专利名称：放射线剂量的生物检测用报告质粒及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因质粒及其构建方法，即放射线剂量的生物检测 用报告质粒及其构建方法。
背景技术：
电离辐射对健康的危害和辐射安全评估，各种条件下的急、慢性辐射损伤的分类、诊断 和治疗等都需要了解和确定受照射的剂量。放射线剂量的生物检测是利用生物材料如组织、 细胞、DNA、蛋白质等在电离辐射后发生的、与辐射剂量存在的一定量一效关系的某个方面 的改变，利用这种可测、可记录和分析的生物改变来度量辐射剂量的一类生物标记物及分析 方法。与物理检测相比，利用生物进行剂量检测的最大优势是直接和忠实代表性。
目前进行放射线剂量的生物检测的方法很多，常用的有放射线照射后DNA损伤而形 成的彗星尾与未受损的细胞表现的彗星核心之间的关系来研究预测放射线剂量的单细胞凝胶 电泳(慧星试验)法(Berwick and Vineins, 2000):也有通过调查射线照射后的细胞所引起 的染色体的双着丝粒、交换或易位等损伤指标来估算放射线剂量的染色体畸变分析法 (Ballarini and Ottolenghi, 2003; Duran W W,， 2002; Camparoto " a〖.，2003 )，但这些方法的共 同缺点是存在操作复杂、检测的成本较高、损伤观察时人为因素较多、很难准确定量等缺点； 虽通过计算机等辅助手段的利用可以适当提高其度量的精度，但这些方法只能对低剂量的放 射线进行检测和度量，对于高剂量放射线的生物检测和度量的方法目前还没有。迫切需要有 一种使用方便、精确度高，同时又能对高剂量的放射线进行生物检测的方法。
发明内容
本发明的目的是公开一种放射线剂量的生物检测用报告质粒以及这种生物测定用报告 质粒的构建方法。以及这种放射线剂量的生物检测用报告质粒的应用。
本发明的这种放射线剂量的生物检测用报告质粒是以抗辐射菌一大肠杆菌间的穿梭载 体为基础，与具有北美产萤火虫(P/zorim^ ;^rafc)的寄主DNA由来的荧光素酶基因lux领 域的DNA片段重组，构建成具有荧光素酶基因的抗辐射菌一大肠杆菌间穿梭载体报告质粒。
具体构建方法为以下步骤 (1)穿梭载体质粒的构建
用QIAfilter Plasmid kit (德国QIAGEN)从抗辐射菌De/"ococc^ rad/o/wg"a/M中提取质 粒pUE30并进行Sphl酶切，用Sphl消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆
菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Z)e!力ococow ra&o^ra朋中有活性的氯霉素抗性基因 的质粒pKatCAT，再与上述pUE30的Sphl消化物混合，用DNA连接酶连接，采用电穿孔法 将上述连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连 接的质粒的株，获得穿梭载体质粒。 (2)报告质粒的构建
在上述穿梭载体质粒的Mfe I酶切位点插入荧光蛋白酶基因丄wc+，构建成质粒；设计包 含限制性内切酶A^e I位点的DNA损伤修复基因wc A的启动子的引物，PCR增幅DNA损 伤修复基因wcA的启动子，将上述PCR产物顺向插入上述质粒的荧光蛋白基因丄wcf上游的 iV&I部位，由此形成测定用的报告质粒。
所述DNA损伤修复基因A的启动子的引物序列为
SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat
SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga
本发明放射线剂量的生物检测用报告质粒的应用
将上述测定用的报告质粒转化抗辐射菌的野生型Rl中，获转化体抗辐射菌，供Y-射线 照射。将转化体抗辐射菌培养到稳定期，用Y-射线进行照射，照射后再进行培养，以性状转 化体的发光量为依据，测定不同剂量Y-射线照射后的发光量。不同剂量射线照射后得到不同 的发光量。
本发明的优点
本发明能解决现有技术放射线剂量生物检测法的各种问题。如能够提高剂量检测的精 确度，已有的单细胞凝胶电泳(慧星试验)法及染色体畸变分析法的操作复杂、检测时人为 因素较多、很难准确定量；而本发明的报告质粒根据荧光量的有无及荧光量的多少就能正确
进行定性和定量。其次，单细胞凝胶电泳(慧星试验)法及染色体畸变分析法等只能对低剂
量的放射线进行定量，不能对高剂量的放射线进行定量；而本发明的报告质粒除能对低剂量 的放射线进行定量外，对于高剂量的放射线也能进行定量。同时，本发明的报告质粒在抗辐 射菌中具有高荧光素酶活性，可实时监控重组转化子的生育状况等。 本发明的应用前景
本发明的报告质粒可作为高、低放射线剂量的生物检测，可以广泛应用于核发电站等核 设施、医院等放射线照射设施及其他具有放射源场所的检测，也可应用于环境中放射性物质 的污染检测，同时可作为一个生物感应器来感应多种DNA损伤剂。本发明的报告质粒具有 荧光素酶基因，在实时监控重组转化子的生育、分布及对环境的影响等方面也非常有用。
具体实施例方式
以下根据实施例详细介绍本发明，本发明没有限定这些实施例。 (1)穿梭载体质粒的构建
从抗辐射菌(De/"ococcus racfo; wg"a"ce ATCC19172)中提取质粒pUE30并进行Sphl酶 切；接着用Sphl消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp 抗性基因、抗辐射菌rat//o^/raM Rl中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res,, 435: 151-161, 1999)，再与上述pUE30的Sphl消化物混合，用 DNA连接酶连接。采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株。从抗Amp的转化株 中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒的株，得到穿梭载体质粒。
(2) 报告质粒的构建
以抗辐射菌Z)e/wococa^ ra^'o^ra似的基因组DNA为模板，SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示的碱基序列(根据Meima等的论文自行设计，J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001)合成 的DNA为引物，用Pfo Turbo DNA polymerase (Stratagene)进行PCR反应，增幅Meima 等(J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001)记载的在抗辐射菌De/"ococciw rado血rara中具有活 性的已知的groEL启动子领域。然后用Ncol内切酶消化含有荧光素酶基因的质粒pSP-lux+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara)进行DNA断片末端的平滑化。最后，将上述 的PCR产物与平滑化的pSP-lux+连接，得到pGroE-lux。
用HindIII消化上述质粒，进行切断末端的平滑化处理，再用EcoRV进行消化，得到 含有groEL启动子和荧光素酶基因的DNA断片，将这一 DNA片断插入步骤1所获穿梭载体 质粒的EcoRV部位，构建具有荧光素酶基因的质粒，用构建的荧光素酶基因质粒转化 Z)e&ococrasgram;fe，得到具有荧光素酶基因的菌株。
(3) 荧光素酶活性的测定
将上述得到的重组转化子在TGY培养基中3(TC培养，然后进行不同剂量Y-射线照射， 再继续培养，24 hr后将培养液10 |aL与等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega) 混合，1分钟后用Lumi Imager (Roche Molecular Biochemicals)测定1分钟间的化学发光活性。 由测定得知，不同剂量射线照射后菌体的发光量不同，照射剂量与发光量之间的相关系数达 0.892 (达极显著水平)。 使用方法及其效果
将含有放射线剂量生物检测用报告质粒的抗辐射菌培养于玻璃容器内，将该容器放在需 要测定的地方，被曝一定时间后取回容器，再在30。C条件下继续培养24hr。取培养液10nL 与等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution(Promega)混合，1分钟后用Lumi Imager (Roche MolecularBiochemicals)测定1分钟间的化学发光活性。根据发光量的多少就可以估算被测地 的放射性剂量。
根据研究结果，在使用的0-2000 Gy的剂量范围内，不同剂量gamma-射线照射后菌体的 发光量与照射剂量之间的相关系数为0.892，达极显著水平。
序列表
<110>浙江大学
<120>放射线剂量的生物检测用报告质粒及其构建方法 <160> 2
<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA损伤修复基因rec A的启动子的引物序列 <400> 1
ttgtcagctt cggtcagttg acat 24
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA损伤修复基因rec A的启动子的引物序列 <400> 2
tggggtcctc ctgtgagtga 20
权利要求
1、放射线剂量的生物检测用报告质粒，其特征在于以抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体为基础，与具有北美产萤火虫(Photinuspyralis)的寄主DNA由来的荧光素酶基因luc领域的DNA片段重组，构建成具有荧光素酶基因活性的抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体的报告质粒。
2、 如权利要求1所述放射线剂量的生物检测用报告质粒的构建方法，其特征在于以下步骤:(1) 构建穿梭载体质粒用QIAfilter Plasmid kit从抗辐射菌De/"ococc附ra&opwg加ra中提取质粒pUE30并进行 Sphl酶切，用SpM分别消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性 的Amp抗性基因、抗辐射菌D""ococc^ ra&o^rara中有活性的氯霉素抗性基因的质粒 pKatCAT，再与上述pUE30的SphI消化物混合，用DNA连接酶连接，采用电穿孔法将上述 连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的 质粒的株，获得穿梭载体质粒；(2) 构建报告质粒在上述穿梭载体质粒的A^el酶切位点插入荧光蛋白酶基因Z"c+，构建成质粒；设计包 含限制性内切酶AWe I位点的DNA损伤修复基因mc A的启动子的引物，PCR增幅DNA损 伤修复基因wcA的启动子，将上述PCR产物顺向插入上述质粒的荧光蛋白基因i:恥+上游的 iV&I部位，由此形成测定用的报告质粒。
3、 如权利要求2所述放射线剂量的生物检测用报告质粒的构建方法，其特征在于所述DNA 损伤修复基因wc A的启动子的引物序列为SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga 。
全文摘要
放射线剂量的生物检测用报告质粒及其制备方法，以抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体为基础，与具有北美产萤火虫的寄主DNA由来的荧光素酶基因lux领域的DNA片段重组，构建成具有荧光素酶基因活性的抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体的报告质粒。将报告质粒转化抗辐射菌的野生型R1中，获转化体抗辐射菌，供γ-射线照射。将转化体抗辐射菌培养到稳定期，用γ-射线照射后再培养，以性状转化体的发光量为依据，测定不同剂量γ-射线照射后的不同发光量。研究结果，在使用的0-2000Gy的剂量范围内，不同剂量γ-射线照射后菌体的发光量与照射剂量之间的相关系数为0.892，达极显著水平。
文档编号C12Q1/02GK101348822SQ20081006191
公开日2009年1月21日 申请日期2008年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者屠振力 申请人:浙江大学