专利名称：：一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法
技术领域：
：本发明涉及一种质粒载体的构建方法。
背景技术：
：酿酒酵母(Saccharaw^cescwevWae)不具备木糖代谢能力，因此无法发酵植物纤维水解液生产乙醇。目前采用代谢工程手段在酿酒酵母中人为建立木糖代谢途径——木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径或木糖异构酶(XI)途径。但是经代谢工程改造后的酿酒酵母的木糖利用率仍然很低，而且发酵副产物木糖醇产生量高，导致乙醇得率难以提高。
发明内容本发明的目的是为了解决目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题，而提供的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法。表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母^KW基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMTEasy载体在16。C的条件下连接10~12h，得至ljpGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHlT和pGMT-rDNA;六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADHl为骨架引入有抗性标记的基因KanR;七、构建质粒pRK，将X凡S7基因加入质粒pR;八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK;九、将2.2kbrDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5，-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3，，下游引物序列为5'-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3';步骤二中扩增上游引物序列为5'-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3，，下游引物序列为5'-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3，；步骤三中扩增上游引物序列为5，-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3'，下游引物序列为5，-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3，；步骤四中扩增上游引物序列为5，-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3，，下游引物序列为5'-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT画3'。木酮糖激斷xyliiloldnase，XK)能够催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖，是木糖代谢的限速步骤之一，处于木糖代谢物进入磷酸戊，途径(PPP)的节点位置。虽然酿酒酵母自身具有木酮糖代谢的下游酶系，但由^其活性较低限制了木糖代谢流向磷酸戊糖途径(PPP)，从而导致经代谢工程改造后的酿酒酵母的木糖利用率依然较低，发酵副产物木糖醇产生量高，乙醇得率仍较低。酿酒酵母内源性超表达木酮糖激酶基因Zi^7可以加速木糖代谢流，提高酿酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。本发明方法构建了一种携带有木酮糖激酶基因义KW的、适合于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合表达载体，该载体可以将超表达木酮糖激酶基因"S7高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，从而实现了木酮糖激酶^X^的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。将本发明方法构建的质粒转入酿酒酵母中，对比发酵试验证明转入本发明方法构建质粒的酿酒酵母的乙醇得率比经代谢工程改造后的酿酒酵母的乙醇得率高30%以上，说明本发明方法构建的质粒转入酿酒酵母后可以消除木糖转化乙醇代谢途径上的限制，提高了下游酶系的活性。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母XX^基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMTEasy载体在16'C的条件下连接1012h,得到pGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHlT和pGMT-rDNA;六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADHl为骨架引入有抗性标记的基因KanR;七、构建质粒pRK，将JOC^基因加入质粒pR;八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK;九、将2.2kbrDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5，-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC画3，，下游引物序列为5，-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3，；步骤二中扩增上游引物序列为5，-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC画3，，下游弓l物序歹'J为5，-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3，；步骤三中扩增上游弓I物序列为5，國CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3，，下游弓I物序歹U为5，-TCTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG曙3';步骤四中扩增上游弓I物序列为5，-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3，，下游引物序列为5，-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3，。本实施方式步骤五用上海华舜生物工程有限公司生产的DNA胶回收试剂盒(GelExtractionMiniKit)进行回收。步骤五中的四组连接体系均为10pL，均由lpL纯化的基因片段、lpL的pGMT-easy、l|tiL10xT4DNA连接缓冲液、lpLT4DNA连接酶和余量重蒸馏水的组成。本实施方式步骤五得到的连接产物pGMT-KanR、pGMT-XKSl、pGMT-ADHIT和pGMT-rDNA可以转化￡.eo//DH5a进行保存扩增。本实施方式步骤一上游引物中加入Ndel的识别位点(加下划线部分)，步骤一下游引物中加入AatII的识别位点(加下划线部分)；步骤二上游引物中加入SpeI的识别位点(加下划线部分)，步骤二下游引物中加入SalI的识别位点(加下划线部分)；步骤三上游引物中加入SalI的识别位点(加下划线部分)，步骤三下游引物中加入EagI的识别位点(加下划线部分)；步骤四上游引物中加入NdeI的识别位点(加下划线部分)，步骤四下游引物中加入EagI的识别位点(加下划线部分)。本实施方式步骤四克隆的2.2kb的rDNA片段用于构建质粒同源重组位点，其中含有质粒用于线性转化的HpaI单酶切位点。本实施方式质粒pKT0150购自于Addgene公司，酿酒酵母基因组DNA利用天净沙公司的真菌基因组DNA提取试剂盒得到。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式步骤五至九参见试剂盒使用操作手册。本实施方式步骤五至九各步骤得到的质粒经PCR验证后可转化入五.coh-DH5a中保存和扩增。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤六中的抗性标记为G418(遗传霉素)。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中PCR反应体系为10^iL,由l|iL10xPCRbuffer、0.8piL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lixL浓度为lpmol/nL的上游引物、lpL浓度为lpmol/^iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL质粒pKT0150、0.2^iL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C2min，变性94°Clmin,退火45。Clmin，延伸72°C2min,共30个循环，延伸72。C7min。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中PCR反应体系为10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、lpL浓度为lpmol/^iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2^L酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C5min，变性94。Clmin，退火55°Clmin，延伸72°C2min，共30个循环，延伸72。C10min。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg2+。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中PCR反应体系为10pL，由l^iL10xPCRbuffer、0.8|iL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^iL浓度为lpmol/nL的上游引物、l^iL浓度为lpmol/^iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C2min，变性94°Clmin，退火50°Clmin，延伸72°C2min，共30个循环，延伸72。C7min。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中PCR反应体系为10^L，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/^L的上游引物、1&浓度为lpmol/^L的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2^iL酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C2min，变性94。Clmin,退火53。Clmin,延伸72。C2.5min，共30个循环，延伸72°C7min。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤六中用限制性内切酶NdeI和AatlI对p406ADHl和pGMT-KanR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pR。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式步骤六参见试剂盒使用操作手册进行操作。.具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤七中用限制性内切酶SpeI和SalI对质粒pR和pGMT-XKSl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRK。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式步骤七参见试剂盒使用操作手册进行操作。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤八中用限制性内切酶SalI和EagI对质粒pRK和pGMT-ADHIT分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRKT。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式步骤八参见试剂盒使用操作手册进行操作。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤九中用限制性内切酶NdeI、EagI对质粒pRKT和pGMT-rDNA分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式步骤九参见试剂盒使用操作手册进行操作。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤五中抗性标记为G418;步骤一中PCR反应体系为lOpL，由1^L10xPCRbuffer、0.8nL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、l^L浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2^L质粒pKT0150、0.2^iL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C2min，变性94°Clmin,退火45°Clmin,延伸72°C2min,共30个循环，延伸72t:7min;步骤二中PCR反应体系为10^L,由l^iL10xPCRbuffer、0.8|jL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l|iL浓度为lpmol/|iL的上游引物、lpL浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8mL浓度为25mmol/l的MgCl2、2jaL酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C5min,变性94°Clmin,退火55°Clmin，延伸72°C2min,共30个循环，延伸72。C10min;步骤三中PCR反应体系为10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/j^L的上游引物、lpL浓度为lpmol/|iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、21iL质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94i:2min，变性94。Clmin，退火50°Clmin,延伸72°C2min，共30个循环，延伸72°C7min;步骤四中PCR反应体系为10pL，由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/pL的上游引物、l^L浓度为lpmol/nL的下游引物、0.8^L浓度为25mmol/L的MgCl2、2^L酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94。C2min,变性94°Clmin,退火53。Clmin，延伸72。C2.5min，共30个循环，延伸72。C7min;步骤六中用限制性内切酶NdeI和AatII对p406ADHl和pGMT-KanR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pR;步骤七中用限制性内切酶SpeI和SalI对质粒pR和pGMT-XKSl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRK;步骤八中用限制性内切酶Sall和EagI对质粒pRK和pGMT-ADHlT分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRKT;步骤九中用限制性内切酶NdeI、EagI对质粒pRKT和pGMT-rDNA分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。将酿酒酵母菌划线接种于不同G418浓度的YPD平板上，在30。C条件下培养72h，筛选出高拷贝的转化子。然后将活化的酿酒酵母W5挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，在30°C、200r/min条件下培养48h，再取lOOmL培养菌液在3500r/min条件下离心5min，弃去上清液后加入40mLlxTE清洗菌体，然后再在3500r/min条件下离心5min，弃上清液并加入2mLlxLiAc/0.5xTE,室温放置10min，制成酵母菌感受态细胞。将已用Hpal线性化的本实施方式构建的表达木酮糖激酶基因的质粒、10.7nL鱼鲑精DNA、100pL酵母菌HDY-01感受态细胞和700pLlxLiAc/40PEG-4000/lxTE混合，在3(TC条件下反应30min，之后加入88pLDMSO原液均匀混合，置于40'C水浴中热激7min，然后13000r/min离心10s，弃上清液再加入lmLlxTE清洗2次，13000r/min离心10s，弃上清液后再加入50100pLlxTE，涂布于含G418的YPD平板培养基上，在3(TC条件下培养48h，得到高拷贝转化子W-XK。将高拷贝转化子W-XK接种40mL梯度稀释的YEPD液体培养基(非选择性压力下)中摇瓶培养60世代(每24h为10世代)，每隔10世代，平板计数菌落数进行稳定性测定按公式计算，结果显示60世代后的稳定性为99%,表明在非选择性压力下，整合于酿酒酵母染色体上的外源基因片段具有良好的遗传稳定性，能适合用于工业生产的粗放环境。[质粒稳定性计算公式稳定性(％)=(带有整合质粒的菌落数—总菌数)x100%]将转化子W-XK在选择压力培养基(含G418的YEPD培养基)中培养至对数生长期，离心收集菌体并用100mmol/L磷酸缓冲液洗涤2次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(100mmol/L磷酸缓冲液，0.5mmol/LEDTA，0.5mmo1/LDTT，lmmol/LPMSF，pH7.0)中，菌悬液加入玻璃珠(直径为0.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理3050s，在冰浴5min，破碎重复35次，再在10000g条件下离心10min，收集上清，即为粗酶液用于酶活性测定分析。(酶粗液蛋白质含量的测定按照蛋白质含量测定试剂盒操作说明进行。)本实施方式采用连续监测法测定木酮糖激酶酶活，选择线性反应期来计算酶活力，测定原理如下d-木釅糖+atp木鹏糠激,(xk)>d_木酮糖5磷酸+ADp磷酸烯醇式两,酸+adp糊酸激,(PK)>丙,酸+atpnadh+h+(LDH)>乳酸+nad+以上偶联反应达到平衡后，木酮糖激酶(XK)转化底物D-木酮糖的速度与反应体系中NADH的减少速度相等，通过测定NADH的减少速度可计算木酮糖激酶(XK),的活性。木酮糖激酶酶活单位定义在给定实验条件下，每分钟催化转化lMmolNADH的酶量为一个酶活单位(即IU)。-!~X纖,/，)=#fi—22x10-^x10■公式中，S.22xl03:NADH的摩尔消光系数(l-mor1'^);^A140:/厕刻待漏榉品在34Qnm被长tt光吸收；/厕劇待灑样品在34Qnm波长的光吸收；fith1mm賴S飾粆数《s》；々、&R潘漏定过濯中所取的时f0l点tt鼸液的蛋白浓度(mgfe￡>，0.1;反您体系中加入的糧酶液fltf钵积(mL);ICh耱酶灌稀释的修数。按表1中数据配制粗酶液中木酮糖激酶酶活测定反应体系，体积为0.9mL。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>木酮糖激酶酶活测定反应体系在室温条件下平衡15min，加入稀释10倍的粗酶液O.lmL，漩涡振荡器振荡混匀，以蒸馏水为空白对照，测量OD^，并使用自动记录式分光光度计记录样品OD34。随时间的变化。选取线性反应期，计算粗酶液中木酮糖激酶活性。酶活测定结果显示，本实施方式方法构建的表达木酮糖激酶基因的质粒所转化的酿酒酵母重组菌W-XK的木酮糖激酶活力较出发菌株W5大幅提高，出发菌株W5的酶活力为0.31U/mg，重组菌株W-XK的酶活力为2.8U/mg，酶活力提高了9倍，表明本实施方式方法构建的质粒载体转化酿酒酵母后实现了木酮糖激酶基因的高效稳定表达。序列表<110>黑龙江大学〈120>—种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法〈歸8<210>1〈211>26<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223>根据质粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因在质粒中的相对位置设计的PCR扩增上游引物。<400>1ttccatatgtctgtttagcttgcctc26<210>2〈211>27<212>DNA<213>人工序列<220>〈223>根据质粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因在质粒中的相对位置设计的PCR扩增下游引物。〈400>2cttgacgtctatcatcgatgaattcga27〈210>3〈211>29<212>腿〈213>人工序列〈220〉<223>根据酿酒酵母Zfi:W的基因序列设计的PCR扩增上游引物。〈400>3cggetctaigtctcaatcttcagcaagcgac29<210>4〈211>28〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉根据酿酒酵母义/^/的基因序列设计的PCR扩增下游引物。<400>4cgcgtcgacaacggggaacaa3atgatg28<210〉5<211>31<212〉腿〈213>人工序列〈220>〈223>根据质粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1终止子片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增上游引物。<柳>5cgcgtcgacatttgttactgctgctggtatt31〈210>6〈211>26〈212〉<213〉人工序列<220〉〈223>根据质粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1终止子片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增下游引物。<400>6ctcggccgccctgttatccctagcgg26〈210〉7<211>29〈212>DNA<213>人工序列<220><223>根据酿酒酵母rDNA的基因序列设计的扩增2.2kb的rDNA片段的上游引物。<400〉7ttccatatgggaacctctaatcattcgct29<210>8〈211>29〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉根据酿酒酵母rDNA的基因序列设计的扩增2.2kb的rDNA片段的下游引物。〈400〉8tctcggccgaacgaacgagaccttaacct29权利要求1、一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母XKS1基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kbrDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMTEasy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入有抗性标记的基因KanR；七、构建质粒pRK，将XKS1基因加入质粒pR；八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK；九、将2.2kbrDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列为5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列为5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步骤四中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。2、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤六中的抗性标记为G418。3、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤一中PCR反应体系为10nL，由l|iL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/(iL的上游引物、1^iL浓度为lpmol4iL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94。C2min，变性94°Clmin,退火45。Clmin,延伸72°C2min,共30个循环，延伸72。C7min。4、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系为lOpL，由l!xL10xPCRbuffer、0.8^iL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l|iL浓度为lpmol/pL的上游引物、l|xL浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C5min，变性94°Clmin，退火55°Clmin，延伸72°C2min,共30个循环，延伸72"C10min。5、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤三中pcr反应体系为IOmL，由lpL10xPCRbuffer、0.8^l浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、lpL浓度为lpmol/jxL的下游引物、0.8jiL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94°C2min,变性94°Clmin，退火50°Clmin,延伸72°C2min，共30个循环，延伸72。C7min。6、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤四中PCR反应体系为10pL，由lnL10xPCRbuffer、0.8^L浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、l^iL浓度为lpmol/jiL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL酿酒酵母基因组DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水的组成；PCR反应条件预变性94。C2min，变性94。Clmin,退火53。Clmin,延伸72°C2.5min,共30个循环，延伸72"C7min。7、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤六中用限制性内切酶Ndel和AatII对p406ADHl和pGMT-KanR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pR。8、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤七中用限制性内切酶SpeI和SalI对质粒pR和pGMT-XKSl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRK。9、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤八中用限制性内切酶SalI和Eagl对质粒pRK和pGMT-ADHlT分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRKT。10、根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤九中用限制性内切酶NdeI、Eagl对质粒pRKT和pGMT-rDNA分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒。全文摘要一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题。构建方法先克隆KanR基因、XKS1基因、ADH1终止子片段、酿酒酵母中2.2kbrDNA片段；然后回收、纯化基因片段与pGEMTEasy载体连接；再依次构建质粒pR、质粒pRK和质粒pRKT；最后将2.2kbrDNA片段加入质粒pRKT。本发明方法所构建的载体可以将XKS1基因高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，实现XKS1的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。文档编号C12N15/66GK101302535SQ20081006483公开日2008年11月12日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者凌宏志,刚宋,平文祥,曹喜生,杜春梅,葛菁萍,丹赵,高冬妮申请人:黑龙江大学