专利名称：PCR-mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，主要涉及使用PCR-mtDNA检测总禽源性成分。
背景技术：
疯牛病、禽流感、羊搔痒病在世界各地的蔓延和传染给人类的事例，引起了各国政 府和消费者对肉食品、词料安全性的高度关注。目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别 检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。同时，国内外肉食品 及词料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。因此，研究出一种 准确、快速、可靠的鉴别总禽源性成分的方法，就非常有必要。目前，为了确定食物及饲料的真实性，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法， 有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主 要包括核DNA 、 RNA、线粒体DNA (mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记 鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几 乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此， 无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因 组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒 体基因组(哺乳动物约1000 2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜 禽肉食品及词料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快 速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA 的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的 前景。国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、 驴、马、鹿属进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上， 国内外尚未见到对总禽源性成分鉴别检测的研究报道。发明内容-本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种PCR-mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其特异性引物的扩增条件。本发明的另一目的是提供一种PCR-mtDNA检测总禽源性成分的检测试剂盒。 本发明的还有一个目的是提供一种PCR-mtDNA检测总禽源性成分的检测试剂盒的使用方法。以准确、快速、可靠的用PCR-mtDNA技术鉴别总禽源性成分。 本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 一种用于检测总禽源性成分的 特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度分别为18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC陽3'; 下游引物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'。所述的用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，还包括有所述的特 异性引物的扩增条件为用聚合酶链反应进行扩增，94"C预变性5min， 1个循环，然后进 入PCR循环94。C变性30sec， 54'C退火30sec， 72'C延伸20sec，设计35个循环，最后 72'C延伸3min。所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒，包括有① 10XPCR缓冲液，其中含Mg2+20 ,L/L;②dNTP ,其中2. 5画L/L ;③上游引物PF， 其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，2U/l^L;⑥灭菌超纯水；⑦ DNA模板。所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法， 其主要特点是包括有如下步骤.-(1) 待检物DNA的提取；(2) 将试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1.5。/。琼脂糖凝胶电泳检测。含有总禽源性成分的检测物被引物PF+PR 扩增出DNA特异性片段,呈阳性。所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检领啲试剂盒的使用方法，所述的DNA的提取有如下步骤① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500^1 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶Kl(Hd，浓度为20mg/ml慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液； 4°C13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，有清晰的 分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相， 一般为黄色， 中间有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成 大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切)小心吸出上 层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；⑤加入RNase3ul ，浓度为1.5ul /ml，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿:异戊醇，其比例为25:24:1，温和的混 匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；(Z)重复步骤④；⑧ 加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提；⑨ 重复步骤④；⑩ 在水相中加入1/10体积的3MNaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液；0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; 加入3(^1 TE缓冲液，室温放置24h，然后4'C保存备用。 CZ)重复步骤④；本发明的有益效果是，近年来随着数个国家高致病性禽流感的相继发生，除鸡以外 己波及到人、天鹅、猫等的死亡，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类食品和饲 料的安全性已关系到人类的安危。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴别禽类动物源性 成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实 意义。本研究以灭菌超纯水对禽类DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul,即该引物的灵敏度 是120pg/ul。
图1为鹌鸦、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧聘、牛、羊、马、驴、鱼动物的基因组DNA的电泳检测结果图；图2为含鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼饲料基因组 DNA的电泳检测结果图；图3总禽的特异性弓l物验证图；图中2kb Marker; DNA:1:鹌鹤；2:鹆3:鸡；4鸭；5:鹅；6:鸵鸟；7: 鹧鸪；8:牛；9 :羊；10:马；11:驴；12:鱼；13:空白对照。 图4含动物源性成分饲料的特异性引物验证图；图中2kb Marker; DNA:1:鹌享鸟；2:鹆3:鸡；4鸭；5:鹅；6:鸵鸟；7: 鹧鸪；8:牛；9 :羊；10:马；11:驴；12:鱼；13:空白对照。图5总禽特异性PCR灵敏度验证结果检测电泳图。
具体实施例方式以下对所示之最佳实施例作进一步详述 实施例l:对鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼动物和含鹌 鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼源性成分饲料检测验证实验。(1) 总DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、 鱼动物的基因组DNA和含鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、 鱼源性成分饲料DNA，电泳检测结果(如图l、 2)。提取基因组DNA均经紫外分光光 度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8左右，说明DNA纯度较高符合 PCR扩增要求。(2) PCR-mtDNA特异性引物的设计比较GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别 检测总禽源性成分的PCR特异性引物(只能扩增出总禽DNA限制性片段，而扩增不出 其它哺乳动物DNA限制性片段)，引物如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游弓l物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3';扩增序列长度为208—215bp。 (3)总禽引物的特异性验证利用所设计的总禽特异性引物PF和PR，分别对鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧 鸪、牛、羊、马、驴、鱼等动物组织DNA和含鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、 羊、马、驴、鱼源性成分饲料DNA为模板进行PCR扩增。(3.1) 10XPCR缓冲液(含Mg"20 mmoL/L) 2. 5|4; dNTP (2.5國L/L) , 0.5|4; 上游引物PF (25pmoL/L) 1. 0W; 下游弓I物PR (25pmoL/L) LOW; T叫酶(2U/MU 0.5^1; DNA模板 1.014; 加灭菌超纯水至25Pl。(3.2) PCR反应条件94。C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94。C变性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，设计35个循环，最后72'C延伸3min。 原理1) 模板DNA的变性模板DNA经力B热至94。C5min后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；2) 模板DNA与引物的复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57。C，弓|物 模板DNA单链的互补序列配对结合；3) 引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，耙序列DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-复性-延伸三个过程，就可获得更多的"半 保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。从扩增产物电泳结果图(图3、 4)可以看出，只能从鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、 鹧鸪的DNA模板和含鹌鹁、鸽、鸡、ff鹅、鸵鸟、鹧鸪源性成分饲料DNA中扩增出 大小约为210bp的片段，与预期目的片段大小基本一致，而哺乳动物和鱼扩增结果均无 扩增条带出现。 (4)引物的准确性验证用总禽引物分别扩增鸡、鸭、鸽、鹅、鹌鹑、鸵鸟、鹧鸪DNA，其PCR-mtDNA产物测序结果如下(4. 1)扩增鸡DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatag c 211 该序列长度为211bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鸡线粒体DNA的12sRNA 基因区段序列完全一致，符合率达到99%。(4.2) 扩增鸭DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc180 accccgctaa taagacaggt caaggtatag c 211 该序列长度为211bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鸭线粒体DNA的12sRNA 基因区序列完全一致，符合率达到100%。(4.3) 扩增鹆DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca120gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt atagc 215 该序列长度为215bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鸽线粒体DNA的12sRNA 基因区段序列完全一致，符合率达到94%。(4.4) 扩增鹅DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaatc gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180 ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc 210该序列长度为210bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鹅线粒体DNA的12sRNA 基因区段序列完全一致，符合率为100%。(4.5) 扩增鹌鹑DNA产纟勿测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208 该序列长度为208bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鹌鹑线粒体DNA的 12sRNA基因区段序列完全一致，符合率为100%。(4.6) 扩增鸵鸟DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatc gataatccac gattcaccca accacccctt gccatgcagc 120ctacataccg ccgtcgccag cccgcctcat gagagaacaa tagcgagcac aatagcccac 180ccgctaacaa gacaggtcaa ggtatagc 208 该序列长度为208bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鹌鹑线粒体DNA的 12sRNA基因区段序列完全一致，符合率达到99%。(4.7) 扩增鹧鸪DNA产物测序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatcgataatccacgattcaccca accatccttt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gctcacctcc aatgaaagag caacagtgag cccaacagtc 180tccactaata agacaggcaa aggtatagc 209该序列长度为209bp，与GenBank中序列比较分析表明，与鹧鸪，蓝孔雀等33条 鸟类线粒体DNA的12sRNA基因区段序列完全一致，符合率达到93%。以上测序结果的分析表明所建立的禽类源性成分PCR-mtDNA检测技术具有准确 性、特异性、可靠性。 (6)特异性PCR的灵敏度验证以灭菌超纯水对目标禽类的DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后用总禽特 异性引物PF和PR进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果图(图3)可知，能检测到的 最低线为120pgM,即该引物的灵敏度是120pg/ul。实施例2:对含有禽类源性成分的饲料的PCR检测方法。分别对含有含鹌鹑、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼源性成 分饲料进行检测。 (一)提取跳采用酚氯仿抽提法(参照"分子克隆试验指南(第二版).北京科学出版 社，1995:34 60")① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的L5ml离心管中，加入50(^1 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/ml)l(Vl，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于50'C水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液；④4。C13000rpm/min离心10min;小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见 有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一 般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成大于3mra的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切) 小心吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 加入RNase (1%) 3 u 1 (1. 5 u 1 /ml)，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇(25:24:1)温和的混匀两相，振 荡2min，形成均匀乳浊液；⑦ 重复步骤④；⑧ 加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，使两相充分混匀继续抽提； 重复步骤 ;⑩在水相中加入1/10体积的3M醋酸钠混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水 乙醇，弃上清液；@用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min;⑩加入30ri TE缓冲液，室温放置24h，然后4"C保存备用。(二) 引物合成将上游引物PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游引物PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'送往生物公司合成，每条引物各20D ，用时稀释到 25pmol/L。(三) PCR扩增PCR反应试剂盒10XPCR缓冲液(含Mg"20 mmoL/L)2. 5W;d證(2. 5 ,L/L)0.PF (25pmoL/L)PR (25praoL/L)1. 014Taq酶(2U/叱)0.514DNA模板加灭菌超纯水至25W。将试剂盒中各组分与待检物DNA混合。 PCR反应条件94'C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94'C变性30sec， 54。C退火30sec, 72'C延伸20sec，设计35个循环，最后72'C延伸3min。(四) 电泳检测 ' PCR产物经1.5y。琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物电泳结果图(见图4)(五) 检测结果含有禽类源性成分的检测物会被引物PF+PR扩增出DNA特异性片段，呈阳性。 实施例3:基因组DNA的提取试剂的制备(1)细胞裂解液的制备① 1M Tris-HC1 250mL:称30.285gTris，加水定容至250mL，加HC1调解pH至8. 0，高压灭菌，4'C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL双蒸水中加入37. 22g EDTA-Na2. 2H20,剧烈搅拌，用Na0H调节pH至8. 0 (约需4gNaOH)，定容至200 raL，分装后高压灭菌，4'C保存。③ 10% (m/v) SDS:将10g SDS溶于90mL双蒸水中，加热至68°C (助溶几滴浓HC1， pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分装备用，室温保存，无须灭菌。取lmol/L的Tris-HCl (pH8. 0) 2mL、0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、10% (m/v) 的SDS 10mL，加灭菌双蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制备100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿异戊醇(24:1):按24: 1的体积将氯仿、异戊醇混合，置棕色瓶中4'C 保存。(4) 苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)的制备:按25: 24: 1的体积将苯酚、氯仿、 异戊醇混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3丽aAc的制备称取40. 8gNaAc. 3H20，溶解，加水至100mL。高压灭菌15min ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制备称取RNase A lOmg溶于10ramol/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IOO'C加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分 装成小份保存于一2(TC。如为Sigma公司产品， 一般则不需加热煮沸。序列表〈110〉张利平 张慧霞〈120〉 PCR-mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法 〈160〉 7〈210〉 1 〈211〉 211 〈212〉 DNA〈213〉扩增鸡DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180 cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatagc 211〈210〉 2 〈211〉 211 〈212〉腿〈213〉扩增鸭DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca 120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc 180accccgctaa taagacaggt caaggtatagc 211〈210〉 3 〈211〉 215 〈212〉 DNA〈213〉扩增鹆DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta '60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca 120 gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt' atagc 215〈210〉 4 〈211〉 210 〈212〉隨〈213〉扩增鹅DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaate gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc, 210〈210〉 5 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉扩增鹌鹑DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120 cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180 ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208〈210〉 6 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉扩增鸵鸟DNA产物测序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60<formula>formula see original document page 16</formula>
权利要求
1.一种用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是上下游长度分别为18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物PF5′-AGAACTACGAGCACAAAC-3′；下游引物PR5′-GCTATACCTTGACCTGTCT-3′。
2. 如权利要求1所述的用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特 征是还包括有所述的特异性引物的扩增条件为9fC预变性5min， 1个循环，然后进 入PCR循环94。C变性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，设计35个循环， 最后72'C延伸3min。
3. 如权利要求1所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒，其特征是包括有①10XPCR缓冲液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 腿oL/L;③上游引物PF，其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq 酶，2U/PL;⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。
4. 如权利要求3所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法，其特征是包括有如下步骤(1) 待检物DNA的提取；(2) 将试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1.5y。琼脂糖凝胶电泳检测，含有总禽源性成分的检测物被引物PF+PR 扩增出DNA特异性片段,呈阳性。
5. 如权利要求4所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的 使用方法，其特征是所述的DNA的提取有如下步骤① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入50(^1 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10^U，浓度为2amg/ml慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液；④4ri3000卬m/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，有清晰的 分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相， 一般为黄色，中间有白色的絮状物为蛋白质，用大口的tip头吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 加入RNase3u 1 ，浓度为1. 5u 1 /ml，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇，其比例为25:24:1，温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液； 重复步骤 ; 加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提； 重复步骤④；⑩在水相中加入1/10体积的3丽aAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液；(0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min;⑩加入30W TE缓冲液，室温放置24h，然后4。C保存备用。
全文摘要
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，主要涉及使用PCR-mtDNA检测总禽源性成分。一种用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度分别为18bp和19bp的核苷酸，序列为上游引物PF(18bp)5’-AGAACTACGAGCACAAAC-3’；下游引物PR(19bp)5’-GCTATACCTTGACCTGTCT-3’。本发明的优点是，准确、快速、可靠的鉴别禽类动物源性成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。本研究以灭菌超纯水对禽类DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。
文档编号C12N15/11GK101270392SQ20081008240
公开日2008年9月24日 申请日期2008年3月3日 优先权日2008年3月3日
发明者吴建平, 卉 宗, 张利平, 张慧霞, 李丽娟, 阮周曦 申请人:张利平;张慧霞