专利名称：PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鸽子源性成分的检测。
背景技术：
疯牛病、禽流感、羊搔痒病在世界各地的蔓延和传染给人类的事例，引起了各国政 府和消费者对肉食品、饲料安全性的高度关注。目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别 检测己涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。同时，国内外肉食品 及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。因此，研究出一种 准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方 法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主 要包括核DNA 、 RNA、线粒体DNA (mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记 鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几 乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此， 无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因 组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒 体基因组(哺乳动物约1000 2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜 禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快 速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA 的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的 前景。国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、4驴、马、鹿属进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上， 国内外尚未见到对鸽子源性成分鉴别检测的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的扩增引物及其特异性引物的扩增条件。本发明的另一 目的是提供一种PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的检测试剂盒。 本发明的还有一个目的是提供一种PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的检测试剂盒的使用方法。以解决准确、快速、可靠的用PCR-mtDNA技术鉴别鸽子源性成分。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 一种用于检测鸽子源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度分别为22bp和20bp的核苷酸，序列如下上游弓I物GF(22bp): 5 ， -ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3 ，；下游引物GR(20bp): 5' -TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3，。所述的用于检测鸽子源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，所述的特异性引物 的扩增条件为94'C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94'C变性30sec， 62. 5°C 退火30sec， 72。C延伸15sec， 35个循环，最后72。C延伸3min。所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒，包括有① 10XPCR缓冲液，其中含Mg2+20咖oL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ;③上游引物GF， 其中25pmoL/L;④下游引物GR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，2U/l^L;⑥灭菌超纯水；⑦ DNA模板。所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法， 包括有如下步骤(1) 待检物DNA的提取；(2) 将试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，含有鸽子源性成分的检领,被引物GF+GR 扩增出DNA特异性片段，即阳性。所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法， 所述的待检物DNA的提取有如下步骤① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入50(^1细胞裂解液消^S; ,② 加入蛋白酶K10pl，浓度为20 mg/ml，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液； 4°C13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，有清晰的 分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相， 一般为黄色， 中间有白色的絮状物为蛋白质；用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成 大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切)小心吸出上 层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；O加入RNase3 u 1 ，浓度1. 5 yl /ml，轻轻混匀37。C水浴lh;(B)降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇，其比例为25:24:1温和的混匀 两相，振荡2min，形成均匀乳浊液； 重复步骤 ;⑧ 加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提；⑨ 重复步骤④； 在水相中加入1/10体积的3M NaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液；@用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; 加入3014 TE缓冲液，室温放置24h，然后4。C保存备用。本发明的有益效果是，近年来随着数个国家高致病性禽流感的相继发生，除鸡以外 已波及到人、天鹅、猫等，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类食品和饲料的安 全性已关系到人类的安危。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴别禽类动物源性成分的 方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。 本研究以灭菌超纯水对鸽DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由 PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。
图1为鹆、含鸽源性成分的饲料、鹌鹤、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、 驴、鱼动物的基因组DNA的电泳检测结果图； 图2鸪PCR扩增产物电泳图； 图3鸽特异性基因片段的PCR检测电泳图；图中1、 2kbMarker; DNA: 2、鹆；3、含鹆源性成分的饲料；4、鹌享鸟；5、鸡；6、鸭；7、鹅；8、鸵鸟；9、鹧鸪；10、牛；11、羊；12、马；13、驴14、鱼；15、空白对照。 图4鸽特异性PCR灵敏度验证结果检测电泳图。
具体实施方式
-以下对所示之最佳实施例作进一步详述实施例l:对鹆；含鹆源性成分的饲料；鹌鹤；鸡；鸭；鹅；鸵鸟；鹧鸪；牛；羊; 马；驴；鱼动物的检测验证实验。(1) 总DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鸽；含鸽源性成分的饲料；鹌鹑；鸡；鸭；鹅；鸵鸟；鹧鸦；牛；羊；马；驴；鱼等动物的基因组DNA，电泳检测结果如图1。提取基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8左右，说明DNA 纯度较高符合PCR扩增要求。(2) PCR-mtDNA特异性引物的设计比较GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别 检测鸽源性成分的PCR特异性引物(只能扩增出鸽DNA特异性片段，而扩增不出其它 动物DNA限制性片段)，引物如下上游引物GF(22bp): 5， -ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3，；下游弓I物GR(20bp): 5 ， -TATGTCCTGCGAGCATTCAC -3 ，；扩增序列长度为156bp。(3) 鹆PCR扩增利用设计的特异性弓,GF和GR，以鸽DNA为模板进行PCR扩增。 (3.1 ) PCR反应体系10 X PCR缓冲液(含Mg2+20 mmoL/L) 2. 5|4;dNTP (2.5讓oL/L) 0.5|xl;上游引物GF (25pmoL/L) 1. 0l4;下游引物GR (25pmoL/L) 1.0|4;Taq酶0. 5|4;灭菌超纯水 18.DNA模板 LOW;反应总体积为25. OW。 (3.2) PCR反应条件94。C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94。C变性30sec，62. 5。C退火30sec, 72'C延伸15sec,设计35个循环，最后72。C延伸3min。扩增产物电泳结果见(图2)，可以看出，扩增出约156bp的DNA片段，与预期扩增的片段长度相符。 原理1) 模板DNA的变性模板DNA经加热至94。C5min后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；2) 模板DNA与引物的复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57°C，引物 模板DNA单链的互补序列配对结合；3 )引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与 模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-复性-延伸三个过程，就可获得更多的 "半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。(4) 引物的特异性验证-利用所设计鉴别检测鸽源性成分的特异性引物，分别以鸽子、含鹆成分的饲料样品、鹌鹤、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧聘、牛、羊、马、驴、鱼等动物和含鸽源性成分饲料的总DNA为模板，进行PCR扩增，验证引物的特异性。PCR产物电泳结果见(图3)，该 引物能够从鸽及含鸽成分的词料样品的DNA中扩增出特异性的目的条带，扩增产物大 小为156bp，而从其它动物组织的DNA中均没有能够扩增出目的条带。(5) 扩增鹆DNA产物测序序列 将鸽PCR扩增产物进行纯化后送测序公司测序。测序结果经与GENEBANK比对分析表^^: PCR特异性扩增产物的测序结果如下。与鸽mt-DNA的D-loop环区段同源性 达到94 %。鸽PCR产物测序序列结果acactgatgc actttgtctt ccataactcg gctggatgta atggattaag gacatacaga 60 gcttcgcccg cgagatgcac cctttcgagc atctggttatggtgtgtccg caagtaccta 120 caaatgctgc atattagtga atgctcgcag 'gacata 156(6)特异性PCR的灵敏度验证以灭菌朝纯水对鸽DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由 PCR产物电泳结果图(图4)可知，能检测到的最低线为120pg/ul,即该引物的灵敏度 是120pg/ul。实施例2:对含有鸽子源性成分的饲料的PCR检测方法。 (一)提取DNA:采用酚氯仿抽提法(参照"分子克隆试验指南(第二版).北京科学出版社，1995:34 60")① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入50(^1 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/ml)10nl，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液； 4°C13000rpm/min离心10min，小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见 有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一 般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切) 小心吸出上层水相，移至另一千净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 加入RNase (1%) 3 y 1 (1. 5 iU /ml)，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇(25:24:1)温和的混匀两相，振 荡2min，形成均匀乳浊液；⑦ 重复步骤④；⑧ 加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，使两相充分混匀继续抽提；⑨ 重复步骤④；⑩ 在水相中加入1/10体积的3M NaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液； 用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; 加入30)4 TE缓冲液，室温放置24h，然后4。C保存备用。(二) 引物合成将上游引物GF(22bp): 5，-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3 ，;下游引物GR(20bp): 5' -TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3''送往生物公司合成，每条引物各20D ，用时稀 释到25pmol/L。(三) PCR扩增PCR反应试剂盒10XPCR缓冲液(含Mg2+20 mmoL/L) 2. 5|4;dNTP (2. 5 ,L/L) 0. 5W;上游引物GF (25pmoL/L) 1. 0W;下游引物GR (25pmoL/L)Taq酶(2U/叱) 0. 5rt;DNA模板加灭菌超纯水至25ri。 将试剂盒中各组分与待检物DNA混合。 PCR反应条件94。C预变性5min, 1个循环，然后进入PCR循环94。C变性30sec， 62. 5。C退火 30sec， 72。C延伸15sec，设计35个循环，最后72。C延伸3min。(四) 电泳检测PCR产物经1.5y。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳结果见(图3)。(五) 检测结果含有鸽子源性成分的检测物会被弓卿GF+GR扩增出DNA特异性片段，即阳性。 实施例3: , 基因组DNA的提取试剂的制备(1)细胞裂解液的制备① 1M Tris-HC1 250mL:称30.285gTris，加水定容至250mL，加HC1调解pH至8. 0，高压灭菌，4。C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL双蒸水中加入37. 22g E加A-Na2. 2H20,剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8. 0 (约需4gNaOH)，定容至200 mL，分装后高压灭菌，4。C保存。 ③10% (m/v) SDS:将10g SDS溶于90mL双蒸水中，加热至68°C (助溶几滴浓HC1， pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分装备用，室温保存，无须灭菌。取lmol/L的Tris-HC1 (pH8. 0) 2mL、 0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、 10% (m/v)的SDS 10mL，加灭菌双蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制备100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿异戊醇(24:1):将氯仿、异戊醇按24: l的体积混合，置棕色瓶中4'C 保存。(4) 苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1):按25:24:1的体积将苯酚、氯仿、异戊醇 混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3MNaAc的制备称取40. 8gNaAc. 3H20,溶解，加水至100mL。高压灭菌15min ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制备称取RNase A lOmg溶于10,1/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IO(TC加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分 装成小份保存于一2(TC。如为Sigma公司产品， 一般则不需加热煮沸。序歹IJ表〈110〉深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心〈120〉 PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法〈211〉 156〈212〉腿〈400〉acactgatgc actttgtctt ccataacteg gctggatgta atggatteag gacatacaga 60 gcttcgcccg cgagatgcac cctttcgagc atctggttatggtgtgtccg caagtaccta 120 caaatgctgc atattagtga atgctcgcag gacata 1561权利要求
1.一种用于检测鸽子源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是上下游长度分别为22bp和20bp的核苷酸，序列如下上游引物GF(22bp)5’-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3’；下游引物GR(20bp)5’-TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3’。
2. 如权利要求1所述的用于检测鸽子源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特 征是所述的特异性引物的扩增条件为94'C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循 环94。C变性30sec， 62. 5'C退火30sec， 72。C延伸15sec， 35个循环，最后72°C 延伸3min。
3. 如权利要求1所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒，其特征是包括有①10XPCR缓冲液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ;③上游引物GF，其中25pmoL/L;④下游引物GR，其中25pmoL/L;⑤T叫酶， 2U/A; (D灭菌超纯水；⑦DNA模板。
4. 如权利要求3所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法，其特征是包括有如下步骤:(1) 待检物DNA的提取；(2) 将试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1. 5y。琼脂糖凝胶电泳检测;含有鸽子源性成分的检测物被引物GF+GR 扩增出DNA特异性片段，即阳性。
5. 如权利要求4所述的所述的用于检测鸽子源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法，其特征是所述的待检物DNA的提取有如下步骤① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500|il 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10|il，浓度为20 mg/ml，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再 次加入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次-,③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液； 4°C13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，有清晰的 分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相， 一般为黄色，中间有白色的絮状物为蛋白质；用大口的tip头吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 加入RNase3 u 1 ，浓度1. 5 u 1 /ml，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇，其比例为25:24:1温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液； 重复步骤 ;⑧加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提； 0)重复步骤(3);⑩在水相中加入1/10体积的3M NaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液； 用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌 的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; 加入30!4 TE缓冲液，室温放置24h，然后4。C保存备用。
全文摘要
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鸽子源性成分的检测。一种用于检测鸽子源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度分别为22bp和20bp的核苷酸，序列为上游引物GF(22bp)5’-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3’；下游引物GR(20bp)5’-TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3’。本发明的优点是，准确、快速、可靠的鉴别鸽子源性成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。本研究以灭菌超纯水对鸽DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。
文档编号C12Q1/68GK101260439SQ20081008241
公开日2008年9月10日 申请日期2008年3月3日 优先权日2008年3月3日
发明者吴建平, 卉 宗, 张利平, 张慧霞, 曹琛福, 李丽娟 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心