自HyClone公司)和2 mmol/L L-谷氨酰 胺)中，再将293-FT包装细胞悬液与3mL含有DNA-lipofectamine 2000复合物的培 养基混匀后加入到含有5mL不含抗生素的生长培养基的10cm细胞培养皿中，混匀， 放于37。C、 5%0)2孵箱中培养，次日用含有l mmol/L丙酮酸钠的完全培养基(在高 糖DMEM培养基的基础上添加10%胎牛血清，0. 1 mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%青-链霉素和l画ol/L丙酮酸钠)更换含有DNA-lipofectamine 2000 复合物的培养基进行包装，并分别在包装24、 72小时后取样，对经包装的293-FT细 胞在荧光显微镜下进行观察，结果包装24小时后即可见到293-FT细胞内有绿色荧光 蛋白eGFP表达(eGFP基因为慢病毒载体pBPLV携带)，表达绿色荧光蛋白eGFP的细 胞超过95%，表明包装效率很高，且伴随着包膜质粒pLP/VSVG中VSVG基因的表达， 逐渐出现293-FT细胞的多细胞合胞体，包装72小时后培养上清为淡黄色，此时收集 病毒液上清于15mL的无菌离心管中，4'C、 3000rpm离心15rain去除细胞碎片，将病 毒上清冻存于-7(TC备用。
4、胎儿肝脏基质细胞的分离、培养及细胞表面标志检测
采用从14周胎龄流产胎儿分离的肝脏组织，用生理盐水灌注血管，将组织中的血 液充分冲出，取体积约为0.5cm3的组织块，去除筋膜等，用消毒灭菌剪刀将肝脏组织 剪碎成lmm3大小，将其排列于25腿2的培养瓶中，每瓶种20块组织，然后将其倒置于37 °C、 5%0)2的孵箱中，约0.5小时后将培养瓶翻转，加入约3mL胎儿肝脏基质细胞培养 基(高糖DMEM培养基和DF-12培养基(Sigma公司产品，Cattt D0547)按l:l体积比混 合后加入体积百分浓度为10%的胎牛血清(Biochrom公司产品，cattt S0115)，放入 孵箱中在相同条件下继续培养，约2天后可见有细胞从组织块边缘爬出，继续培养至 细胞铺满培养瓶底面积的80%时，将细胞用0.25%胰酶消化下来，连同组织块一起种 入新瓶中，24小时后换液，去除不贴壁的细胞及残留组织块，细胞长满以后进行常规 传代培养。用0.25%胰酶消化并收集传代至第15代的胎儿肝脏基质细胞，用PBS洗涤2 次，以去除细胞表面残留血清蛋白的影响，细胞计数后等分成10管，分别标记待测抗体(PE标记的小鼠抗人CD29、 CD105抗体和FITC标记的小鼠抗人CD34、 CD44、 CM5、 CD71、 CD90抗体均购自BD公司)及相应对照抗体(PE和FITC标记的小鼠IgG抗体均购 自中杉金桥公司)，每管细胞数不少于5X105，室温避光标记半小时后，用PBS洗涤细 胞2次，以去除残留抗体，最后用1%多聚甲醛固定细胞，用流式细胞术检测表面分子 表达情况；AFP，ALB (购自腿D公司)为间接标记，孵育半小时后，以FITC标记的山羊
抗小鼠的二抗(购自中杉金桥公司)标记一小时，再用ras洗涤细胞2次，以去除残留
抗体，最后用1%多聚甲醛固定细胞，用流式细胞术检测表面分子表达情况，结果如 图4所示，由图4可以看出，胎儿肝脏基质细胞基本不表达造血细胞表面标志CD45和 CD34;而其它基质细胞表面标志(CD90， CD71， CD44， CD29, CD105)却高表达，表明 获得的胎儿肝脏基质细胞是一群MSC样细胞。
与胎儿来源的骨髓间充质干细胞的获取类似，实际应用中不推荐使用以上实验方 法来获取胎儿肝脏基质细胞，而可选用通过商业渠道购买或从细胞库中获取的胎儿肝 脏基质细胞。
5、 慢病毒感染人胎肝基质细胞(FLSCs)和感染后重组胎儿肝脏基质细胞的流式 细胞术分选
病毒感染前一天于六孔板中接种人胎肝基质细胞(步骤4所指的胎儿肝脏基质细 胞)，至细胞密度为3乂105细胞/孔，感染时，每孔加入lraL步骤2获得的病毒上清 和终浓度为8iug/mL的聚凝胺(polybrene，购自Sigma公司)促进病毒的转染效率，晃 动培养瓶使病毒液能接触到所有细胞，3小时后加入3mL人胎肝基质细胞培养基(高 糖DMEM培养基和DF-12培养基(Sigma公司产品，Cat# D0547)按1:1体积比混合后 加入体积百分浓度为10%的胎牛血清(Biochrom公司产品，cat#S0115)，再过3h， 更换新的培养基。荧光显微镜观测结果表明慢病毒可高效率的转染胎儿肝脏基质细 胞，转染后的细胞通过流式细胞术进行分选，将感染有携带bFGF基因的重组慢病毒 载体pBPLV-bFGF和空载体pBPLV的人胎肝基质细胞分别命名为FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV (如图5所示，a和b分别为光学显微镜和荧光显微镜下观察的 FLSCs/bFGF， c和d分别为光学显微镜和荧光显微镜下观察的FLSCs/pBPLV)。
6、 RT-PCR方法检测转染细胞bFGF基因的表达情况
分别取步骤5中经分选获得的1 X 106个FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，提取细胞 总RNA后，用RT-PCR方法检测bFGF基因在mRNA水平的表达情况(所用引物为Pl和 P2)，同时用e-actin基因作为内参(所用正向引物序列为 5， -GATCCACATCTGCTGGAAGG-3，，反向引物序列为
5， -AAGTGTGACGTTGACATCCG-3，)，退火温度均为54。C。反应结束后，对PCR扩增产
14物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图6所示，FLSCs/bFGF经扩增分别获得了大 小约为486bp的bFGF基因片段和大小约为222bp的0 -actin基因片段，而阴性对照 仅扩增出了 P-actin基因片段，表明bFGF基因在FLSCs/bFGF中获得表达。
7、 Western blot方法检测转染细胞bFGF的表达水平
分别取步骤5中经分选获得的1X 106个FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，用放射性 免疫沉淀裂解缓冲液RIPA (50mmol/L Tris HC1 (pH8. 0) ， 150mmol/L NaCl， l鹏ol/L DTT， 0. 5隱ol/LEDTA， 1.0% NP40， 0. 5%去氧胆酸钠，0. 1%SDS， 100 ii g/mL PMSF， lPg/mL胰蛋白酶肽，2yg/mL亮抑制肽，100 u mol/L正钒酸钠)裂解细胞，然后对 裂解细胞进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用半干式电转的方法 将蛋白质转移至PVDF膜，接着用5X脱脂奶粉封闭2h，再与相应的一抗(小鼠抗人 bFGF宇-克隆抗体，购自Chemicon公司，Cat # : MAB120)和辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗小鼠二抗(购自中杉金桥公司)孵育后，用化学发光试剂(购自SemtaCruz 公司，Cat#:SC-2048)于暗室自显影，同样用P -actin蛋白作为内参(一抗为小鼠 抗人e-actin的多克隆抗体，购自Chemicon公司)。检测结果如图7所示，FLSCs/bFGF 中的bFGF基因和P -actin基因均可在蛋白水平上获得表达，而阴性对照FLSCs/pBPLV 仅e-actin基因在蛋白水平上获得表达。
8、 伺养层细胞的制备及cck-8法绘制生长曲线
取步骤5中获得的FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，以25GY剂量的CcT进行照射， 得到稳定表达18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质饲养层细胞与作为对 照的转空载体的人胎肝基质饲养层细胞，分支冻存备用。用0.25%胰酶消化步骤4中 获得的FLSCs/bFGF、 FLSCs/pBPLV和步骤8中获得的Co，照射后的FLSCs/bFGF、 FLSCs/pBPLV，以每孔104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200uL，每块板接 种20孔(每种细胞各5孔)，共6块板。接种后，将培养板放入37。C、 5%0)2孵箱 中进行培养，待细胞贴壁后取一个培养板，每孔加入cck-8溶液10nL，然后继续在 孵箱中孵育lh，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，测3次， 记录结果，作为第0天数据，以后每隔24小时取出一个培养板，用相同方法进行比 色，最后以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长曲线，如图8所示，FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV两组的细胞数量逐渐增长,而经过C,照射后的FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV两组(即y-irradiated FLSCs/bFGF和y- irradiated FLSCs/pBPLV)
的细胞数量不再增长，可作为饲养层细胞。
四、FLSCs/bFGF作为饲养层与定型内胚层细胞共培养(肝细胞的诱导分化)并观 察促肝系分化的效果1、 肝细胞的诱导分化
将步骤二分化的定型内胚层细胞先用体积/体积(V/V)百分比浓度0. 25%的胰酶 消化成单个细胞，接种到步骤三预先铺被的表达18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子 的人胎肝基质细胞饲养层FLSCs/bFGF和作为对照的转空载体(pBPLV)的人胎肝基质 饲养层FLSCs/pBPLV上，加入分化培养基m (肝细胞诱导条件培养基)，在37。C、 5 % C02下共培养5天(4-6天均可)后，再更换为分化培养基IV (肝细胞诱导分化培 养基)，在相同条件下继续培养6天(5-20天均可)，每2-3天更换培养液，用下述 方法观察共培养促肝系的定向诱导分化效果。
2、 细胞形态观察
在光学显微镜下观察定型内胚层细胞细胞分别和表达18kDa亚型碱性成纤维细胞 生长因子的人胎肝基质细胞伺养层FLSCs/bFGF和作为对照的转空载体(pBPLV)的人 胎肝基质饲养层FLSCs/pBPLV共培养过程中形态的变化，记录细胞诱导分化的过程， 并取诱导分化第0、 5、 ll天的细胞，吸弃培养液，用PBS洗涤2遍，在4°0下用3%戊二 醛于培养板原位前固定2小时，再用1%锇酸后固定1小时，用蔗糖缓冲液反复漂洗， 用梯度乙醇脱水，加入丙酮后，用树脂渗透、包埋、聚合，用ULTRACUTE/S型切片机 超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，最后用Philips CM120透射电子显微镜观察细 胞超微结构。
显微镜观察结果如图9所示(图中A和B组分别为光学显微镜和透射式电子显微镜下 观察所见的结果)，在光学显微镜下观察到，在共培养之初(Oday)，细胞呈圆形， 细胞核大，核仁多个且明显，随着时间的推移(5day)，细胞逐渐由圆形变为多角形， 可见双核细胞，在分化末期细胞体积变大，多数呈现多角形、铺路石状的上皮样细胞。 在透射式电镜下观察到，共培养ll天后的细胞其内细胞器相当丰富，可见大量特征性 的圆形或椭圆形、大小不一、嵴稀的线粒体、分布于光面内质网周围的簇状糖原颗粒、 溶酶体等细胞器，有些具有双核，细胞之间呈现类似胆小管的管腔状结构，两端以紧 密连接封闭，腔内伸出许多微绒毛突起，符合肝细胞典型的超微结构。细胞形态观察 结果表明用本发明的方法(即通过形成拟胚体并将其先预诱导为定型内胚层细胞，再 与转bFGF基因的人胎肝基质细胞共培养)可将人胚胎干细胞高效定向诱导分化为肝细 胞。
3、 半定量RT-PCR检测人胚胎干细胞诱导前、后相关基因mRNA的表达变化 用与步骤一相同的RT-PCR方法对步骤1经肝系诱导分化的定型内胚层细胞
(ES-h印a),同时以未经诱导分化的人胚胎干细胞(hES)、步骤二中经activin A作 用3天的拟胚体(EB-actinA)、FLSCs/bFGF饲养层细胞和人胎儿肝细胞(fetal liver)
16为对照，在基因mRNA表达水平进行鉴定，鉴定的基因包括力尸尺MA(引物 P9 (上游弓I物)5 ， - TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG -3 ，禾口 P10 (下游弓I物)5 ，-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC -3 ， ) ， C認(弓l物Pll (上游弓l物)5， _ GAGGCATCCAGAACGAGAAG-3 ，禾口 P12(下游弓i物)5， - AGCCTCGATCTCTGTCTCCA-3 ， ) ， C7P7氾 (引物P13 (上游引物):5， - GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3，和P14 (下游引物):5， -GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT -3，(请提供扩增OP7A 的引物序列))禾B ac"仏
RT-PCR检测结果如图IO所示，niRNA水平证实经肝系诱导分化的定型内胚层细胞的 细胞干性(^T-力逐渐减弱，并开始表达肝细胞特异性基因^^F、力^ 、 076>和6T尸7W， 进一步证明用本发明的方法可将人胚胎干细胞高效定向诱导分化为肝细胞。
4、 免疫荧光(Immunofluorescence)验证
用与步骤二相同的免疫荧光检测方法对步骤1经肝系诱导分化的定型内胚层细 胞中表达的肝细胞早期标志AFP与成熟肝细胞特异性标志ALB进行鉴定，所用一抗 分别为AFP和ALB检测抗体(购自R&D公司)，二抗为TRITC标记的山羊抗小鼠的抗 体(购自北京中杉公司)。检测结果如图11所示(TRITC表示表达红色荧光(即该标 记阳性)的细胞，EGFP表示表达绿色荧光蛋白的FLSCs/bFGF作为饲养层，Merge表 示将前两张图片合并后的结果)，用本发明的方法诱导后的人胚胎干细胞可表达肝细 胞早期标志AFP与成熟肝细胞特异性标志ALB，从而从蛋白水平证实用本发明的方法 可将人胚胎干细胞高效定向诱导分化为肝细胞。
5、 靛青绿(indocyanine green， ICG)的摄取、排泌实验 取步骤l经肝系诱导分化的定型内胚层细胞及与之共培养的转bFGF基因的人胎肝
基质细胞(对照)用PBS充分洗涤后，加入lmg/mL ICG (Sigma)于37'C孵育30-60分钟， 在显微镜下观察细胞颜色的变化；再用PBS冲洗2遍，换回完全培养液(高糖DMEM培养 基和DF-12培养基(Sigma公司产品，Cat# D0547)按l: l体积比混合后加入体积百分 浓度为10%的胎牛血清(Biochrom公司产品，cattt S0115))继续常规培养，并观察 细胞颜色的变化。结果如图12所示(a表示诱导后细胞摄取ICG的情况，b表示荧光显 微镜下原位观察周围表达绿色荧光的转bFGF基因的人胎肝基质细胞，c表示两张图片 合并之后的情况)，多数诱导后的细胞被染成深绿色，而与之共培养的转bFGF基因的 人胎肝基质细胞并不能摄取染料变成深绿色；换回完全培养基常规培养l小时之内， 着色细胞的颜色完全退去。上述检测结果表明诱导后的细胞具有代谢染料的能力。
6、 原染色实验(高碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff， PAS)) 用PAS试剂盒(sigma)并参照试剂盒说明书检测步骤l经肝系诱导分化的定型内
胚层细胞及与之共培养的转bFGF基因的人胎肝基质细胞(对照)内的糖原，并在显微
17镜下观察结果。镜检结果如图13所示，诱导后细胞呈紫红色，而周围与之共培养的转 bFGF基因的人胎肝基质细胞则呈阴性结果。上述检测结果表明诱导后的细胞胞浆内富
含糖原颗粒，证明其具有贮存糖原的能力。
7、白蛋白(ALB)分泌实验
用OLYMPUS AU-600全自动生化分析仪(01y卿us， Tokyo, J即an)检测取步骤1 经肝系诱导分化的定型内胚层细胞及与之共培养的转bFGF基因的人胎肝基质细胞培 养上清中ALB的分泌量。结果如图14A所示(横坐标为ALB的分泌量，纵坐标为分 化天数)，表示培养上清中ALB分泌量随分化天数的变化情况；图14B表示不同组间 ALB分泌量的比较(其中1和2分别代表单独培养的hES细胞和FLSC/bFGF， 3和4 分别代表定型内胚层细胞分别与FLSC/bFGF和FLSCs/pBPLV词养层细胞共培养，5 代表阳性对照(人胎肝基质细胞)，*表示差异显著)，显示随诱导时间的延长ALB分 泌量逐渐增加，而且与FLSCs/bFGF共培养的分化细胞的ALB分泌量显著高于与 FLSCs/pBPLV共培养的细胞，证明bFGF的确在促肝系分化中具有重要作用。
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权利要求
1、用于体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的培养基，包括依次使用的以下四种培养基其中，分化培养基I即拟胚体分化培养基是在DF-12培养基的基础上添加了15-25％血清替代物，0.05-0.15mM β-巯基乙醇和0.5-1.5mM谷氨酰胺，pH7.2-7.6；分化培养基II即定型内胚层分化培养基是在DF-12培养基的基础上添加了0.5-1.5％胎牛血清，0.05-0.15mM β-巯基乙醇，0.5-1.5mM谷氨酰胺，和100ng/mL活化素A，pH7.2-7.6；分化培养基III即肝细胞诱导条件培养基是按体积比1-4∶4-1比例混合的FLSC条件培养液与HepatoZYME-SFM，pH7.2-7.6，所述FLSC条件培养液的配方为每100mL培养基含HDMEM培养基45mL，DF-12培养基45mL，胎牛血清10mL；分化培养基IV即肝细胞诱导分化培养基是在分化培养基III的基础上添加了15-25ng/mL肝细胞生长因子HGF，5-15ng/mL制瘤素OSM和10-6-10-8M地塞米松DEX，pH7.2-7.6。
2、 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述分化培养基I和分化培养 基II中p-巯基乙醇的浓度为0. lmM，谷氨酰胺的浓度为lmM;所述分化培养基III中FLSC 条件培养液与H印atoZYME-SFM按1: 1比例混合；所述分化培养基IV中添加了 20ng/mL 肝细胞生长因子HGF， 10ng/mL制瘤素0SM和10—7mM地塞米松DEX。
3、 根据权利要求1或2所述的培养基，所述分化培养基I和分化培养基II中。
4、 体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法，包括以下步骤1) 将人胚胎干细胞用权利要求1或2或3所述的分化培养基I悬浮，再将细胞悬液 移入低吸附性细菌培养皿中，在37"C、 5% C02下培养l-3天形成拟胚体后，再将拟胚 体用权利要求1或2或3所述的分化培养基II在相同条件下培养2-4天后分化为定型内 胚层细胞；2) 将步骤1)分化的定型内胚层细胞接种到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎 肝基质细胞饲养层上，加入权利要求l或2所述的分化培养基m，在37"C、 5% C02 下共培养4-6天后，再更换为权利要求1或2所述的分化培养基IV，在相同条件下继 续培养5-20天，得到肝细胞。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤l)中将人胚胎干细胞 进行分化培养前，还包括对其进行传代扩增的步骤，方法为将人胚胎干细胞接种 在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，用培养基V，在37'C、 5%0)2下培养，每天更换培养液，培养至第5-7天细胞呈集落状汇合生长，然后用机械法分离克隆进行传代， 即按1:4-6的比例接种于新的含MEF饲养层的培养皿中，在相同条件下进行培养； 所述培养基V是在分化培养基I的基础上添加了 4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) ， pH 7.2—7.6。
6、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤l)中拟胚体的形成培 养时间为2天，由拟胚体分化为定型内胚层细胞的培养时间为3天；步骤2)中将定 型内胚层细胞接种到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞词养层之前， 还包括先对其用体积/体积百分比浓度0. 1-0. 4%的胰酶消化成单个细胞的步骤。
7、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤2)中表达碱性成纤维 细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转化有碱性成纤维细胞生长因子基因的转基因人 胎肝基质细胞；所述碱性成纤维细胞生长因子基因优选为18kDa亚型碱性成纤维细 胞生长因子基因。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于利用慢病毒载体系统将碱性成纤 维细胞生长因子基因导入人胎肝基质细胞的方法，包括以下步骤A) 将碱性成纤维细胞生长因子基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体 中，得到携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体；B) 将携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统 中的两种包装质粒和包膜质粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1. 5-2. 5:2. 3-3. 3的重量份数比 混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有碱性成纤维细胞生长因子 基因的重组慢病毒；C) 将携带有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒转染人胎肝基质细胞， 得到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤A)中的碱性成纤维细胞 生长因子基因为18kDa亚型碱性成纤维细胞生长因子基因；慢病毒载体系统中的目的 基因转移载体为pBPLV;步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒为pLPl和pLP2; 包膜质粒为pLP/VSVG;慢病毒包装细胞为293-FT细胞。
10、 用权利要求4-8任一项所述方法诱导得到的肝细胞。
全文摘要
本发明公开了一种体外诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及其专用培养基。该体外诱导方法包括以下步骤1)将人胚胎干细胞用分化培养基I悬浮，再将细胞悬液移入低吸附性细菌培养皿中，在37℃、5％CO₂下培养1-3天形成拟胚体后，再将拟胚体用分化培养基II在相同条件下培养2-4天后分化为定型内胚层细胞；2)将步骤1)分化的定型内胚层细胞接种到表达碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞饲养层上，加入分化培养基III，在37℃、5％CO₂下共培养4-6天后，再更换为分化培养基IV，在相同条件下继续培养5-20天，得到肝细胞。本发明具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N5/08GK101497872SQ200810057539
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月2日 优先权日2008年2月2日
发明者习佳飞, 雪 南, 文 岳, 杨印祥, 王韫芳, 白宗良, 白慈贤, 裴海云, 裴雪涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所