截短的人乳头瘤病毒16型l1蛋白的制作方法

专利名称：截短的人乳头瘤病毒16型l1蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒16型L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒，含该类病毒颗粒的疫苗及其在预防宫颈癌中的用途。

背景技术：
人乳头瘤病毒HPV(Human Papillomavirus)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E76个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。
目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系又可分为3组①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV 31、33、35、51、52；③高度癌风险组，包括HPV16、18、45、58。
HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中HPV DNA检出率高达80％以上，其中HPV16约占60％，其它高危型如HPV18，31，45，58)约占25％-30％(Clifford，G.，S.Franceschi，et al.Vaccine 2006.24 Suppl3S26-34.)。
宫颈癌是一种常见见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490,000例左右的新发病例，约有270,000人死于该疾病(Boyle，P.，and J.Ferlay.Ann Oncol 2005，16481-8.)。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家的占了约83％，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15％。而在发达国家，这个数字仅占到1.5％。在撒哈拉以南地区，中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。因此，安全有效的HPV疫苗，特别是针对HPV16，18等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌，改善广大妇女健康状况的有效途径。
HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55～60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LikeParticle，VLP)。该种类病毒颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992 Proc Natl Acad Sci USA 89(24)12180-4.)并且，类病毒颗粒并不带有病毒核酸，并无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。
HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。
常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市HPV疫苗Gardasil

采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。
原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如有报道利用大肠杆菌表达HPV16 L1蛋白(Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)3081-9)。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).JVirol Methods 53(1)75-90)，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化(Li，M.，T.P.Cripe，etal.(1997).J Virol 71(4)2988-95.)，但融和蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。
因此，本领域仍然需要具有低成本，能够诱导产生针对HPV保护性抗体的HPVL1蛋白及由其组成的类病毒颗粒，从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。


发明内容
本发明的目的是提供一种新的HPV16 L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒及含该类病毒颗粒的疫苗。
本发明人经研究出人意料地发现，在大肠杆菌表达系统能得到可以诱导针对HPV16中和抗体的截短HPV16L1蛋白，该截短的HPV16 L1蛋白经纯化后得到高产率，纯度至少50％的HPV L1蛋白。纯化后的HPVL1蛋白经进一步处理得到可诱导针对HPV16保护性抗体的类病毒颗粒，本发明基于以上发明现已完成。
因此，本发明第一方面涉及一种(与野生型HPV16 L1蛋白相比)N端截短了4、6、8、10、20、30、或40个氨基酸的HPV16 L1蛋白。优选该截短蛋白具有序列1，2，3，4，5，6或7，特别是序列6。
本发明再一方面涉及编码本发明截短蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
本发明再一方面涉及包含上述载体的细胞。
本发明还涉及包含上述截短蛋白或多核苷酸或载体或细胞的组合物。
本发明再一方面涉及一种HPV16类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有N端截短了4、6、8、10、20、30、或40个氨基酸的HPV16 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，5，6或7的HPV16 L1蛋白，或由N端截短了4、6、8、10、20、30、或40个氨基酸的HPV16 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，5，6或7的HPV16 L1蛋白组成或形成。
本发明再一方面涉及一种获得HPV16 L1蛋白的方法，其包括在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV16 L1基因片段，然后将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。
在一个优选实施方案中，获得HPV16 L1蛋白的方法包括 a)在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV16 L1基因片段， b)将表达了截短HPV16 L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液， c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀， d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的截短HPV16 L1蛋白。
更一般性地，本发明还涉及一种获得HPV L1蛋白例如本发明HPV16 L1蛋白的方法，其包括 a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPV L1蛋白的HPV L1基因， b)将表达了HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液， c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀， d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。
本发明还涉及一种预防宫颈癌疫苗，其包括本发明的HPV16 L1蛋白类病毒颗粒，优选地，所述HPV16 L1蛋白类病毒颗粒以预防宫颈癌有效量存在。优选该疫苗还包含至少一种选自HPV18L1蛋白类病毒颗粒，HPV11L1蛋白类病毒颗粒，HPV6L1蛋白类病毒颗粒，HPV31L1蛋白类病毒颗粒，HPV33L1蛋白类病毒颗粒，HPV45L1蛋白类病毒颗粒，HPV52L1蛋白类病毒颗粒，HPV58L1蛋白类病毒颗粒的类病毒颗粒；优选地，这些类病毒颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。该疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
优选地，所述疫苗含有HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒，特别是，含有具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒。更优选所述疫苗还含有HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒，特别是含有具有SEQ IDNO10所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒。
在一个特别优选的实施方案中，所述疫苗包含含有具有SEQ IDNO6所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒。优选地，这些类病毒颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。
本发明进一步涉及本发明HPV16 L1蛋白或其类病毒颗粒在制备用于预防宫颈癌疫苗中的用途。
本发明还涉及一种预防宫颈癌的方法，其包括将含预防有效量的本发明HPV16 L1蛋白疫苗给予需预防宫颈癌的人。
本发明还涉及一种获得HPV16 L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括 e)将纯度至少50％的截短HPV16 L1蛋白进一步通过色谱层析纯化， f)将e)步骤中得到的HPV16 L1蛋白去除还原剂。
本发明还涉及一种制备用于预防宫颈癌疫苗的方法，其包括将上述类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混和。
本发明中相关术语的说明及解释 根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“截短HPV16 L1蛋白基因片段”是指在野生型HPV16 L1蛋白基因(cDNA)的5’端或3’端去掉编码一个或者多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV16 L1蛋白基因全长序列举例但不限于NCBI数据库中如下序列AY686583.1，DQ469930.1，DQ155283.1，AF393502.1等。
“截短HPV16 L1蛋白”是指在野生型HPV16 L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中野生型HPV16 L1蛋白的例子有但不限于NCBI数据库中AY686583.1，DQ469930.1，DQ155283.1，AF393502.1等所编码的全长L1蛋白。
根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体“是指选自一种或多种，包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“色谱层析“包括但不限于离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，本发明的截短HPV16 L1蛋白优选如下获得将表达有截短HPV16 L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100-600mM，优选200-500mM的缓冲液中进行破碎，分离破碎溶液，得到上清液，用水或低浓度盐(通常低于破碎用的盐浓度)降低所得上清液中盐浓度至盐浓度100Mm-0M，分离盐浓度低至100Mm-0的上清液中的沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度150-2000mM优选200mM以上的溶液中重新溶解，分离，得到纯度至少为50％，优选至少70％，更优选至少80％的截短HPV16 L1蛋白溶液。
根据本发明，在本发明获得的截短HPV16 L1蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现； 根据本发明，在本发明获得的截短HPV16 L1蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种。优选NaCl。所用的还原剂包括但不限于DTT，2-巯基乙醇。所用量包括但不限于10mM-100mM。
根据本发明，本发明的截短HPV16 L1蛋白类病毒颗粒如下获得将上述纯度至少50％的截短HPV16 L1蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的截短HPV16 L1蛋白溶液。去除纯化的截短HPV16L1蛋白溶液中的还原剂，得到截短HPV16 L1的类病毒颗粒。去除还原剂的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。
根据本发明，本发明的截短HPVL1蛋白优选具有序列6。
根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中截短HPV16 L1蛋白类病毒颗粒的量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。
有益效果 目前HPV类病毒颗粒的制备所采用的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。
在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统所采用的杆状病毒表达系统及酵母表达系统均有表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。
在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量大的优点。但在大肠杆菌表达系统中表达的HPV L1蛋白往往失去正确天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难，效率低下，使得从包含体中获得有正确构象的VLP在大规模生产中难以实施，只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以正确构象可溶性形式表达于大肠杆菌裂解上清中，但是表达量低下，而且要从大肠杆菌裂解上清中种类繁多的可溶性蛋白纯化出HPV L1蛋白也相当困难，往往需要借助融合表达及亲和层析等手段进行纯化，以上手段往往需要昂贵的酶，难以进行工业化生产。
本发明在大肠杆菌表达系统中表达N端截短HPV16 L1蛋白，并且采用温和的手段选择性沉淀表达在大肠杆菌裂解上清中的HPV16 L1蛋白，进一步采用含盐缓冲液重溶HPV16 L1蛋白，使得在保持HPV16 L1蛋白正确构象前提下使其纯度有了显著提高且重溶后的目的蛋白可以直接进行离子交换层析及疏水交换层析纯化获得纯蛋白。通过以上步骤获得纯化后的截短HPV16 L1截短蛋白可以组装为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体，预防HPV16对人体的感染，是一种良好的疫苗形式。此外，本发明中采用的截短HPV16 L1蛋白在保留全长HPV16 L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力的同时，易于在大肠杆菌表达系统中表达，所采用的纯化方法无需使用昂贵的酶，成本低廉。而且目的蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程，损失小，可应用于大规模工业化生产。
在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。



图1显示了在本发明实施例2不同步骤中HPV16N30C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M分子量Marker；1破菌上清；2无盐沉淀产物；3重悬后沉淀；4重悬后上清。结果显示，HPV16N30C-L1蛋白在通过沉淀，复溶的步骤之后，纯度从之前的约10％左右提高到了约70％左右。
图2显示了实施例3中所得经HPV16N30C-L1的HIC(疏水相互作用色谱)纯化并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示HPV16N30C-L1纯度结果。1Butyl柱上柱前；2，3Butyl柱穿透；4，51mol/L NaCl洗脱；6，800mmol/L NaCl洗脱；7，500mmol/L NaCl。经过ButylSepharose 4 Fast Flow疏水柱纯化，800mmol/L NaCl洗脱500mmol/LNaCl洗脱的HPV16 L1蛋白纯度达到98％以上。
图3显示了实施例4中中所得的HPV16N30C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(放大100,000倍，Bar＝0.1μm)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。
图4显示了实施例4中所得的HPV16N30C-L1类病毒颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV16N30C-L1类病毒颗粒的水化分子动力学半径为25.86nm，颗粒组装百分比为95.7％。
图5显示了实施例5中HPV16N30C-L1类病毒颗粒接种羊后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到106-107的较高水平。
图6显示了实施例5中HPV16N30C-L1类病毒颗粒接种兔后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。
图7显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV16总IgG抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，总IgG抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。
图8显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV16中和抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。
图9显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV18总IgG抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，总IgG抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。
图10显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV18中和抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。
图11显示了实施例5中HPV6/11/16/18四价疫苗接种小鼠后不同时间的血清中HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度变化情况。免疫程序为0,2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到1×105-1×106。
序列列表
序列1(SEQ ID NO1)
1 MFIYILVITC YENDVNVYHI FFQMSLWLPS EATVYLPPVP VSKVVSTDEY VARTNIYYHA
61 GTSRLLAVGH PYFPIKKPNN NKILVPKVSG LQYRVFRIHL PDPNKFGFPD TSFYNPDTQR
121LVWACVGVEV GRGQPLGVGI SGHPLLNKLD DTENASAYAA NAGVDNRECI SMDYKQTQLC
181LIGCKPPIGE HWGKGSPCTN VAVNPGDCPP LELINTVIQD GDMVDTGFGA MDFTTLQANK
241SEVPLDICTS ICKYPDYIKM VSEPYGDSLF FYLRREQMFV RHLFNRAGAV GDNVPDDLYI
301KGSGSTANLA SSNYFPTPSG SMVTSDAQIF NKPYWLQRAQ GHNNGICWGN QLFVTVVDTT
361RSTNMSLCAA ISTSETTYKN TNFKEYLRHG EEYDLQFIFQ LCKITLTADI MTYIHSMNST
421ILEDWNFGLQ PPPGGTLEDT YRFVTSQAIA CQKHTPPAPK EDPLKKYTFW EVNLKEKFSA
481DLDQFPLGRK FLLQAGLEAK PKFTLGKRKA TPTTSSTSTT AKRKKRKL
序列2(SEQ ID NO2)
1 MYILVITCYE NDVNVYHIFF QMSLWLPSEA TVYLPPVPVS KVVSTDEYVA RTNIYYHAGT
61 SRLLAVGHPY FPIKKPNNNK ILVPKVSGLQ YRVFRIHLPD PNKFGFPDTS FYNPDTQRLV
121WACVGVEVGR GQPLGVGISG HPLLNKLDDT ENASAYAANA GVDNRECISM DYKQTQLCLI
181GCKPPIGEHW GKGSPCTNVA VNPGDCPPLE LINTVIQDGD MVDTGFGAMD FTTLQANKSE
241VPLDICTSIC KYPDYIKMVS EPYGDSLFFY LRREQMFVRH LFNRAGAVGD NVPDDLYIKG
301SGSTANLASS NYFPTPSGSM VTSDAQIFNK PYWLQRAQGH NNGICWGNQL FVTVVDTTRS
361TNMSLCAAIS TSETTYKNTN FKEYLRHGEE YDLQFIFQLC KITLTADIMT YIHSMNSTIL
421EDWNFGLQPP PGGTLEDTYR FVTSQAIACQ KHTPPAPKED PLKKYTFWEV NLKEKFSADL
481DQFPLGRKFL LQAGLEAKPK FTLGKRKATP TTSSTSTTAK RKKRKL
序列3(SEQ ID NO3)
1 MLVITCYEND VNVYHIFFQM SLWLPSEATV YLPPVPVSKV VSTDEYVART NIYYHAGTSR
61 LLAVGHPYFP IKKPNNNKIL VPKVSGLQYR VFRIHLPDPN KFGFPDTSFY NPDTQRLVWA
121CVGVEVGRGQ PLGVGISGHP LLNKLDDTEN ASAYAANAGV DNRECISMDY KQTQLCLIGC
181KPPIGEHWGK GSPCTNVAVN PGDCPPLELI NTVIQDGDMV DTGFGAMDFT TLQANKSEVP
241LDICTSICKY PDYIKMVSEP YGDSLFFYLR REQMFVRHLF NRAGAVGDNV PDDLYIKGSG
301STANLASSNY FPTPSGSMVT SDAQIFNKPY WLQRAQGHNN GICWGNQLFV TVVDTTRSTN
361MSLCAAISTS ETTYKNTNFK EYLRHGEEYD LQFIFQLCKI TLTADIMTYI HSMNSTILED
421WNFGLQPPPG GTLEDTYRFV TSQAIACQKH TPPAPKEDPL KKYTFWEVNL KEKFSADLDQ
481FPLGRKFLLQ AGLEAKPKFT LGKRKATPTT SSTSTTAKRK KRKL
序列4(SEQ ID NO4)
1 MITCYENDVN VYHIFFQMSL WLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL
61 AVGHPYFPIK KPNNNKILVP KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV
121GVEVGRGQPL GVGISGHPLL NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP
181PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD
241ICTSICKYPD YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST
301ANLASSNYFP TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS
361LCAAISTSET TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN
421FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP
481LGRKFLLQAG LEAKPKFTLG KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL
序列5(SEQ ID NO5)
1 MYHIFFQMSL WLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK
61 KPNNNKILVP KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL
121GVGISGHPLL NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS
181PCTNVAVNPG DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD
241YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP
301TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET
361TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT
421LEDTYRFVTS QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG
481LEAKPKFTLG KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL
序列6(SEQ ID NO6)
1 MLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK KPNNNKILVP
61 KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL GVGISGHPLL
121NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG
181DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD YIKMVSEPYG
241DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP TPSGSMVTSD
301AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET TYKNTNFKEY
361LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS
421QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG LEAKPKFTLG
481KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL*
序列7(SEQ ID NO7)
1 MPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK KPNNNKILVP KVSGLQYRVF
61 RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL GVGISGHPLL NKLDDTENAS
121AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG DCPPLELINT
181VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE
241QMFVRHLFNR AGAVGENVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL
301QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ
361FIFQLCKITL TADVMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS QAIACQKHTP
421PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG LKAKPKFTLG KRKATPTTSS
481TSTTAKRKKR KL*
序列8(SEQ ID NO8)
1 CATATGCTTC CTAGTGAGGC CACTGTCTAC TTGCCTCCTG TCCCAGTATC TAAGGTTGTA
61 AGCACGGATG AATATGTTGC ACGCACAAAC ATATATTATC ATGCAGGAAC ATCCAGACTA
121CTTGCAGTTG GACATCCCTA TTTTCCTATT AAAAAACCTA ACAATAACAA AATATTAGTT
181CCTAAAGTAT CAGGATTACA ATACAGGGTA TTTAGAATAC ATTTACCTGA CCCCAATAAG
241TTTGGTTTTC CTGACACCTC ATTTTATAAT CCAGATACAC AGCGGCTGGT TTGGGCCTGT
301GTAGGTGTTG AGGTAGGTCG TGGTCAGCCA TTAGGTGTGG GCATTAGTGG CCATCCTTTA
361TTAAATAAAT TGGATGACAC AGAAAATGCT AGTGCTTATG CAGCAAATGC AGGTGTGGAT
421AATAGAGAAT GTATATCTAT GGATTACAAA CAAACACAAT TGTGTTTAAT TGGTTGCAAA
481CCACCTATAG GGGAACACTG GGGCAAAGGA TCCCCATGTA CCAATGTTGC AGTAAATCCA
541GGTGATTGTC CACCATTAGA GTTAATAAAC ACAGTTATTC AGGATGGTGA TATGGTTGAT
601ACTGGCTTTG GTGCTATGGA CTTTACTACA TTACAGGCTA ACAAAAGTGA AGTTCCACTG
661GATATTTGTA CATCTATTTG CAAATATCCA GATTATATTA AAATGGTGTC AGAACCATAT
721GGCGACAGCT TATTTTTTTA TCTACGAAGG GAACAAATGT TTGTTAGACA TTTATTTAAT
781AGGGCTGGTG CTGTTGGTGA TAATGTACCA GACGATTTAT ACATTAAAGG CTCTGGGTCT
841ACTGCAAATT TAGCCAGTTC AAATTATTTT CCTACACCTA GTGGTTCTAT GGTTACCTCT
901GATGCCCAAA TATTCAATAA ACCTTACTGG TTACAACGAG CACAGGGCCA CAATAATGGC
961ATTTGTTGGG GTAACCAACT ATTTGTTACT GTTGTTGATA CTACACGCAG TACAAATATG
1021 TCATTATGTG CTGCCATATC TACTTCAGAA ACTACATATA AAAATACTAA CTTTAAGGAG
1081 TACCTACGAC ATGGGGAGGA ATATGATTTA CAGTTTATTT TTCAACTGTG CAAAATAACC
1141 TTAACTGCAG ACATTATGAC ATACATACAT TCTATGAATT CCACTATTTT GGAGGACTGG
1201 AATTTTGGTC TACAACCTCC CCCAGGAGGC ACACTAGAAG ATACTTATAG GTTTGTAACA
1261 TCCCAGGCAA TTGCTTGTCA AAAACATACA CCTCCAGCAC CTAAAGAAGA TCCCCTTAAA
1321 AAATACACTT TTTGGGAAGT AAATTTAAAG GAAAAGTTTT CTGCAGACCT AGATCAGTTT
1381 CCTTTAGGAC GCAAATTTTT ACTACAAGCA GGATTGGAGG CCAAACCAAA ATTTACATTA
1441 GGAAAACGAA AAGCTACACC CACCACCTCA TCTACCTCTA CAACTGCTAA ACGCAAAAAA
1501 CGTAAGCTGT AA 下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。
实施例1具有序列6的截短HPV16 L1蛋白的表达 用做模板之HPV16 L1基因片段的制备 以从福建省厦门市子宫颈癌病人阴道分泌物中提取的DNA为模板，16H5521F5’-TAT AgT TCC Agg gTC TCC AC-3’(SEQ ID NO12)为正向引物，16H7190R5’-ACA ACA AAC AAC ACT AAT TCA A-3’(SEQID NO13)为反向引物，在PCR仪(Biometra，T3)按照如下条件进行PCR反应 94℃变性5min
72℃延伸10min 扩增得到特异的1.6kb左右大小的产物即为制备编码本发明中截短HPV-16L蛋白DNA片段的模板。
截短HPV16 L1基因的非融合表达载体的构建 以前一步骤所获得1.6kb大小的DNA片段用做再次PCR反应的模板。以16N30F5’-ggA TCC CAT ATg CTT CCT AgT gAg gCC ACT gTC-3’为正向引物，其5’端引入限制性内切酶BamHI和NdeI位点，NdeI位点序列为CAT ATG，ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子；16CR5′-CTC gAg TTA CAg CTT ACg TTT TTT gC-3′为反向引物，其5’端引入限制性内切酶XhoI位点。在PCR热循环仪(Biometra T3)按照如下条件进行PCR反应 94℃变性5min
72℃延伸10min 扩增得到1.5kb左右大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD18-T载体(TAKARA公司生产)连接，经BamHI/HindIII酶切鉴定，得到插入截短HPV16 L1基因的阳性克隆pMD 18-T-HPV16N30C-L1。
在上海博亚生物工程公司，利用M13(+)/(-)引物，测得pMD18-T-HPV16N30C-L1质粒中插入的目的核苷酸序列为序列8，其编码的氨基酸序列即为序列6该序列对应的蛋白质为为N端被截短30个氨基酸、C端未被截短的HPV16 L1蛋白，命名为HPV16N30C-L1。
将上述的pMD 18-T-HPV16N30C-L1质粒，经BamHI/XhoI酶切，获得截短的HPV16N30C-L1基因片段。再将该片段与经NdeI/XhoI酶切的非融合表达载体pT0-T7(罗文新等，生物工程学报，2000，1653-57)相连接，NdeI/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因的阳性表达克隆pT0-T7-HPV16N30C-L1。取1μL的pT0-T7-HPV16N30C-L1质粒(0.15mg/ml)转化40μL的氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)，涂布于卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单个菌落，挑取单菌落至含4mL卡那霉素抗性的液体LB培养基之试管，37℃220转/分振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃冻干保存。
HPV16N30C-L1的大量表达 从-70℃中取出带有重组质粒pT0-T7-HPV16-L1的大肠杆菌冻干菌种，用少量无菌水溶解，接入卡那霉素抗性的50mL LB培养基中。200rpm、37℃培养大约8小时，而后将其转接入10瓶500mL LB培养基中，每瓶接入5mL菌液，200rpm、30℃摇瓶培养过夜，作为种子液。
LB培养基配方 蛋白胨10g 酵母抽提物5g NaCl10g 将以上成分份溶解于1000mL去离子水中，用NaOH调节pH值至7.2，121℃灭菌30min，冷却至50℃。
采用上海保兴生物公司50L发酵罐进行大规模培养。校正发酵罐PH电极，配制30L LB培养基装入发酵罐，原位121℃灭菌30min，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。
补料准备配制浓度为30％(20g蛋白胨、10g酵母膏溶至100ml)的蛋白胨和酵母膏混合物，50％葡萄糖(50g溶至100ml)，121℃灭菌20min。
次日将10瓶种子液共5L接入发酵罐中，设定温度37℃，PH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。
流加补料将50％葡萄糖和30％蛋白胨和酵母膏混合物按溶质质量比2∶1的比例混合。
流加速度如下 100％为25mL/min 第一小时5％； 第二小时10％； 第三小时20％； 第四小时40％； 第五小时以后60％。
当菌浓度达到OD600nm大约10左右时将培养温度降至25℃，加入4g IPTG诱导培养4小时。终浓度大约为60左右(OD600nm)下罐，离心收集菌体，获得表达有HPV16N30C-L1蛋白的菌体重大约3kg。
实施例2纯度约70％的HPV16N30C-L1的获得 按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬菌体，采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar压力破碎菌体5次。JA-14转头13500rpm(30000g)，离心15min，留取上清，通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中HPV16N30C-L1的纯度约为10％。采用CENTRASETTE 5切向流装置(PALL产品)对上清进行透析，所用膜包截留分子量为30kDa，透析液为10mM磷酸缓冲液pH 6.0缓冲液，透析体积为三倍上清体积，运行时压力为0.5psi，流速为500mL/min，切向流速为200mL/min。透析充分后，JA-10转头(Beckman J25高速离心机)9500rpm(12000g)，20min离心收获沉淀，用1/10上清体积的10mM磷酸缓冲液pH7.5，10mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min。JA-14转头(Beckman J25高速离心机)，13500rpm(30000g)，离心20min，离心得上清，使用0.22μm孔径滤膜过滤样品，以该样品进行下一步的阳离子交换色谱纯化。取150μL过滤后样品，加入6X Loading Buffer 30μL。混匀，于80℃水浴10min后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图1。通过SDS-PAGE分析可知HPV16N30C-L1蛋白在通过沉淀、复溶的步骤之后，目的蛋白得到了纯化和富集，纯度从之前的约10％左右提高到了约70％左右。
实施例3HPV16N30C-L1的色谱纯化 HPV16N30C-L1的阳离子交换色谱纯化 仪器系统GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质SP Sepharose 4 Fast Flow。
柱体积5.5cm×20cm。
缓冲液20mM磷酸缓冲液pH7.5，10mM DTT 20mM磷酸缓冲液pH7.510mM DTT 2M NaCl。
流速25mL/min 检测器波长280nm。
样品为实施例2中10mM磷酸缓冲液pH7.5，10mM DTT，300mM NaCl重悬上清。
洗脱程序为400mM NaCl洗脱杂蛋白，500mM NaCl洗脱目的蛋白，收集500mM NaCl洗脱产物，共获得HPV16-L1纯化样品1000mL。
HPV16N30C-L1的HIC(疏水相互作用色谱)纯化 仪器系统GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质Butyl Sepharose 4 Fast Flow。
柱体积5.5cm×20cm 缓冲液10mM磷酸缓冲液pH7.5，10mM DTT，2M NaCl。
洗脱液10mM磷酸缓冲液pH7.5，10mM DTT。
流速20mL/min。
检测器波长280nm。
样品为SP Sepharose 4 Fast Flow洗脱产物。
洗脱程序为1M NaCl洗脱杂蛋白，800mM与500mmol/L NaCl浓度洗脱目的蛋白。
收集800mM与500mM NaCl浓度时的洗脱产物，获得纯化的HPV16N30C-L1样品1300mL。取800mM与500mM NaCl浓度时的洗脱产物各150μL，加入6X Loading Buffer 30u L混匀，于80℃水浴10min后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为0.5mg/ml，SDS-PAGE考染纯度大于98％。
实施例4HPV16N30C-L1类病毒颗粒的组装 仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE 5切向流系统；膜包截留分子量为30kDa；样品为实施例3所得HPV16N30C-L1 1500ml。
样品的浓缩调节系统切向流速为50mL/min，浓缩样品至总体积为800mL。
样品的复性以10L复性缓冲液(50mM PB pH 6.0，2mM CaCl2，2mMMgCl2，0.5M NaCl，0.003％Tween-80)充分交换样品缓冲液。切向流装置运行时压力为0.5psi，切向流速度为10mL/min，待复性缓冲液交换完后，改为储存缓冲液(20L PBS20mM PB pH 6.5，0.5M NaCl)进行交换，交换体积为20L。运行时压力为0.5psi，切向流速为25mL/min。待所有液体交换完毕后，使用PALL 0.20μm滤器无菌过滤样品，得到HPV16N30C-L1类病毒颗粒。
实施例5HPV16N30C-L1 VLP的形态学检测及其免疫原性测定 HPV16N30C-L1类病毒颗粒透射电镜观察 仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。HPV16N30C-L1类病毒颗粒经2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图3，可见实施例4所得样品大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。
HPV16N30C-L1类病毒颗粒动态光散射观察 仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器)，使用算法为Regulation算法。样品为实施例4所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图4。结果显示HPV16N30C-L1 VLP的水化分子动力学半径为25.86nm。
HPV16假病毒中和细胞模型的建立 由于HPV难以在体外进行培养，而且HPV宿主特异性强，难以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合适的动物模型。因此，为了能对HPV疫苗的免疫保护性进行快速评估，需要建立有效体外中和实验模型。
假病毒(pseudovirions)体外感染模型利用了HPV VLP可非特异包装核酸的特性，通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒组成HPV假病毒。(Yeager，M.D，Aste-Amezaga，M.et al(2000)Virology(278)570-7)具体方法有重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。
本发明采用的多质粒共转染方法，并且针对HPV系统采取了如下的改进建立了对293FT细胞的优化的磷酸钙转染方法，可获得高达90％以上的转染效率，有利于进行较大规模的生产。获得了密码子优化的HPV结构蛋白的表达质粒，其可在哺乳动物细胞中高效表达HPV L1和L2基因，有利于高效组装假病毒。
HPV假病毒的构建 用CsCl密度梯度离心方法分别纯化带有HPV16 L1基因的质粒p16L1h、带有HPV16L2基因的质粒p16L2h、及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP(以上质粒由NIH的John T.Schiller教授馈赠)。CsCl密度梯度离心纯化质粒的方法参照《分子克隆第三版》。简言之将质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种到500mL LB培养基中，37℃摇瓶培养16小时。9000g离心5min，收集菌体。每1000mL菌液收获的菌体，依次加入40mL溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH＝8.0))和2mL RNase A(1μg/μL)，40mL溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，48mL溶液III(5M乙酸钾60.0mL，冰乙酸11.5mL，去离子水28.5mL)。在冰上放置10min后，15000g，4℃离心20min，取上清与0.6倍体积的异丙醇混合，15000g离心30min，弃去上清，用70％乙醇洗沉淀1次，用TE溶解沉淀，测定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA对应1.01g CsCl)，再溶入100uL 10mg/mL的溴化乙锭溶液，用Beckman NVT65转子，62000rpm，20℃离心10hr。用注射器针头收集闭环DNA区带，用等体积的异戊醇重复抽提4次。加入3倍体积的水和8倍体积的无水乙醇，20000g，4℃离心30min，收集DNA沉淀。75％酒精洗涤1次，用1mL TE溶解DNA沉淀。测定DNA溶液的浓度，分装成小份储存于-20℃。
纯化后的p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP用磷酸钙方法共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。磷酸钙转染方法将p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP各40ug加入1mL的HEPES溶液(每50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes 125uL，4℃储存)和1mL的0.5mol/L CaCl2溶液的混合溶液，混合后逐滴加入2mL 2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，1.5mMNa2HPO4(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96，-70℃储存)中，室温下静置1min后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中，6hr后弃去原培养液，加入10mL完全培养液(invitrogen公司产品)。转染48hr后，弃去培养基，用PBS洗2次，将细胞刮下收集细胞，细胞计数，每108个细胞用1mL裂解液(0.25％Brij58，9.5mM MgCl2)重悬。裂解完成后，5000g离心10min，收集上清，加入5M NaCl(终浓度为850mM)，即为假病毒液，分装为小份后置于-20℃保存。
将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×104/孔)。5hr后进行中和实验，将待测的血清样品分别用10％DMEM进行连续倍比稀释，然后取50μL分别与50μL稀释于10％DMEM的上文制备的假病毒液(moi＝0.1)混合。4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养72h后先用荧光观察确定各样品大概的中和滴度，再用流式细胞仪(EPICS XL，美国Beckman Coulter公司)检测各孔细胞的感染率，计算单抗或多抗血清的准确中和滴度。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。
感染抑制率＝(1-阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100％。
抗体中和滴度的定义为达到高于50％感染抑制率的最大稀释倍数。经50倍稀释后能达到50％以上感染抑制率的单抗或多抗被视为具有中和能力。
HPV16 VLP疫苗免疫动物的免疫保护性评价 小鼠ED50检测将实施例4所制备的HPV16N30C-L1类病毒颗粒吸附于氢氧化铝佐剂上.而后使用疫苗稀释液将其稀释至0.100μg/mL，0.033μg/mL，0.011μg/mL，0.004μg/mL，以1∶3比例进行稀释成4个浓度，每组分别以1mL上述浓度腹腔注射BALB/c小鼠各10只，于注射后第四和五周分别采集血清进行HPV抗体的EIA检测和假病毒细胞中和实验法检测，最后一次采血时处死小鼠。另外设立空白组，含10只BALB/c小鼠。
EIA检测结果按照其阴性均值(若阴性均值小于0.05，以0.05来计算)+0.16作为CUTOFF值。所有BALB/c小鼠在注射前均为HPV抗体阴性。检测结果见表1。
表1EIA检测HPV16N30C-L1类病毒颗粒在BALB/c小鼠中的ED50结果
根据Reed-Muench法进行ED50的计算，疫苗注射后观察4、5周，采血检测ED50。HPV16N30C-L1类病毒颗粒4W、5W的ED50分别为0.019μg、0.011μg。因此在该剂量免疫可以产生较高的免疫抗体，其有效性显著小于0.1μg的免疫剂量。
假病毒细胞中和实验法检测结果为阴性对照的细胞发光数不小于20％，且阳性对照不发光，实验方为有效。按照细胞发光数小于阴性对照细胞发光数的50％为阳性判断阴阳性。检测结果见表2。
表2，假病毒细胞中和实验法检测HPV16N30C-L1类病毒颗粒在BALB/c小鼠中的ED50结果
根据Reed-Muench法进行ED50的计算，疫苗注射后观察4、5周，采血检测ED50。HPV16N30C-L1类病毒颗粒4W、5W的ED50分别为0.019μg、0.011μg。因此在该剂量免疫可以产生较高的免疫抗体，其有效性显著小于0.1μg的免疫剂量。
兔普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV16N30C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100ug/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。
羊普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV16N30C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为1mg/只，此后分别于4，10，18周各加强一次，加强免疫剂量为0.5mg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。
以上述假病毒中和细胞模型实验评估上述抗血清的中和效价，如图5和6所示。结果表明，本发明实施例4获得的HPV16N30C-L1类病毒颗粒混合配制成为疫苗，具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，可作为预防HPV感染的疫苗。
HPV16/18二价疫苗免疫恒河猴的免疫保护性评价 恒河猴普通级，雌性，2岁，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV16N30C-L1类病毒颗粒吸附于氢氧化铝佐剂上，类似方法制备的HPV18N65C-L1类病毒颗粒也吸附于氢氧化铝佐剂上，再将两者2∶1(重量比)混合，制成HPV16/18二价疫苗，其中每剂量(0.5ml)含有40μg的HPV16N30C-L1类病毒颗粒和20μg的HPV18N65C-L1类病毒颗粒，含有氢氧化铝0.6mg。免疫方式为上肢三角肌注射，分5μg、10μg、20μg三个HPV16剂量，每个剂量3只恒河猴，候选动物在免疫前均被确定为HPV16总IgG抗体和中和抗体呈阴性，免疫程序为0,4周。饲养9周，每周采血一次，血样于37℃放置1.5小时后，10,000rpm离心5分钟，收集血清进行HPV16和HPV18的总IgG抗体和中和抗体滴度的检测，两个型别的抗体检测方法相类似。
结果如图7和图8所示，本发明的HPV16N30C-L1类病毒颗粒可诱导恒河猴在免疫后的第9周产生高达20,000的总IgG抗体和中和抗体滴度，显示了良好的免疫原性，可作为预防HPV16感染的疫苗。同样地，如图9和图10所示，二价疫苗中的HPV18N65C-L1类病毒颗粒可诱导恒河猴在免疫后的第9周产生高达20,000的抗HPV18总IgG抗体和中和抗体滴度，显示了良好的免疫原性，亦可作为预防HPV18感染的疫苗。
上述的HPV18N65C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO9) Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr 20 25 30 His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg 35 40 45 Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala 50 55 60 Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 65 70 75 80 Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val 85 90 95 Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 100 105 110 Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser 115 120 125 Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val 130 135 140 Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro 145 150 155 160 Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro 165 170 175 Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu 180 185 190 Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser 210 215 220 Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His 245 250 255 Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu 260 265 270 Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr 275 280 285 Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe 290 295 300 Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val 305 310 315 320 Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser 325 330 335 Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln 340 345 350 Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr 355 360 365 Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp 370 375 380 Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp 385 390 395 400 Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr 405 410 415 Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro 420 425 430 Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp 435 440 445 Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg 450 455 460 Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro 465 470 475 480 Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys 485 490 495 Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys 500 HPV6/11/16/18四价疫苗免疫小鼠的免疫保护性评价 免疫动物4-5周龄SPF级BALB/c小鼠4只，按本发明实施例4所述类似方法制备HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV18N65C-L1，类病毒颗粒。将上述4种类病毒颗粒HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1按1∶2∶2∶1(重量比)的比例混合，使得混合后的上述四种类病毒颗粒的浓度为40，80，80，40μg/ml。而后再加入等体积的福氏完全佐剂与之混合均匀。加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各10μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各20μg/只。此后分别于2周加强一次，加强免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各20μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各40μg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，按实施例5所述方法分别检测免疫小鼠中针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图11所示，结果表明，由本发明实施例1-4所述方法获得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四种类病毒颗粒混合而制备的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18四价疫苗具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18的中和抗体，可作为预防HPV6/HPV11/HPV16/HPV18感染的有效疫苗(除了实施例中所采用的福氏佐剂外，该疫苗也可由本发明所制备的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四种类病毒颗粒与商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合而成)。
上述的HPV6N5C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO10) Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val 1 5 10 15 Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys 35 40 45 Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg 50 55 60 Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp 65 70 75 80 Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr 85 90 95 Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly 100 105 110 His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys 130 135 140 Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His 145 150 155 160 Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met 180 185 190 Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn 195 200 205 Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro 210 215 220 Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe 225 230 235 240 Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala 245 250 255 Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser 260 265 270 Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser 275 280 285 Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp 290 295 300 Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln 305 310 315 320 Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu 325 330 335 Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys 340 345 350 Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln 355 360 365 Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr 370 375 380 Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro 385 390 395 400 Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala 405 410 415 Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr 420 425 430 Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser 435 440 445 Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly 450 455 460 Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val 465 470 475 480 Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg 485 490 495 上述的HPV11N4C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO11) Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys 15 10 15 Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile 35 40 45 Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr 50 55 60 Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro 65 70 75 80 Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys 85 90 95 Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser 100 105 110 Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly 115 120 125 Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp 130 135 140 Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn 165 170 175 Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly 180 185 190 Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln 195 200 205 Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys 210 215 220 Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu 225 230 235 240 Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn 245 250 255 Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys 260 265 270 Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr 275 280 285 Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro 290 295 300 Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly 305 310 315 320 Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met 325 330 335 Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp 340 345 350 Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile 355 360 365 Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile 370 375 380 His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser 385 390 395 400 Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser 405 410 415 Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp 420 425 430 Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe 435 440 445 Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln 450 455 460 Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro 465 470 475 480 Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr 485 490 495 Lys Lys 上述的HPV18N65C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列显示如上(SEQ ID NO9)。
上述一系列实验结果表明，本发明实施例4获得的HPV16N30C-L1类病毒颗粒(除了实验中用到的福氏佐剂外，也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗，具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，可作为预防HPV感染的疫苗。
实施例6 依据本发明实施例1-5所采用的技术，制备具有序列1，2，3，4，5，7的截短HPV16 L1蛋白，以上截短蛋白均可组装为类病毒颗粒。
序列表
<110>厦门大学
<120>截短的人乳头瘤病毒16型L1蛋白
<130>IDC080053
<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>528
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Phe I1e Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn
1 5 10 15
Val Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala
20 25 30
Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp
35 40 45
Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg
50 55 60
Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn
65 70 75 80
Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe
85 90 95
Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser
100 105 110
Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val
115 120 125
Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro
130 135 140
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln
165 170 175
Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp
180 185 190
Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys
195 200 205
Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val
210 215 220
Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys
225 230 235 240
Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp
245 250 255
Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr
260 265 270
Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly
275 280 285
Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
290 295 300
Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly
305 310 315 320
Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu
325 330 335
Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu
340 345 350
Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys
355 360 365
Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys
370 375 380
Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
385 390 395 400
Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser
405 410 415
Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro
420 425 430
Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala
435 440 445
Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu
450 455 460
Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala
465 470 475 480
Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly
485 490 495
Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro
500 505 510
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520 525
<210>2
<211>526
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr
1 5 10 15
His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val
20 25 30
Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr
35 40 45
Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu
50 55 60
Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys
65 70 75 80
Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile
85 90 95
His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr
100 105 110
Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val
115 120 125
Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu
130 135 140
Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala
145 150 155 160
Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln
165 170 175
Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys
180 185 190
Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro
195 200 205
Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr
210 215 220
Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu
225 230 235 240
Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile
245 250 255
Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg
260 265 270
Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val
275 280 285
Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr
290 295 300
Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met
305 310 315 320
Val Thr Ser Asp Ala Gln 1le Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg
325 330 335
Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val
340 345 350
Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala
355 360 365
Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr
370 375 380
Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys
385 390 395 400
Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn
405 410 415
Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly
420 425 430
Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala
435 440 445
Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys
450 455 460
Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu
465 470 475 480
Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu
485 490 495
Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr
500 505 510
Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520 525
<210>3
<211>524
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Met Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr His Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu
20 25 30
Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala
35 40 45
Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val
50 55 60
Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu
65 70 75 80
Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu
85 90 95
Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro
100 105 110
Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg
115 120 125
Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys
130 135 140
Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys
165 170 175
Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser
180 185 190
Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu
195 200 205
Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe
210 215 220
Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro
225 230 235 240
Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met
245 250 255
Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu
260 265 270
Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp
275 280 285
Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn
290 295 300
Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr
305 310 315 320
Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln
325 330 335
Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val
340 345 350
Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser
355 360 365
Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg
370 375 380
His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile
385 390 395 400
Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr
405 410 415
Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr
420 425 430
Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln
435 440 445
Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr
450 455 460
Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln
465 470 475 480
Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys
485 490 495
Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520
<210>4
<211>522
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Met Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr His Ile Phe Phe
1 5 10 15
Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro
20 25 30
Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr
35 40 45
Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His
50 55 60
Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro
65 70 75 80
Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp
85 90 95
Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr
100 105 110
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln
115 120 125
Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp
130 135 140
Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn
145 150 155 160
Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile
165 170 175
Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys
180 185 190
Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile
195 200 205
Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala
210 215 220
Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp
225 230 235 240
Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser
245 250 255
Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met
260 265 270
Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val
275 280 285
Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala
290 295 300
Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp
305 310 315 320
Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His
325 330 335
Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp
340 345 350
Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser
355 360 365
Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu
385 390 395 400
Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu
405 410 415
Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu
420 425 430
Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His
435 440 445
Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp
450 455 460
Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro
465 470 475 480
Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys
485 490 495
Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser
500 505 510
Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520
<210>5
<211>512
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Met Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala
1 5 10 15
Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp
20 25 30
Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg
35 40 45
Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn
50 55 60
Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe
65 70 75 80
Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val
100 105 110
Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro
115 120 125
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala
130 135 140
Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln
145 150 155 160
Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp
165 170 175
Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys
180 185 190
Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val
195 200 205
Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys
210 215 220
Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr
245 250 255
Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly
260 265 270
Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
275 280 285
Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly
290 295 300
Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu
305 310 315 320
Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu
325 330 335
Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys
340 345 350
Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys
355 360 365
Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
370 375 380
Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser
385 390 395 400
Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro
405 410 415
Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala
420 425 430
Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu
435 440 445
Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala
450 455 460
Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly
465 470 475 480
Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro
485 490 495
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500 505 510
<210>6
<211>502
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser
1 5 10 15
Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr
20 25 30
His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro
35 40 45
Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly
50 55 60
Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe
65 70 75 80
Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val
85 90 95
Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val
100 105 110
Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn
115 120 125
Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile
130 135 140
Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro
145 150 155 160
Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala
165 170 175
Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile
180 185 190
Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr
195 200 205
Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser
210 215 220
Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His
245 250 255
Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu
260 265 270
Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr
275 280 285
Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe
290 295 300
Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile
305 310 315 320
Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
325 330 335
Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr
340 345 350
Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp
355 360 365
Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile
370 375 380
Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn
385 390 395 400
Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg
405 410 415
Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala
420 425 430
Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu
435 440 445
Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys
450 455 460
Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly
465 470 475 480
Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys
485 490 495
Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500
<210>7
<211>492
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Met Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala
1 5 10 15
Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val
20 25 30
Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu
35 40 45
Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu
50 55 60
Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg
85 90 95
Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys
100 105 110
Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val
115 120 125
Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys
130 135 140
Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser
145 150 155 160
Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu
165 170 175
Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe
180 185 190
Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro
195 200 205
Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met
210 215 220
Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu
225 230 235 240
Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu
245 250 255
Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn
260 265 270
Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr
275 280 285
Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln
290 295 300
Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val
305 310 315 320
Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser
325 330 335
Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg
340 345 350
His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile
355 360 365
Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr
370 375 380
Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr
385 390 395 400
Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln
405 410 415
Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr
420 425 430
Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln
435 440 445
Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys
450 455 460
Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser
465 470 475 480
Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
485 490
<210>8
<211>1512
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
catatgcttc ctagtgaggc cactgtctac ttgcctcctg tcccagtatc taaggttgta60
agcacggatg aatatgttgc acgcacaaac atatattatc atgcaggaac atccagacta 120
cttgcagttg gacatcccta ttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt 180
cctaaagtat caggattaca atacagggta tttagaatac atttacctga ccccaataag 240
tttggttttc ctgacacctc attttataat ccagatacac agcggctggt ttgggcctgt 300
gtaggtgttg aggtaggtcg tggtcagcca ttaggtgtgg gcattagtgg ccatccttta 360
ttaaataaat tggatgacac agaaaatgct agtgcttatg cagcaaatgc aggtgtggat 420
aatagagaat gtatatctat ggattacaaa caaacacaat tgtgtttaat tggttgcaaa 480
ccacctatag gggaacactg gggcaaagga tccccatgta ccaatgttgc agtaaatcca 540
ggtgattgtc caccattaga gttaataaac acagttattc aggatggtga tatggttgat 600
actggctttg gtgctatgga ctttactaca ttacaggcta acaaaagtga agttccactg 660
gatatttgta catctatttg caaatatcca gattatatta aaatggtgtc agaaccatat 720
ggcgacagct tattttttta tctacgaagg gaacaaatgt ttgttagaca tttatttaat 780
agggctggtg ctgttggtga taatgtacca gacgatttat acattaaagg ctctgggtct 840
actgcaaatt tagccagttc aaattatttt cctacaccta gtggttctat ggttacctct 900
gatgcccaaa tattcaataa accttactgg ttacaacgag cacagggcca caataatggc 960
atttgttggg gtaaccaact atttgttact gttgttgata ctacacgcag tacaaatatg 1020
tcattatgtg ctgccatatc tacttcagaa actacatata aaaatactaa ctttaaggag 1080
tacctacgac atggggagga atatgattta cagtttattt ttcaactgtg caaaataacc 1140
ttaactgcag acattatgac atacatacat tctatgaatt ccactatttt ggaggactgg 1200
aattttggtc tacaacctcc cccaggaggc acactagaag atacttatag gtttgtaaca 1260
tcccaggcaa ttgcttgtca aaaacataca cctccagcac ctaaagaaga tccccttaaa 1320
aaatacactt tttgggaagt aaatttaaag gaaaagtttt ctgcagacct agatcagttt 1380
cctttaggac gcaaattttt actacaagca ggattggagg ccaaaccaaa atttacatta 1440
ggaaaacgaa aagctacacc caccacctca tctacctcta caactgctaa acgcaaaaaa 1500
cgtaagctgt aa 1512
<210>9
<211>504
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr
20 25 30
His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg
35 40 45
Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala
50 55 60
Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe
65 70 75 80
Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val
85 90 95
Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val
100 105 110
Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser
115 120 125
Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val
130 135 140
Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu
180 185 190
Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser
195 200 205
Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser
210 215 220
Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His
245 250 255
Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu
260 265 270
Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr
275 280 285
Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe
290 295 300
Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val
305 310 315 320
Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
325 330 335
Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln
340 345 350
Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr
355 360 365
Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp
370 375 380
Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp
385 390 395 400
Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr
405 410 415
Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro
420 425 430
Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp
435 440 445
Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg
450 455 460
Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro
465 470 475 480
Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys
485 490 495
Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys
500
<210>10
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val
1 5 10 15
Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala
20 25 30
Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys
35 40 45
Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg
50 55 60
Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp
65 70 75 80
Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr
85 90 95
Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly
100 105 110
His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys
130 135 140
Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His
145 150 155 160
Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp
165 170 175
Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met
180 185 190
Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn
195 200 205
Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro
210 215 220
Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe
225 230 235 240
Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala
245 250 255
Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser
260 265 270
Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser
275 280 285
Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp
290 295 300
Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln
305 310 315 320
Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu
325 330 335
Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys
340 345 350
Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
355 360 365
Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr
370 375 380
Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro
385 390 395 400
Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala
405 410 415
Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr
420 425 430
Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser
435 440 445
Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly
450 455 460
Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val
465 470 475 480
Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg
485 490 495
<210>11
<211>498
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile
35 40 45
Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr
50 55 60
Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro
65 70 75 80
Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys
85 90 95
Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser
100 105 110
Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly
115 120 125
Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp
130 135 140
Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly
145 150 155 160
Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn
165 170 175
Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly
180 185 190
Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln
195 200 205
Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys
210 215 220
Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu
225 230 235 240
Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn
245 250 255
Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys
260 265 270
Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr
275 280 285
Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro
290 295 300
Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly
305 310 315 320
Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met
325 330 335
Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp
340 345 350
Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile
355 360 365
Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile
370 375 380
His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser
385 390 395 400
Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser
405 410 415
Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp
420 425 430
Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe
435 440 445
Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln
450 455 460
Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro
465 470 475 480
Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr
485 490 495
Lys Lys
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tatagttcca gggtctccac 20
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
acaacaaaca acactaattc aa 2权利要求
1.N端截短了4、6、8、10、20、30、或40个氨基酸的HPV16L1蛋白。
2.权利要求1的蛋白，其具有序列1、2、3、4、5、6、或7，优选序列6。
3.编码权利要求1-2任一项的蛋白的多核苷酸。
4.包含权利要求3的多核苷酸的载体。
5.包含权利要求4的载体的细胞。
6.包含权利要求1或2的蛋白的组合物。
7.一种HPV16类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1或2的蛋白或者由权利要求1或2的蛋白形成。
8.一种制备HPV L1蛋白例如权利要求1或2的蛋白的方法，其包括
a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPV L1的HPV L1基因，
b)将表达了HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，
c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，
d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。
9.一种用于预防宫颈癌的疫苗，其包括(1)权利要求7的HPV16类病毒颗粒，(2)可有可无的至少一种(例如2、3、4种)选自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58型别的HPV类病毒颗粒(例如HPV L1类病毒颗粒)，及(3)疫苗用赋形剂或载体；
优选地，所述疫苗含有HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒，特别是，含有具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质的HPV16类病毒颗粒和含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白质的HPV18类病毒颗粒，更优选还含有HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒，特别是含有具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白质的HPV6类病毒颗粒和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质的HPV11类病毒颗粒。
10.权利要求1-2任一项的蛋白或权利要求7的类病毒颗粒在制备用于预防宫颈癌的疫苗中的用途。
11.一种预防宫颈癌的方法，其包括将含预防有效量的权利要求1-2任一项的HPV16 L1蛋白或权利要求7的类病毒颗粒的疫苗或预防有效量的权利要求9的疫苗给予需要预防宫颈癌的人。
12.获得HPV16 L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括
e)将纯度至少50％的权利要求1或2的HPV16 L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，
f)将e)步骤中得到的HPV16 L1蛋白去除还原剂。
13.制备用于预防宫颈癌疫苗的方法，其包括将权利要求7的类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混和。
全文摘要
本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒16型L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒，含该类病毒颗粒的疫苗及其在预防宫颈癌中的用途。
文档编号C12N5/10GK101293918SQ20081009381
公开日2008年10月29日 申请日期2008年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者颖 顾, 李少伟, 魏闵希, 鲜阳凌, 罗文新, 夏宁邵 申请人:北京万泰生物药业股份有限公司, 厦门大学