专利名称：热带假丝酵母zd-3菌株及其用途及用以生产生物蛋白饲料的方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体地说是一种热带假丝酵母ZD-3菌株(Cfl"&^ /ra内c^to ZD-3)及其用途及将该菌株用以生产生物蛋白饲料的方法。
技术背景棉籽饼粕是棉花加工业的主要副产品，我国年产量高达400多万吨。它富含蛋白 质(30% 45%)，是重要的蛋白词料资源。在国内外，棉籽饼粕可较多量地替代豆粕 安全地应用于反刍动物，尤其是在奶牛饲养中已大量地推广应用，但是对单胃动物而 言，饲喂棉籽饼粕时，由于含有有毒物质棉酚(450 1500 mg^g)，会对动物生长、 发育和繁殖等方面产生明显的不良影响，因而限制了其安全而有效的用作畜禽蛋白饲 料，部分地区甚至将其贬作肥料，造成饲料资源的严重浪费。针对这一难题，我国科 研人员(吴小月等，1989;钟英长等，1989)首先提出了用微生物发酵脱毒的途径， 就是将特定微生物接种到棉籽饼粕培养基中，在一定的条件下利用微生物在饲料原料 中的生长繁殖和新陈代谢，棉酚被分解利用或与蛋白质氨基酸结合形成结合棉酚，从 而达到脱毒的目的。棉酚的分子式为C3。H3Q08，化学结构是8, 8'-二醛基-1, I', 6, 6', 7, 7'-六羟基-5,5'-二异丙基-3,3'-二甲基-2，2'-联萘。它的分子量为518.54。棉株体内棉酚的存在形式有 两种，即结合棉酚(bound gossypol)和游离棉酚(free gossypol)。通常认为在棉花组 织中呈游离状态存在的棉酚称为游离棉酚，而与其他物质(蛋白质、氨基酸和磷脂) 结合的棉酚称为结合棉酚。 一般认为，只有游离棉酚对人畜具有毒性。猪、鸡、兔等 长期摄食含高剂量游离棉酚的棉籽饼会损害动物繁殖机能，导致呼吸吃力、困难，生 长速度降低以及厌食等症状。棉酚可引起鸡蛋蛋黄变色，由淡黄色变为棕黄色。动物 中毒症状表现为食欲减退或厌食、日渐消瘦、四肢无力、抽搐、腹泻、粪便颜色变淡 等症状。发明内容本发明的目的是提供一种热带假丝酵母ZD-3菌株(C"w^V/a /ra内cafc ZD-3)及其 用途，同时还提供一种将上述菌株用以生产生物蛋白饲料的方法。本发明的热带假丝酵母ZD-3菌株(Owdito fra;^flfc ZD-3)于2008年3月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，登记入册编号为CCTCCNoM208024。本发明的热带假丝酵母ZD-3菌株(OwtMfl加; /cafcZD-3)细胞呈卵圆形，大小为 3 4x4 5pm，出芽繁殖。用麦芽汁液体培养该菌，菌体沉淀于管底。在麦芽汁琼脂 斜面或平皿上培养24 48h，菌落呈奶油色，无光泽或稍有光泽，软而平滑，有皱纹。 培养时间久的菌落较硬。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，可见大量假菌丝，包 括伸长的分枝假菌丝，上面带有芽分生孢子。上述的热带假丝酵母ZD-3菌株(Cfl"&^ /ra/ /cafc ZD-3)CCTCC No M208024可在 棉籽饼粕及类似物上生长，变性底物中游离棉酚含量极低，同时底物中产生大量代谢 产物蛋白酶。因此，它可用于棉籽饼粕及类似物的发酵脱毒，进而生产优质生物蛋白 词料。上述的热带假丝酵母ZD-3菌株(Om^/fl /ra/ /cafc ZD-3)CCTCC Nq M208024用以 生产生物蛋白饲料的方法如下用热带假丝酵母ZD-3菌株(Om^fe /ro^cflto ZD-3)CCTCC NQ M208024对棉籽饼粕发酵脱毒，在温度为25 35'C环境下发酵30 60 h。用上述的热带假丝酵母ZD-3菌株(C朋AWa加pz'cfl/纽ZD-3)CCTCC Nq M208024生 产生物蛋白饲料过程中，最好在棉籽饼粕中加入10~30%的豆粕、玉米粉、小麦麸中 的至少一种作为发酵底料。上述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(OwWWfl /ra; z'cflfc ZD-3)CCTCC No M208024生 产生物蛋白饲料方法中，其优选的菌种制作过程如下(1) .一级种子(试管斜面种子)从原始菌种接种至试管麦芽汁固体培养基，28 32'C培养16 36小时；(2) .二级种子(试管液体种子)从一级种子接种至试管麦芽汁液体培养基，28 32。C培养16 36小时；(3) .三级种子(三角瓶液体种子)从二级种子接种至含50 150ml麦芽汁(5 10。Bx)培养基的三角瓶中，28 32。C培养16 36小时；上述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(Cam/Wa fropz'cato ZD-3)CCTCC No M208024生 产生物蛋白词料方法中，其底料的配制如下(l).棉籽饼粕发酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麦麸之一种或几种按任意比例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115'C温度下蒸汽灭菌15 25min，冷却至25 35'C;(2) .发酵棉籽饼粕发酵底料按1 10%的比例接入三级种子，底料含水量控制在45 55%，发酵室内相对湿度保持在85%以上，温度维持在25 35。C，通风发酵30 60小时；(3) .培养物在35 45t:干燥，粉碎，混合后包装。本发明的优点如下培养方便，生长速度快，游离棉酚脱毒效率高；发酵后变性 底物中酵母菌含量高；代谢产物蛋白酶活性高；该菌不产生有害物质，以它发酵所产 生的变性底物是新型微生态生物蛋白饲料，可显著提高动物抗病性和饲料利用效率。本发明的热带假丝酵母ZD-3菌株(Ow力WaZD-3)已于2008年3月1日 保藏在中国典型培养物保藏中心，登记入册编号为CCTCCNoM208024。
具体实施方式
菌种筛选、驯化和诱变根据相关文献，在实验室收集有消除棉籽饼粕中游离棉酚潜力的菌株28株，点 种到醋酸棉酚无糖査氏培养基上，其中8株能够良好生长，然后逐步增加无糖査氏培 养基醋酸棉酚的浓度，最高浓度时有3株菌生长较好。随后将其点种到醋酸棉酚麦芽 汁培养基上逐级平板驯化选育，其中有一株生长最快，菌落最大，编号为ZD-3。将 ZD-3菌株接种到棉粕培养基上进行固体发酵，发酵结束后测定变性底物中游离棉酚 含量，该菌株比出发菌株脱毒率提高8个百分点，脱毒率高达卯％以上，游离棉酚不 超过0.1g/kg，极显著低于国家标准(不超过1.2g/kg)。将该ZD-3菌株培养并制成菌悬液，分别进行紫外(15W紫外灯下30cm处照射 60秒)、辐射(0)6()辐照10s)和化学试剂(亚硝基胍终浓度lmg/ml， 28。C静置60 分钟)诱变，经诱变后将菌悬液涂布于初筛平皿，挑取形成较大菌落的菌株，复壮后 将其接种到棉粕培养基上进行固体发酵，发酵结束后测定变性底物中游离棉酚含量， 发现脱毒率并未显著改善，且略有降低，因此确定诱变出发菌ZD-3为目标菌株。菌种鉴定(1)形态特征ZD-3菌株细胞呈卵圆形，大小为3 4x4 5 pm，出芽繁殖。用 麦芽汁液体培养该菌，菌体沉淀于管底。在麦芽汁琼脂斜面或平皿上培养24 48h， 菌落呈奶油色，无光泽或稍有光泽，软而平滑，有皱纹。培养时间久的菌落较硬。在 加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，可见大量假菌丝，包括伸长的分枝假菌丝，上面 带有芽分生孢子。根据《An Introduction industrial mycology》(George Smith 1954)、 《真菌鉴定手册》(魏景超1982)、《常见与常用真菌》(中科院微生物研究所1973)、张纪忠(19卯)主编的《微生物分类学》、J. A.巴尼特等(1991)的《酵母菌的特征 与鉴定手册》以及该菌的生理生化实验结果，鉴定该菌株为热带假丝酵母(OmA必 fro/ fcafe )， 定名为CawWcto /rap/cafc ZD國3 。(2)培养特征该菌株固体发酵棉籽饼粕的最适温度为25 35°C;发酵时间30 60 h;底物水分含量45 55%;自然pH值；棉籽饼粕中可加入适量的豆粕或玉米粉和小麦麸，配制发酵底料。 固体发酵生产工艺-(1) . 一级种子(试管斜面种子)从原始菌种接种至试管麦芽汁固体培养基，28 32'C培养16 36小时；(2) .二级种子(试管液体种子)从一级种子接种至试管麦芽汁液体培养基，28 32。C培养16 36小时；(3) .三级种子(三角瓶液体种子)从二级种子接种至含50 150ml麦芽汁(5 10。Bx)培养基的三角瓶中，28 32。C培养16 36小时；(4) .棉籽饼粕发酵底料的配制棉籽饼粕原料经粉碎过筛后加入适量的豆粕或玉 米粉和小麦麸，再按固液比l : 0.6 0.8的比例加入水，0.056 MPa, 112.6。C蒸汽灭菌 20min，冷却；(5) .发酵棉籽饼粕发酵底料按1 10%的比例接入三级种子，底料含水量控制在 45 55%，发酵室内相对湿度保持在85%以上，温度维持在25 35r，通风发酵30 60小时；(6) .培养物在35 45"C干燥，粉碎，混合后包装。 实施例l:棉籽饼粕底料固体发酵(1) . 一级种子(试管斜面种子)从原始菌种接种至试管麦芽汁固体培养基，30°C 培养24小时；(2) .二级种子(试管液体种子)从一级种子接种至试管麦芽汁液体培养基，30°C 培养20-24小时；(3) .三级种子(三角瓶液体种子)从二级种子接种至含5 。Bx麦芽汁培养基的三 角瓶中，3(TC培养20~24小时；(4) .棉籽饼粕发酵底料的配制棉籽饼粕原料经粉碎过筛后加入20。/。的豆粕，再 按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.056MPa， U2.6X:蒸汽灭菌20min，冷却至室温；(5) .发酵棉籽饼粕发酵底料按5%的比例接入三级种子，底料含水量控制在50%， 发酵室内相对湿度保持在85%以上，温度维持在3(TC，通风发酵48小时；(6) .培养物在45t;干燥，粉碎，过孔径0.6mm筛，混合后包装。(7) .游离棉酚测定小于0.1g/kg。(8) .酵母菌记数大于2.8X 1013cell/g。(9) .蛋白酶活性测定中性大于130u/g;碱性大于50u/g;酸性大于25 u/g 游离棉酚测定按国标GB13086-91"饲料中游离棉酚的测定方法"测定。 酵母菌记数采用平板计数法，中华人民共和国国家标准GB4789.15-84，食品卫生微生物检验——霉菌和酵母计数。蛋白酶活性测定方法为福林法，中华人民共和国专业标准ZBX66030-87。蛋 白酶活力测定包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的测定。在4(TC下每分钟水 解酪蛋白产生l吗酪氨酸，定义为l个蛋白酶活力单位。实施例2:与实施例l的不同之处在于发酵底料的配制，其它步骤相同。 棉籽饼粕发酵底料的配制棉籽饼粕原料经粉碎过孔径0.5mm筛后加入20%的豆粕、5%的玉米、5%的小麦麸，再按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.05MPa, 112.6°C蒸汽灭菌20min，冷却至室温。 实施例3:与实施例l、 2的不同之处在于发酵底料的配制，其它步骤相同。 棉籽饼粕发酵底料的配制棉籽饼粕原料经粉碎过孔径0.4mm筛后加入10%的豆粕、10%的玉米、10%的小麦麸，再按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.045MPa， 112.6°C蒸汽灭菌20min，冷却至室温。 实施例4:与实施例l不同之处在于在底物接种专利菌种热带假丝酵母ZD-3的同时，再接种普通酿酒酵母，进行二元复合发酵。普通酿酒酵母一、二、三级种子的制作方法及接种量与热带假丝酵母ZD-3相同，其它操作步骤与实施例1相同。
权利要求
1.一种热带假丝酵母ZD-3菌株(Candida tropicalis ZD-3)，其特征为CCTCC N0M208024。
2、 —种热带假丝酵母ZD-3菌株(Cfl"&Wa加p/cfl/" ZD-3)CCTCC No M208024的 用途，其特征在于用于棉籽饼粕发酵脱毒，消除游离棉酚，生产生物蛋白饲料。
3、 —种用热带假丝酵母ZD-3菌株(Ow^ifl加;w'c"fe ZD-3)CCTCC NQ M208024 生产生物蛋白饲料的方法，其特征在于用热带假丝酵母ZD-3菌株(C"m//^加内cafo ZD-3)CCTCC Nq M208024对棉籽饼粕发酵脱毒，在温度为25 35。C环境下发酵30 60 h。
4、 根据权利要求3所述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(Cfl"AW" /ra/^ato ZD-3)CCTCC NQ M208024生产生物蛋白饲料方法，其特征在于棉籽饼粕中加入 /<^^%的豆粕、玉米粉、小麦麸中的至少一种或几种作为发酵底料。
5、 根据权利要求3或4所述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(O mfefe /rap/cato ZD-3)CCTCCNoM208024生产生物蛋白饲料方法，其特征在于菌种的制作如下(1) .一级种子(试管斜面种子)从原始菌种接种至试管麦芽汁固体培养基，28 32。C培养16 36小时；(2) .二级种子(试管液体种子)从一级种子接种至试管麦芽汁液体培养基，28 32T:培养16 36小时；(3) .三级种子(三角瓶液体种子)从二级种子接种至含50 150ml麦芽汁(5 10。Bx)培养基的三角瓶中，28 32。C培养16 36小时；
6、 根据权利要求3或4所述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(OmAVfe /ra内cflto ZD-3)CCTCC No M208024生产生物蛋白饲料方法，其特征在于底料的配制如下(1) .棉籽饼粕发酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麦麸之一种可几种按任意比 例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115i:温度下蒸汽灭菌15 25min，冷却至25 35。C;(2) .发酵棉籽饼粕发酵底料按1 10%的比例接入三级种子，底料含水量控制在 45 55%，发酵室内相对湿度保持在85%以上，温度维持在25 35。C,通风发酵30 60小时；(3) .培养物在35 45'C干燥，粉碎，混合后包装。
7、 根据权利要求5所述的用热带假丝酵母ZD-3菌株(CflmMa /rap/cafcZD-3)CCTCCNoM208024生产生物蛋白饲料方法，其特征在于底料的配制如下(1) .棉籽饼粕发酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麦麸之一种或几种按任意比 例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115。C温度下蒸汽灭菌15 25min，冷却至2545。C;(2) .发酵棉籽饼粕发酵底料按1 10%的比例接入三级种子，底料含水量控制在 45 55%，发酵室内相对湿度保持在85%以上，温度维持在25 35。C，通风发酵30 60小时；(3) .培养物在35 45"C干燥，粉碎，混合后包装。
全文摘要
本发明公开了一种热带假丝酵母ZD-3菌株(Candida tropicalis ZD-3)及其用途及用以生产生物蛋白饲料的方法，本发明的热带假丝酵母ZD-3菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，登记入册编号为CCTCC N<sub>0</sub> M208024，可用于棉籽饼粕及类似物的发酵脱毒，进而生产优质生物蛋白饲料。本发明的优点如下培养方便，生长速度快，游离棉酚脱毒效率高；发酵后变性底物中酵母菌含量高；代谢产物蛋白酶活性高；该菌不产生有害物质，以它发酵所产生的变性底物是新型微生态生物蛋白饲料，可显著提高动物抗病性和饲料利用效率。
文档编号C12N1/14GK101270336SQ20081007287
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者余东游, 张文举, 潘晓亮, 许梓荣 申请人:石河子大学