专利名称：一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种质粒载体的构建方法。
背景技术：
酿酒酵母(5^c/^ramyc" cewv&^)虽然能利用木酮糖，但因为酿酒酵 母中缺少木糖还原酶，因此不具备木糖代谢能力，不能有效发酵植物纤维水解 液。
发明内容
本发明的目的是为了解决酿酒酵母中缺少木糖还原酶，不具备木糖代谢能 力，不能有效发酵植物纤维水解液的问题，而提供的一种表达木糖还原酶基因 的质粒的构建方法。
表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行 一、克隆休哈塔 假丝酵母菌的^T丄1基因；二、克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列；三、 克隆质粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、纯化步骤一至三制备的基因 片段，然后在分别与pGEMT Easy载体在16。C的条件下连接10~12h，得到 pGMT-JOTl、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、构建质粒pADH，以酿酒酵 母整合质粒p406ADHl为骨架引入ADHt基因；六、构建质粒pAK，将KanR 基因引入质粒pADH中；七、将Z7丄l基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还 原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为 5'-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3，， 下游引物序列为 5'-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3';步骤二中扩增上游引物序列 为5，- CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3，，下游引物序列为5，-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，； 步骤三中扩增上游引物序列 为5'-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3，， 下游引物序列为5，-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ，。
由于不同木糖还原酶(XR)辅酶的偏好性不同，致使木糖按不同的途径
代谢，导致不同代谢产物的积累。本发明方法将木糖还原酶基因zm和乙醇脱氢酶(ADH)的强启动子的终止子序列(ADHt)构建于同一个质粒载体上， 在增添了木糖代谢为乙醇的途径外，还抑制了木糖代谢为木糖醇，能够介导酿 酒酵母高效代谢木糖生产乙醇。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以 下步骤进行 一、克隆休哈塔假丝酵母菌的基因；二、克隆质粒pKT0150 中的ADHt基因序列；三、克隆质粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、纯 化步骤一至三制备的基因片段，然后在分别与pGEMT Easy载体在16。C的条 件下连接10 12h，得到pGMT-^T丄l、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、构建 质粒pADH，以酿酒酵母整合质粒p406ADHl为骨架引入ADHt基因；六、 构建质粒pAK，将KanR基因引入质粒pADH中；七、将^T丄1基因引入质粒 pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为 5，-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC誦3，， 下游引物序列为 5，曙TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3，；步骤二中扩增上游弓|物序列 为5 ，-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3 ，，下游引物序列为5，-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，; 步骤三中扩增上游引物序列 为5，陽TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3，， 下游引物序列为5，-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ，。
本实施方式步骤四用上海华舜生物工程有限公司生产的DNA胶回收试剂 盒(Gel Extraction Mini Kit)进行回收。步骤四连接操作参见试剂盒使用操作手 册。
本实施方式步骤四中的连接产物pGMT-Xm 、 pGMT-ADHt和 pGMT-KanR转化五.co// DH5a进行保存扩增。
本实施方式步骤一上游引物中加入Xba I的识别位点(加下划线部分)， 步骤一下游引物中加入BamH I的识别位点(加下划线部分)；步骤二上游引 物中加入Xho I的识别位点(加下划线部分)，步骤二下游引物中加入Kpn I 的识别位点(加下划线部分)；步骤三上游引物中加入Aat II的识别位点(加 下划线部分)，步骤三下游引物中加入AatII的识别位点(加下划线部分)。步 骤一至三PCR得到的扩增产物放于4。C条件下保存。本实施方式质粒pKT0150购自于Addgene公司，休哈塔假丝酵母菌基因 组DNA利用天净沙公司的真菌基因组DNA提取试剂盒得到。本实施方式中 使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓 度为产品标注浓度。
本实施方式步骤四至七各步骤得到的质粒经PCR验证后可转化入 DH5a中保存和扩增。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中 PCR反应体系为10pL，由1mL IOxPCR buffer、 0.8|iL浓度为2.5mmol/L的 dNTP、 lnL浓度为lpmol L的上游引物、lpL浓度为lpmol/^L的下游引物、 0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假丝酵母菌基因组DNA、 0.2pL 浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C 5min，变性94。C lmin，退火50°C lmin，延伸72°C 2min,共30个循环，延伸 72"C10min。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中 PCR反应体系为IO(jL，由lpL 10xPCR buffer、 0.8|iL浓度为2.5mmol/L的 dNTP、 lnL浓度为lpmol/pL的上游引物、lpL浓度为lpmol/pL的下游引物、 0.8^L浓度为25mmol/L的MgCl2、 2^iL质粒pKT0150、 0.2pL浓度为5U/mL 的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C 2min，变性 94°C 45s，退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30个循环，延伸72°C 7min。其 它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中 PCR反应体系为lOpL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8pL浓度为2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL浓度为lpmol4iL的上游引物、l^iL浓度为lpmol/pL的下游引物、 0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2pL质粒pKT0150、 0.2jxL浓度为5U/mL 的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C 2min，变性 94°C lmin，退火45。C lmin,延伸72°C 2min,共30个循环，延伸72°C 7min。 其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg2+。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤五中用 限制性内切酶XhoI和KpnI对质粒p406ADHl和pGMT-ADHt分别进行双酶 切，然后用T4DNA连接酶(T4 DNA Ligase)进行连接，得到质粒pADH。
其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式步骤五中双酶切反应体系为20pL，由5pL被酶切质粒(质粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2[iL10xbuffer 、 lpL Xho I、 ljxL Kpn I和余量的 无菌去离子水组成。
本实施方式步骤五中连接反应体系为10pL，由2nL p406ADHl双酶切产 物、2pL pGMT-ADHt双酶切产物、5(iL无菌去离子水和l|iL T4 DNA Ligase 组成；连接反应条件在16T:的条件下连接10 12h。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤六中用 限制性内切酶Aat II对质粒pGMT-KanR和pADH分别进行单酶切，然后用 T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pAK。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式步骤六中双酶切反应体系为20pL，由5pL被酶切质粒(质粒 pGMT-KanR或pADH)、 2pL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的无菌去离子水组 成。
本实施方式步骤六中连接反应体系为10pL，由2pL pGMT-KanR双酶切产 物、2pLpADH双酶切产物、5pL无菌去离子水和lpLT4DNA Ligase组成； 连接反应条件在16"C的条件下连接10 12h。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤七中用 限制性内切酶Xba I和BamH I对质粒pAK和pGMT-XKLl分别进行双酶切， 然后用T4DNA连接酶进行连接，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。其它步 骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式步骤七中双酶切反应体系为20pL，由5jiL被酶切质粒(质粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2pL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpLBamHI和余量的无菌 去离子水组成。
本实施方式步骤七中连接反应体系为10pL，由2pLpGMT-Zm双酶切产 物、2pLpAK双酶切产物、5^iL无菌去离子水和lpLT4DNALigase组成；连接反应条件在16'C的条件下连接10 12h。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中 PCR反应体系为lOpL，由lpL 10xPCR buffer、 0.8(iL浓度为2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL浓度为lpmol/nL的上游引物、1^iL浓度为lpmol/^iL的下游引物、 0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假丝酵母菌基因组DNA、 0.2pL 浓度为5U/tnL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C 5min，变性94。C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min，共30个循环，延伸 72。C10min;步骤二中PCR反应体系为10pL，由lpL 10xPCR buffer、 0.8jiL 浓度为2.5mmol/L的dNTP、 lpL浓度为lpmol/^L的上游引物、lpL浓度为 lpmol4iL的下游引物、0.8nL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2pL质粒pKT0150、 0.2^L浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变 性94。C 2min，变性94°C 45s，退火49°C 30s，延伸72°C 45s,共30个循环， 延伸72°C 7min;步骤三中PCR反应体系为10^iL，由l^iL 10xPCRbuffer、0.8pL 浓度为2.5mmol/L的dNTP、 lpL浓度为lpmol/^iL的上游引物、1jiL浓度为 lpmol/|xL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2pL质粒pKT0150、 0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变 性94。C 2min，变性94°C lmin,退火45。C lmin，延伸72°C 2min,共30个循 环，延伸72°C 7min;步骤五中用限制性内切酶Xho I禾D Kpn I对质粒 p406ADHl和pGMT-ADHt分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)进行连接，得到质粒pADH;步骤六中用限制性内切酶Aat II对质粒 pGMT-KanR和pADH分别进行单酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得 到质粒pAK;步骤七中用限制性内切酶Xba I和BamH I对质粒pAK和 pGMT-JOXl分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，即得到表达 木糖还原酶基因的质粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式中用到的10xPCR buffer中不含有Mg2+。
本实施方式步骤五中双酶切反应体系为20nL，由5pL被酶切质粒(质粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2pL10xbuffer 、 ljiLXhoI、 lpLKpnl和余量的 无菌去离子水组成。本实施方式步骤五中连接反应体系为lOpL，由2|iL p406ADHl双酶切产物、2pL pGMT-ADHt双酶切产物、5pL无菌去离子水和1uLT4DNALigase组成；连接反应条件在16。C的条件下连接10~12h。
本实施方式步骤六中双酶切反应体系为20pL，由5nL被酶切质粒(质粒 pGMT-KanR或pADH)、 2nL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的无菌去离子水组 成。本实施方式步骤六中连接反应体系为10|iL，由2pL pGMT-KanR双酶切产 物、2pLpADH双酶切产物、5pL无菌去离子水和lpLT4DNALigase组成； 连接反应条件在16"C的条件下连接10 12h。
本实施方式步骤七中双酶切反应体系为20nL，由5pL被酶切质粒(质粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2|iL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpL BamH I和余量的无菌 去离子水组成。本实施方式步骤七中连接反应体系为10pL，由2^LpGMT-JT7丄l 双酶切产物、2pLpAK双酶切产物、5jxL无菌去离子水和1^LT4DNALigase 组成；连接反应条件在16"C的条件下连接10 12h。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
受体菌活化将酿酒酵母菌株在酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养及上进行活 化，三区划线将单菌落接种于lOmLYEPD液体培养基，在3(TC、 180r/min的 条件下摇床培养10 12h。测定菌液的OD值，使其稀释至50mL时OD^达到 0.4，再继续培养2 4h。
采用醋酸锂转化法将本实施方式构建的表达木糖还原酶基因的质粒转化 入酿酒酵母，结果显示60世代(每24h为10世代)后的稳定性为99%。[质 粒稳定性计算公式稳定性(％)=(带有整合质粒的菌落数+总菌数)><100%
制备粗酶液将大肠杆菌及本实施方式构建的表达木糖还原酶基因的质粒 培养至稳定生长期(约培养llh),多次离心洗涤后用缓冲溶液重悬菌体，并 计算菌悬液的菌体浓度(cells/mL)，记为NO;再超声波间歇式处理，功率为 300W,①2变幅杆，变幅杆的末端插入液面下约15mm处，超声波处理5s、 间歇10s，超声波全程处理20min，计算菌悬液的菌体浓度(cells/mL),记为 Nl，再用公式(1-N1) / NOX100。/。计算破壁率，当破壁率<90%，继续超声 波破壁处理。再采用考马斯亮蓝G-250染色测定本实施方式构建的表达木糖还 原酶基因的质粒所制备的粗酶液中不含其它蛋白，木糖还原酶的浓度为 10nL/mL。木糖还原酶酶活测定
以lmL反应液在340nm下检测NADPH被氧化的量(即在340nm做时间扫 描)。酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH的pmol/L数即U/mg 蛋白。反应体系lOOOpL，由300|_iL浓度为5mmol/L的木糖、50pL浓度为 2.5mol/L的还原型辅酶II(NADPH)、 150pL粗酶液和500^iL浓度为0.5 mol/L、 pH值为7.4的磷酸钾缓冲液组成。
酶活测定结果显示，本实施方式构建的表达木糖还原酶基因的质粒所转化 的重组酿酒酵母的木糖还原酶酶活力大幅提高，酿酒酵母出发菌株不具备木糖 还原酶，而重组酿酒酵母的酶活力为0.2U/mg，说明本实施方式构建的表达木 糖还原酶基因的质粒可实现木糖还原酶基因的高效稳定表达。序列表
〈110>黑龙江大学
〈120> —种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法
<歸6
〈210> 1 〈211〉 27 <212>腿 <213>人工序列
〈220〉
〈223〉根据休哈塔假丝酵母菌的^IZ1基因设计的PCR扩增上游引物。 <400> 1
acttctagat acatccacaa tgagccc 27
<210> 2 〈211〉 27 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>根据休哈塔假丝酵母菌的JOTl基因设计的PCR扩增下游引物。 〈400〉 2
ttcggatcct ctacgcaaag aaagcag 27
〈210> 3 〈211> 27 〈212〉 ■ <213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pKT0150中的ADHt基因序列设计的PCR扩增上游引物。 〈400〉 3
cgcctcgagt ttgttactgc tgctggt 27
<210> 4 〈211〉 27 〈212>腿 <213>人工序列<220>
<223>根据质粒pKT0150中的ADHt基因序列设计的PCR扩增下游引物。 〈400> 4
cttggtaccc aagactgtca aggaggg 27
〈210> 5 <211〉 26 <212〉腿 〈213>人工序列
<220〉
〈223〉根据质粒pKT0150中的KanR基因设计的PCR扩增上游引物。 <400> 5
ttcgacgtct ctgtttagct tgcctc 26
<210> 6 <211〉 27 <212〉腿 〈213>人工序列
〈220〉
<223〉根据质粒pKT0150中的KanR基因设计的PCR扩增下游引物。 <400> 6
gcggacgtct atcatcgatg aattcga 2权利要求
1、一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、克隆休哈塔假丝酵母菌的XYL1基因；二、克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列；三、克隆质粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，然后在分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR；五、构建质粒pADH，以酿酒酵母整合质粒p406ADH1为骨架引入ADHt基因；六、构建质粒pAK，将KanR基因引入质粒pADH中；七、将XYL1基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’，下游引物序列为5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’。
2、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤一中PCR反应体系为10nL,由lpL10xPCRbuffer、 0.8pL浓 度为2.5mmol/L的dNTP、 lpL浓度为lpmol&L的上游引物、lpL浓度为 lpmol/|iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2|iL休哈塔假丝酵 母菌基因组DNA、 0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR 反应条件预变性94°C 5min，变性94°C lmin,退火50°C lmin，延伸72°C 2min,共30个循环，延伸72。C 10min。
3、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤二中PCR反应体系为lO)iL，由lpL 10xPCRbuffer、 0.8|iL浓 度为2.5mmol/L的dNTP、 1&浓度为lpmol/^L的上游引物、1jiL浓度为 lpmol4iL的下游引物、0.8nL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2pL质粒pKT0150、 0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变 性94°C 2min，变性94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30个循环，延伸72""C 7min。
4、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤三中PCR反应体系为lOpL,由ljxL10xPCRbuffer、 0.8pL浓 度为2.5mmol/L的dNTP、 lpL浓度为lpmol/nL的上游引物、lpL浓度为 lpmol/piL的下游引物、0.8|iL浓度为25mmol/L的MgCl2、 2pL质粒pKT0150、 0.2nL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变 性94。C 2min，变性94°C lmin，退火45°C lmin，延伸72°C 2min，共30个循 环，延伸72。C 7min。
5、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤四中的连接产物pGMT-Z7丄l 、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR转 化DH5a进行保存扩增。
6、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤五中用限制性内切酶Xho I和Kpn I对质粒p406ADHl和 pGMT-ADHt分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒 pADH。
7、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤六中用限制性内切酶Aat II对质粒pGMT-KanR和pADH分别 进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pAK。
8、 根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法， 其特征在于步骤七中用限制性内切酶Xba I和BamH I对质粒pAK和 pGMT-JOXl分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，即得到表达 木糖还原酶基因的质粒。
全文摘要
一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了酿酒酵母中缺少木糖还原酶，不具备木糖代谢能力，不能有效发酵植物纤维水解液的问题。构建方法先克隆XYL1基因、ADHt基因序列和KanR基因；再回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，分别与载体连接；然后构建质粒pADH、质粒pAK；再将XYL1基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。本发明方法将木糖还原酶基因XYL1和乙醇脱氢酶的强启动子的终止子序列构建于同一个质粒载体上，在增添了木糖代谢为乙醇的途径外，还抑制了木糖代谢为木糖醇，能够介导酿酒酵母高效代谢木糖生产乙醇。
文档编号C12N15/53GK101302533SQ200810064829
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者新 于, 凌宏志, 刚 宋, 平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 丹 赵, 高冬妮 申请人:黑龙江大学