专利名称：德国肉用美利奴羊肌肉生长抑制素基因snp位点的制作方法
技术领域：
本发明是涉及德国肉用美利奴肌肉抑制素myostatin基因外显子1单核苷酸多态性，本发 明还涉及肌肉抑制素myostatin基因外显子1等位基因突变的方法。
背景技术：
肌肉的生长发育受到众多生长发育因子的调控，肌肉抑制素基因是目前发现的功能较为明 确的负调控基因，主要在骨骼肌中表达。对小鼠、比利时蓝牛、皮艾蒙特牛、德克塞尔羊、 小灵狗等的研究证实，由于缺失该基因或该基因编码区发生突变，导致该基因活性丧失或被 抑制，造成肌肉过度生长，因而确定其具有特异的抑制骨骼肌生长的功能。筛选myostatin基 因突变等位基因或用分子生物学方法干扰、阻断myostatin基因的负调控作用，对于肉用动物 品种的选育和提高产肉性能方面具有重要意义。在本申请之前，没有发现关于德国肉用美利 奴myostatin基因外显子1多态性的相关报道。
德国肉用美利奴myostatin基因外显子1上发现的单核苷酸突变为同义突变。由于密码的 简并性，不改变编码的氨基酸，但由于改变了核苷酸序列，有可能影响转录后加工mRNA接 切信号顺序。由于存在同义突变，在mRNA到蛋白质的翻译过程中，携带氨基酸残基结合到 核糖体上的tRNA就不相同，从而tRNA丰度也不同，如果同义突变后对应的tRNA在细胞 内丰度小，那么将会导致蛋白质的合成效率下降，最终影响基因的表达量。
方法内容
本发明的目的是提示在德国肉用美利奴myostatin基因外显子1上发现一个单核苷酸突变 位点，而该位点仅在该肉用绵羊品种中存在，并提供该等位基因突变的检测方法。
检测内容及方法1确定德国肉用美利奴myostatin基因外显子1单核苷酸突变位点位 于SEQID: DQ530260所示序列从起始密码子ATG开始第+84位的位置，由GG等位基因突变 为GA等位基因。2检测该突变等位基因的特异性核酸引物，來源于SEQID: DQ530260，长 度为33bp和25bp,能够特异性的结合到突变等位基因模板链上，可以扩增到含有等位基因 突变的目的基因。3通过设计的核苷酸引物以及建立的检测体系，较为准确、快捷的扩增群 体中等位基因，通过SSCP分析，可以准确的分析得到绵羊myostatin基因外显子1单核苷酸 突变位点存在与否。
具体实施方式
1体外扩增
(1) 采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA。
(2) 使用特异结合的核,苷酸引物对基因组DNA模板进行体外扩增
(3) PCR扩增反应体系10xPCRbuffer(Mg2+free)2pL, 25mM MgCl 1.3uL, 10mmol/L dNTP混合物1 ^L， 10pmol/L引物(上游)0.5pL, 10nmol/L引物(下游)0.5pL, Taq酶 1.25U, 100ng/fiLDNA模板1 ddH20补足20pL。
(4) PCR反应程序95 'C 5min 1个循环94'C 45s， 58。C退火35 s, 72 'C 40 s共35 个循环；72 'C 5 min 1个循环。
2 SSCP分析
(1) PCR产物经琼脂糖凝胶检测后，如果片段长度为393bp,那么将PCR产物甲酰 胺变性缓冲液按h l体积比98'C变性10mim然后立即置于冰中冷却，5min后上样进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
(2) 电泳使用凝胶配置7.7%非变性PAGE凝胶
29n/。丙烯酰胺-l。/。N，N-双丙烯酰胺 7.7mL
5xTBE 3mL
10%过硫酸铵(AP) 0.2lmL
TEMED (四甲基乙二胺) 2(HU
去离子水 14.77mL
总体积 30mL
(3) 电泳前先在4'C环境、300V电压下凝胶预电泳30min，然后将变性后产物加入加样 孔，在4'C环境、180V电压条件下电泳19hr。
(4) 电泳结束取下凝胶，使用快速染色显影方法先用蒸馏水清洗凝胶，然后转入染色 盒中，加入染色液，摇床上染色10分min;用蒸馏水清洗凝胶，转入显影盒，先加入少量显 影液冲洗并把液体倒掉，然后加入适量显影液显影3min，待条带清晰用蒸馏水清洗，凝胶成 像系统照相。
(5) 染色液0.1%硝酸银溶液，称取0.5克硝酸银溶于500ml去离子水，置于棕色瓶 中，室温保存。显影液NaOH片10克，NaCO30.2克，甲醛2ml,加去离子水定容至500ml，现配现用。
3测序分析
这一过程是为了检测获得的结果的可靠性，在实际操作中凭带型即可区分，无需此过程。
在非变性聚丙烯酰胺凝胶中带型显示为三条的判断为杂合型等位基因，将两条的判断为 纯合型等位基因，选择这两类样本的PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，经连接到T载体、转化 大肠杆菌DH5a 、选择性培养基筛选、挑选阳性克隆检测，然后扩菌送到测序公司进行测序。 结果显示判断正确无误带型三条的为杂合型等位基因，两条的为纯合型等位基因。本专利所设计的核苷酸引物序列如下.-
S- 5， gzit tgt att gat ttt aaet acc atg caa aaa ctg3 AS- 5， etc cgt ggg cat ggt aat gac cgt t3，。
权利要求
1、德国肉用美利奴羊myostatin基因外显子1单核苷酸突变位点。该位点位于Genebank序列(SEQ IDDQ530260，Access number)从起始密码子ATG开始+84位的G→A突变。
2、 该位点的SSCP检测技术。包括样品变性条件和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 条件。
3、用于SSCP分析的引物设计。 引物序列为上游5 ， gat tgt att gat ttt a犯acc atg caa aaa ctg 3 ，-下游5 ， etc cgt ggg cat ggt aat gac cgt t3 ，c
全文摘要
本发明公布了德国肉用美利奴羊肌肉生长抑制素基因SNP位点。发明涉及德国肉用美利奴羊myostatin基因外显子1单核苷酸突变的检测方法。目前在多个物种上发现myostatin基因编码区的单核苷酸位点突变对肌肉生长产生明显效应，而德国肉用美利奴羊编码区未发现突变。本发明建立了稳定的体系检测到肌肉抑制素基因外显子1的SNP位点，本发明特征在于引物序列特异性好，建立稳定的PCR-SSCP检测体系，优化扩增反应、丙烯酰胺与N，N-双丙烯酰胺比例、凝胶浓度、电泳条件等。该方法能够对不同品种绵羊myostatin基因外显子1第84等位基因突变进行分析，对于判断绵羊myostatin基因型以及分析其功能具有意义。
文档编号C12Q1/68GK101591696SQ20081007288
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者刘明军, 森 唐, 张惠玲 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心