专利名称：一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种产角蛋白酶复合酶的宇 佐美曲霉及其发酵产酶方法。
背景技术：
角蛋白酶复合酶的主要成份为角蛋白酶和普通蛋白水解酶，能够比角蛋白 酶更加快速高效地水解角蛋白，在饲料生产、鞣革、羊毛处理等工业具有广泛 地应用。该法生产的饲料节约能源、成本低、质量好，能够较好的被动物利用。 在含角蛋白的饲料中，添加角蛋白酶复合酶也可以提高动物对角蛋白的吸收利 用，提高经济效益。角蛋白酶复合酶能够选择性的水解羊毛、皮革表面的角蛋 白，有望取代传统的羊毛剥鳞和鞣革工艺，实现传统产业的绿色环保改造。角 蛋白酶复合酶能改善化妆品、外用药物在皮肤中的通透性，在医药、化妆品等 工业也都有着广泛的应用前景。传统方法单独生产角蛋白酶和蛋白水解酶，然 后将它们复合在一起，生产过程复杂、成本相对较高。
宇佐美曲霉mmw/ L88，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏号是CGMCCNo.2296。
发明内容
本发明的目的是提供一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶 方法。
产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉j^eg///^ w^m/L88，保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC No.2296。
所述的宇佐美曲霉形态学特征为菌丝褐色或褐黑色，小梗2层；分生孢
子褐色或褐黑色，粗糙或平滑， 一般大而呈球形，有时不发达。
所述的宇佐美曲霉的5.8 S核糖体具有SEQIDNO.l的DNA序列， 产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉的发酵产酶方法包括如下步骤
1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于20 37QC培养72 360小 时，得到表面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000毫升中含麦芽 汁100 900毫升、琼脂粉10 20克和水100 900毫升；
2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于20 37QC， 80 220rpm条件下培养20 72小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000 毫升中含玉米粉10 30克、大豆粉20 60克、氯化铵5 30克、磷酸氢二钠3
15克、氯化钙3 15克、鱼粉5 40克，蚕蛹水解液10 100毫升，角蛋白0.1 20克;
3) 将发酵种子按发酵培养基体积的3 15%接入发酵罐中，罐温20 37QC、 罐压0.2 1.0kg/cm2，搅拌速率80 220rpm，通气量为h 0,5 1: 2，发酵培 养时间72 360小时，发酵培养基成份为每1000亳升中含玉米粉10 30克、 大豆粉20 60克、氯化铵5 30克、磷酸氢二钠3 15克、氯化钙3 15克、 鱼粉5 40克，蚕蛹水解液10 100毫升，角蛋白0.1 20克；
4) 发酵开始40 150小时后，将占发酵液起始体积5 20%的补料培养基， 在0.1 8小时内持续补充到发酵培养基中，补料培养基成份为每1000毫升中含 蚕蛹水解液10 990毫升，水10 990亳升。
本发明与现有技术相比具有的有益效果
1) 本发明能够一次性生产角蛋白酶和蛋白水解酶的复合酶，具有生产过程 简单、成本低；所得复合酶的相容性好、能避免由于复合酶之间反应造成的酶
活降低甚至失活。
2) 本发明中的发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证宇佐美曲霉L88 的生长和高产酸性蛋白酶需要，又能诱导出大量的角蛋白酶，从而生产出比例 合理，催化能力强的角蛋白酶复合酶。
3) 本发明的发酵过程中利用了对环保不利的角蛋白为底物，成本低，在产 角蛋白酶的同时又能解决环境问题，降解后的角蛋白用于饲料等行业可产生较 高的经济价值。
4) 本发明生产的角蛋白酶复合酶，用于羊毛后整理工业时，能有有效避免 环境污染，防毡縮效果好，产品色泽鲜艳，市场占有率高。
5) 本发明生产的角蛋白酶复合酶，用于角蛋白废弃物处理时，角蛋白降解 速度快、降解率高、氨基酸破坏程度低、营养成份均一，易于被动物吸收和利 用。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。 实施例1
所述的宇佐美曲霉形态学特征为菌丝褐色或褐黑色，小梗2层；分生孢 子褐色褐黑色，粗糙或平滑， 一般大而呈球形，有时不发达。
所述的宇佐美曲霉的5.8 S核糖体具有SEQ IDNO.l的DNA序列。
综合序列和形态学特征，可知所得产角蛋白酶复合酶的微生物为宇佐美曲霉，命名为^rj^gz7/^ wmw/L88，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日 为2007年12月18日，保藏号是CGMCC No.2296。 实施例2
1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于20QC培养360小时，得到 表面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000毫升中含麦芽汁900毫 升、琼脂粉10克和水100毫升；
2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于20CC， 220rpm条 件下培养72小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000毫升中含玉米 粉10克、大豆粉20克、氯化铵5克、磷酸氢二钠3克、氯化钙3克、鱼粉5 克，蚕蛹水解液10毫升，羽毛角蛋白0.1克；
3) 将发酵种子按发酵培养基体积的3%接入发酵罐中，罐温20GC、罐压 0.2kg/cm2，搅拌速率220ipm，通气量为1: 0.5，发酵培养时间360小时，发酵 培养基成份为每1000毫升中含玉米粉10克、大豆粉20克、氯化铵5克、磷 酸氢二钠3克、氯化钙3克、鱼粉5克，蚕蛹水解液10毫升，羽毛角蛋白0.1 克；
4) 发酵开始150小时后，将占发酵液起始体积20%的补料培养基，在8小 时内持续补充到发酵培养基中，料培养基成份为每1000毫升中含蚕蛹水解液990 毫升，水10毫升。
实施例3
1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于37GC培养72小时，得到表 面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000毫升中含麦芽汁100毫升、 琼脂粉20克和水900毫升；
2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于37^， 80tpm条件 下培养20小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000毫升中含玉米粉 30克、大豆粉60克、氯化铵30克、磷酸氢二钠15克、氯化钙15克、鱼粉40 克，蚕蛹水解液100毫升，羽毛角蛋白20克；
3) 将发酵种子按发酵培养基体积的15%接入发酵罐中，罐温37QC、罐压 1.0kg/cm2,搅拌速率80ipm，通气量为1: 2，发酵培养时间72小时，发酵培养 基成份为每1000毫升中含玉米粉30克、大豆粉60克、氯化铵30克、磷酸 氢二钠15克、氯化钙15克、鱼粉40克，蚕蛹水解液HX)毫升，羽毛角蛋白20 克；
4) 发酵开始40小时后，将占发酵液起始体积5%的补料培养基，在0.1小时内持续补充到发酵培养基中，补料培养基成份为每iooo毫升中含蚕蛹水解液
IO毫升，水990毫升。 实施例4
1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于25QC培养168小时，得到 表面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000亳升中含麦芽汁900毫 升、琼脂粉20克和水100毫升；
2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于25°<:， 150rpm条 件下培养42小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000毫升中含玉米 粉10克、大豆粉30克、氯化铵10克、磷酸氢二钠5克、氯化钙5克、鱼粉20 克，蚕蛹水解液50毫升，羊毛角蛋白10克；
3) 将发酵种子按发酵培养基体积的3 15%接入发酵罐中，罐温25^、罐 压0.3kg/cm2，搅拌速率150rpm，通气量为1: 1.2，发酵培养时间88小时，发 酵培养基成份为每1000毫升中含玉米粉10克、大豆粉30克、氯化铵10克、 磷酸氢二钠5克、氯化钙5克、鱼粉20克，蚕蛹水解液50亳升，羊毛角蛋白
10克；
4) 发酵开始40小时后，将占发酵液起始体积10%的补料培养基，在4小 时内持续补充到发酵培养基中，料培养基成份为每1000毫升中含蚕蛹水解液990 毫升，水10毫升。
实施例5
1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于30QC培养144小时，得到 表面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000毫升中含麦芽汁900毫 升、琼脂粉20克和水100毫升；
2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于3(^C， 150rpm条 件下培养30小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000毫升中含玉米 粉10克、大豆粉30克、氯化铵10克、磷酸氢二钠5克、氯化钙4克、鱼粉20 克，蚕蛹水解液80毫升，羊毛角蛋白5克；
3) 将发酵种子按发酵培养基体积的10%接入发酵罐中，罐温30GC、罐压 0.40kg/cm2，搅拌速率150rpm，通气量为1: 1.2，发酵培养时间86小时，发酵 培养基成份为每1000毫升中含玉米粉10克、大豆粉30克、氯化铵10克、 磷酸氢二钠5克、氯化钙4克、鱼粉20克，蚕蛹水解液80毫升，羊毛角蛋白5 克；
4) 发酵开始38小时后，将占发酵液起始体积15%的补料培养基，在6小
时内持续补充到发酵培养基中，料培养基成份为每1000毫升中含蚕蛹水解液990 毫升，水10毫升。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的部分具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。
本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因 此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明 而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出 本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改 变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
序列表
<110>浙江大学
<120> —种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶方法 <160> 1
<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 534 <212> DNA
<213> Aspergillus usami L88 <400> 1
taccgagtgc gggtcctttg ggcccaacct cccatccgtg tctattgtac cctgttgctt 60 cggcgggccc gccgcttgtc ggccgccggg ggggcgcctc tgccccccgg gcccgtgccc 120 gccggagacc ccaacacgaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagttga ttgaatgcaa 180 tcagttaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa 240 atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt 300 gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg 360 gcttgt卿tgggtcgccg tccccctctc cggggggacg ggcccgaaag gcagcggegg 420 cacegcgtcc gatcctcgag cgtatggggc ttt沐acat gctctgtagg attggccggc 480 gcctgccgac gttttccaac cattctttcc aggttgacct cggatcaggt aggg 53权利要求
1.一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉，其特征在于宇佐美曲霉Aspergillususami L88，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC No.2296。
2. 根据权利要求1所述的一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉，其特征在于所述的宇佐美曲霉形态学特征为菌丝褐色或褐黑色，小梗2层；分生孢子褐 色或褐黑色，粗糙或平滑， 一般大而呈球形，有时不发达。
3. 根据权利要求1所述的一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉，其特征在于，所述的宇佐美曲霉的5.8S核糖体具有SEQIDN0.1的DNA序列
4. 一种如权利要求1所述的产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉的发酵方法， 其特征在于包括如下步骤1) 将宇佐美曲霉L88接种到斜面培养基上，于20 37QC培养72 360小 时，得到表面覆盖大量孢子的斜面；斜面培养基成份为每1000毫升中含麦芽 汁100 900毫升、琼脂粉10 20克和水100 卯0毫升；2) 将宇佐美曲霉L88孢子接种到液体种子培养基中，于20 37QC， 80 220rpm条件下培养20 72小时，得到发酵种子；种子培养基成份为每1000 毫升中含玉米粉10 30克、大豆粉20 60克、氯化铵5 30克、磷酸氢二钠3 15克、氯化钙3 15克、鱼粉5 40克，蚕蛹水解液10 100毫升，角蛋白0.1 20克；3) 将发酵种子按发酵培养基体积的3 15%接入发酵罐中，罐温20 37。C、 罐压0.2 1.0kg/cm2，搅拌速率80 220rpm，通气量为1: 0.5 1: 2，发酵培 养时间72 360小时，发酵培养基成份为每1000毫升中含玉米粉10 30克、 大豆粉20 60克、氯化铵5 30克、磷酸氢二钠3 15克、氯化钙3 15克、 鱼粉5 40克，蚕蛹水解液10 100毫升，角蛋白0.1 20克；4) 发酵开始40 150小时后，将占发酵液起始体积5 20%的补料培养基， 在0.1 8小时内持续补充到发酵培养基中，补料培养基成份为每1000毫升中含 蚕蛹水解液10 990毫升，水10 9卯毫升。
全文摘要
本发明公开了一种产角蛋白酶复合酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶方法。所述宇佐美曲霉为Aspergillus usami L88，由本实验室分离获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2296。以该菌为出发菌种，经斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养实现发酵生产角蛋白酶复合酶。本发明公开了该菌种的形态学特征和5.8S核糖体DNA全序列。本发明中公开的发酵培养基由玉米粉、大豆粉、鱼粉、铵盐、蚕蛹水解液、角蛋白、钙盐和磷酸盐组成。此法生产的角蛋白酶复合酶，酸性蛋白酶和角蛋白酶配比合理、酶活高、成本低，在角蛋白废弃物回收利用、鞣革、羊毛织物后处理等工业具有重大环保意义和较高的经济价值。
文档编号C12N9/50GK101338280SQ200810062738
公开日2009年1月7日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者倪利强, 吕龙贤, 李永泉, 沙兴宝 申请人:浙江大学;浙江雀屏纺织化工股份有限公司