专利名称：两种抑制“肌肉生长抑制素基因”表达的合成小干扰rna分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够对肌肉抑制素基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的 设计、合成和抑制作用在肌肉细胞上的评价方法。
背景技术：
肌肉的生长性状(包括产量和质量)决定着肉用家畜的生产性能。产肉性 能的好坏，除与家畜的营养和饲养管理因素有关外，主要决定于遗传因素，即主 要受与肌肉生长发育相关基因的调控。肌肉抑制素基因(myostatin，简称MSTN) 是一种抑制肌肉细胞增殖生长的负调控基因，该基因表达的抑制或突变失活， 能阻断MSTN对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低体 表脂肪的沉积，产生以肌纤维数量显著增加为特征的肌肥大现象，即所谓的"双 肌性状"。根据国内外研究报道，目前在牛、羊、猪、人和鼠上都发现了与双 肌性状相关的突变基因型。除突变基因型外，通过生物技术手段阻断MSTN基因 表达和功能，同样能够复制出类似MSTN突变产生的双肌性状。根据MSTN基因结 构和作用机制，通过生物技术手段阻断MSTN对肌肉生长的抑制作用来促进肌肉 生长发育的研究已经成为MSTN研究的热点。siRNA干扰技术是最近两年来发展起 来的阻断基因转录表达的新技术，其阻断基因转录的功能已在各种不同基因上 得到了充分的证明，并被广泛应用。针对MSTN的基因结构，设计合成能够有效 抑制MSTN基因表达的干扰RNA分子，对深入研究家畜肌肉生长发育的分子调控机制和研制促进家畜肌肉生长的生物制剂具有重要意义和广阔的应用前景。
发明内容
根据GeneBank中MSTN从启始密码(ATG)至终止密码(TGA)共1128bp 编码区序列，用siRNA设计软件设计干扰MSTN基因转录的siRNA分子群，从设 计的87条siRNA分子中，根据结构和位置选出8条针对不同位点的siRNA序列 进行合成。将合成的两条单链互补的siRNA分子经退火形成双链后，分别连接 到pSilence4. 1 siRNA专一性表达载体上，构建了 8个干扰RNA质粒(pSi-MSTN)。 干扰RNA质粒用脂质体转染法转染C2d2小鼠成肌细胞，建立了最佳外源基因转 染条件。48小时后收集细胞，提取细胞总RNA，通过实时定量荧光PCR检测肌 肉细胞MSTNmRNA表达水平，分析了 siRNA对MSTN的干扰抑制作用。通过分析 比较实验组和对照组细胞MSTN表达水平与肌细胞生长的相关性，评价了 siRNA 对MSTN基因表达的阻断作用和促进肌肉细胞增殖生长的作用。最终获得 PSi-717和pSi-986两种能够有效抑制MSTN基因表达的siRNA分子。
具体实施例方式
1、 siRNA表达载体构建
各取10ul lOuM的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链)，加入8iU 10X annealing buffer和12ul灭菌超纯水，煮沸10分钟后自然冷却至室温。同 时pSilencer4. l质粒载体经Bam HI和Hind III双酶切后回收线性化质粒，与 退火产物4'C过夜连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素 (lOOug/ul)筛选。用载体检测引物及siRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送 上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染。
2、 siRNA表达载体转染CA2细胞转染前一天按每孔2. 5X 1()5个/mL的密度将C2C,2细胞接种于六孔板，用2ml 含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞。24h后细胞达到60% 70%汇合度时， 将4ug的siRNA表达载体(包括无关基因对照质粒)和10ul (l"g/ul)的 Lipo-fectamine 2000加入50 y 1无血清的OPTI-MEM I ，混匀后室温下放置20 分钟。将质粒DNA和脂质体复合物加入含2毫升无血清DMEM培养液的细胞中， 轻轻混匀，37°C、 5%C02培养箱培养12小时后，更换为含有10%胎牛血清的DMEM 完全培养液。培养48小时后收获细胞，用Trizol法提取总RNA。 3、 siRNA抑制效果在肌肉细胞上的评价
上述转染细胞的总RNA经反转录成cDNA后，通过实时定量荧光PCR对MSTN 基因表达进行相对定量分析，评价对MSTN基因表达的抑制效果。定量分析方法 如下Q腦tiTect SYBR Green I试剂进行Real time PCR， PCR反应体系为: 2xmaster mix 10P 1,上下游引物(10 pm)各0. 5ul; cDNA 2wl。 PCR反应条 件为95°C 15min预变性后进行如下循环95°C 10s, 58°C 20s，72。C 20s， 55 个循环后进入融解曲线分析程序40°C-99°C (0. rc/s)。通过相对定量分析， PSi-717能够有效抑制61%的MSTN的转录，pSi-986能够有效抑制53%的转录。本专利所设计的核苷酸弓I物序列如下
MSTN-Si-986:
(正链)5， GATCCGCAAACCCCAGAGGTTCAGTTCAAGAGACTGAACCTCTGGGGTTTGCTTA3 (负链)5， AGCTTAAGCAAACCCCAGAGGTTCAGTCTCTTGAACTGAACCTCTGGGGTTTGCG3 MSTN-Si-717:
(正链)5， GATCCCCTTCCCAGAACCAGGAGATTCAAGAGATCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA3 (负链)5， AGCTTAACCTTCCCAGAACCAGGAGATCTCTTGAATCTCCTGGTTCTGGGAAGGG权利要求
1 两个针对肌肉生长抑制素基因编码区的干扰RNA序列。
2 构建的两个干扰RNA真核表达载体。
3 两个干扰RNA真核表达载体转染肌肉细胞的方法。
全文摘要
本发明公布了两种抑制“肌肉生长抑制素基因”的合成小干扰RNA分子。发明涉及对肌肉抑制素基因产生显著抑制作用的体外合成小干扰RNA分子的设计、合成和抑制效果的评价。根据GeneBank中MSTN序列设计siRNA分子群，选择针对不同位点的8条siRNA序列进行合成，siRNA单链分子经退火、连接到pSilence4.1专一表达载体上，构建pSi-MSTN表达质粒。脂质体转染小鼠成肌细胞C<sub>2</sub>C<sub>12</sub>，建立最佳外源基因转染条件。转染48小时后收集C<sub>2</sub>C<sub>12</sub>细胞，提取总RNA，通过实时定量荧光PCR检测肌肉细胞MSTN mRNA表达水平，分析siRNA对MSTN的干扰抑制作用。分析比较实验组和对照组细胞MSTN表达水平与肌细胞生长的相关性，评价siRNA对MSTN基因表达的阻断作用和促进肌肉细胞增殖生长的作用，获得pSi-717和pSi-986两种有效抑制MSTN基因表达的siRNA分子载体。
文档编号C12N15/79GK101591652SQ20081007288
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者刘明军, 刘晨曦, 森 唐, 马晓林 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心