专利名称：一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及筛选方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离 及筛选方法。
背景技术：
兰科是世界上开花植物中最大的科，全世界约有800属，25000种。由于兰科植物具有 较高的药用价值或观赏价值受到广泛关注以及大量采挖，加上近年来兰科的许多生境受到人 为破坏，许多种已经到了濒危状态。目前全世界所有的野生兰花种类都已经列入了濒危野生 动植物国际贸易公约(Convention On International Trade in Endangered Species of Wild Fauna andFlom， CITES)。为了达到保护的目的，在拯救和保护珍稀濒危野生物种的同时，还要对 物种所在的整个生态系统进行研究，做到有效的保护。兰科植物是典型的与真菌共生才能够 在自然界生长的植物，研究共生真菌是保护兰科植物的一个重要内容。
兰科植物的种子被称为"灰尘种子"，具有以下特点种子细小，种子的宽度一般在100-200 微米，最小的种子仅10微米，最大的也超不过l毫米；种子量巨大，每个蒴果内都有几万到 几十万粒种子；种子的结构简单，成熟时只有原胚阶段，没有胚乳。兰科种子的萌发非常困 难，在自然界中的萌发率极低，必须与合适的真菌共生，靠消化萌发真菌获得营养，萌发真 菌起到了启动种子萌发的作用。如果获得了萌发菌，利用互作技术可以使种子在自然条件下 萌发，获得大批量的优质种苗。与种子的无菌组织培养相比，具有明显的优势。可以说，筛 选获得萌发真菌是解决兰科植物濒危状态，实现大面积人工栽培的重要途径，而且对于野生 资源的保护也有重要意义。
由于兰科植物的种子很微小，在自然界，种子萌发初始阶段形成的原球茎或刚生长出一 片叶的小幼苗很难被发现。寻找优良的萌发真菌非常困难，犹如大海捞针。过去，依靠从植 株的根部分离内生真菌，然后与种子互作，试图找到萌发真菌。但是兰科植物往往具有以下 特点在不同的发育阶段需要与不同的真菌共生才能生长。比如腐生兰天麻在种子萌发阶 段需要与紫其小菇相互作用才能够萌发，而萌发后又必须与蜜环菌互作才能够进一步生长为
成品天麻。当然，从对真菌的依赖性来看，附生兰或地生兰没有腐生兰那么强烈，但是，实 验结果也表明，在成株根部的内生真菌中，几乎没有促进种子萌发的真菌或者促萌发作用很 微弱。而且，兰科成株根内的共生真菌种类非常多，筛选萌发菌株变得非常困难。耗费很大 的人力物力，最终很可能得不到成果。
依据兰科种子的特点，即兰科植物种子在自然界萌发，必然是依靠真菌提供营养而萌发 这一科学原理，我们设计了一套简便易行、成效好的分离萌发真菌的方法。具有研究和应用 价值。 发明内容本发明针对从兰科植物成株根内分离萌发真菌成功率低的缺点，提供一种简便的从自然 界间接分离获得兰科植物萌发真菌的方法。
本发明的目的是获得兰科植物的萌发真菌，从而解决兰科植物种子的共生萌发难题。 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案。 K兰科植物种子的播种
采集兰科植物近成熟或成熟期的果实，收集种子并装在袋中，将袋放置于适宜兰科植物 生长的环境中；制作袋的材料可以为微孔塑料膜或化纤布或棉布或尼龙网。
2、 促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及纯化
装好种子的袋子放置后，定期检査种子发育情况，发现种子萌发后，取出袋子带回；取 出袋内的种子或原球茎或幼苗材料，表面消毒处理后，将其剪切成小块或挑取单个菌丝圈接 种到分离真菌的培养基上培养，待生长出真菌菌丝后，将真菌转接到常规真菌培养基上进行 纯化；
种子或原球茎或幼苗材料的表面消毒方法为以下两种-
(1) 0.1%升汞溶液浸泡0.5-4分钟，无菌水冲洗24次；
(2) 2-5%次氯酸钠溶液浸泡1-4分钟，无菌水冲洗2-4次；
3、 兰科植物种子萌发真菌的筛选确定
采集兰科植物果实获得种子，将种子播种在经过灭菌的载体上；在装有有机物固体培养
基的容器内分别接种上述纯化的真菌，同时将播种子的载体放在上述接真菌的有机物固体培
养基表面；将培养容器置于8-27'C的环境中共培养，其中能促进兰科植物种子萌发的真菌即
为有效真菌。
兰科植物种子萌发真菌筛选用的载体可以是树叶，纸片，尼龙网，薄膜，树皮，布料，铜网。
固体培养基的有机物可以为谷类水提物，豆类水提物，麦类水提物，土壤或树皮浸提液。
如上所述的方法，真菌的分离培养基的组成按重量百分比计可以为以下3种
(1) 燕麦粉0.3%-0.6%，酵母浸膏0.05%-1.0%，葡萄糖1.5%-3.0%，麦芽浸粉0.05%-1.0%， 土壤或树皮浸提液1%-10%，琼脂粉1.0%-1.5%，青霉素0.005%-0.01%或硫酸链霉素 0.005%-0.015%;
(2) 蛋白胨0.05%-0.2%，玉米汁1%-5%，麦芽浸粉1.0%-5.0%，土壤或树皮浸提液1%-10%， 葡萄糖1.5%-3.0°/0，琼脂粉1.0%-1.5%，青霉素0.005%-0.01%或硫酸链霉素0.005%-0.015°/0;
(3) 土豆15%-30%， 土壤或树皮浸提液1%-10%,葡萄糖1%-3%，琼脂粉1.0%-1.5%， pH5.0-6.0，青霉素0.005%-0.01%或硫酸链霉素0.005%-0.015%。
图1分离得到的萌发真菌与铁皮石斛种子共生萌发的萌发状况图2分离得到的萌发真菌与白芨种子共生萌发的萌发状况 图3不加入萌发真菌对照的铁皮石斛种子发育状况
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。但本发明的内容并不仅仅局限于此。 实施例1
1、 兰科植物种子的播种
白芨种子采自贵州施秉的白芨野生抚育基地，于8月中旬蒴果近成熟期采摘，剖开蒴果 得到种子，把种子装入预先做好的薄棉布袋中，然后用线缝口，做好标记牌。把装好种子的 棉布袋放置到白芨的生长环境中。
2、 种子的收获及共生真菌的分离及纯化
装好种子的袋子放置后，定期检査种子发育情况，于第ll个月发现种子萌发，把棉布袋 收回，用流水把棉布袋上的泥土洗净，取出袋内的种子、原球茎和幼苗材料，进行表面消毒 处理，方法为0.1%升汞溶液浸泡2.5分钟，无菌水冲洗4次。
表面消毒后的材料使用两种方法分离共生真菌(1)把材料切为2-3份，接种到分离共 生真菌的培养基上培养，(2)显微镜下挑取单个菌丝圈，接种到分离共生真菌的培养基上培 养。培养条件为25-30°C，黑暗培养。接种的材料周围生长出真菌后及时转接到麦麸培养基 上进行纯化，获得纯菌株。
分离共生真菌的培养基组成以重量百分比计为燕麦粉0.6%，酵母浸膏0.05%，葡萄糖 2%，麦芽浸粉1%， 土壤浸提液5%，琼脂粉1.2%，青霉素0.005%。
3、 萌发真菌的筛选确定
将白芨种子播种在经过灭菌的布片上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接种上述 纯化的真菌，同时将播种种子的布片放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养容器 置于20-25。C的环境中共培养，光照条件为每日光照10-12小时，光照强度为2000Lx，培 养1个月以后，发现了能促进白芨种子萌发的真菌，此即为有效真菌。
有机物培养基为小麦8g/L， 土壤浸提液20g/L，琼脂llg/L。
实施例2
1、 兰科植物种子的播种
白芨种子采自贵州施秉的白芨野生抚育基地，于8月中旬蒴果近成熟期采摘，剖开蒴果 得到种子，把种子装入预先做好的化纤布袋中，然后用线缝口，做好标记牌。把装好种子的 化纤布袋放置到白芨的生长环境中。
2、 种子的收获及共生真菌的分离及纯化
装好种子的袋子放置后，定期检查种子发育情况，于第ll个月发现种子萌发，把化纤布 袋收回，用流水把化纤布袋上的泥土洗净，取出袋内的种子、原球茎和幼苗材料，进行表面 消毒处理，方法为5%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。表面消毒后的材料使用两种方法分离共生真菌(1)把材料切为2-3份，接种到分离共 生真菌的培养基上培养，(2)显微镜下挑取单个菌丝圈，接种到分离共生真菌的培养基上培 养。培养条件为25-30°C，黑暗培养。接种的材料周围生长出真菌后及时转接到PDA培养 基上进行纯化，获得纯菌株。
分离共生真菌的培养基组成以重量百分比计为土豆20%， 土壤浸提液8%，葡萄糖2%， 琼脂粉1%， pH5.2,硫酸链霉素0.01%。
3、萌发真菌的筛选确定
将白芨种子播种在经过灭菌的纸片上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接种上述 纯化的真菌，同时将播种子的布片放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养容器置 于20-25。C的环境中共培养，光照条件为每日光照10-12小时，光照强度为2000Lx，培养1 个月以后，发现了能促进白芨种子萌发的真菌，此即为有效真菌。
有机物培养基为大麦4g/L,绿豆5g/L，琼脂llg/L。
实施例3
1、 兰科植物种子的播种
山慈菇种子或称为云南独蒜兰种子采自贵州雷山国家自然保护区的野生植株上，与9月 中旬蒴果近成熟期采摘，剖开蒴果得到种子，把种子装入预先做好的微孔塑料膜袋中，然后 用线缝口，做好标记牌。把装好种子的微孔塑料膜袋放置到云南独蒜兰的适宜生长环境中。
2、 种子的收获及共生真菌的分离及纯化
装好种子的袋子放置后，定期检査种子发育情况，于第12个月发现种子萌发，把微孔塑 料膜袋收回，用流水把袋上的泥土洗净，取出袋内的种子、原球茎和幼苗材料，进行表面消 毒处理，方法为3%的次氯酸钠溶液中消毒3.5分钟，然后用无菌水冲洗4次。
表面消毒后的材料使用两种方法分离共生真菌(1)把材料切为2-3份，接种到分离共 生真菌的培养基上培养，(2)显微镜下挑取单个菌丝圈，接种到分离共生真菌的培养基上培 养。培养条件为25-30'C,黑暗培养。接种的材料周围生长出真菌后及时转接到PDA培养 基中进行纯化，获得纯菌株。
分离共生真菌的培养基组成以重量百分比计为燕麦粉0.35%，酵母浸膏0.08%，葡萄 糖2.5%,麦芽浸粉0.2%, 土壤浸提液2%,琼脂粉1.2%，硫酸链霉素0.013%。
3、 萌发真菌的筛选确定
将云南独蒜兰种子播种在经过灭菌的树叶上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接 种上述纯化的真菌，同时将播种子的树叶放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养 容器置于15-2(TC的环境中共培养，光照条件为每日光照10-12小时，光照强度为2000Lx， 培养4个月后，发现了能促进云南独蒜兰种子萌发的真菌，此即为有效真菌。
有机物培养基为谷子3g/L， 土壤浸提液20g/L，琼脂llg/L。
实施例41、 兰科植物种子的播种
鼓槌石斛种子采自云南西双版纳的鼓槌石斛野生抚育基地，于12月下旬蒴果颜色由绿稍 微转黄时采摘，剖开蒴果得到种子，把种子装入预先做好的尼龙网袋中，然后用线缝口，做 好标记牌。把装好种子的尼龙网袋放置到鼓槌石斛的抚育环境中。
2、 种子的收获及共生真菌的分离及纯化
种子播种到生境中以后，于第8个月观察，发现部分种子已经萌发，因此采收尼龙网袋， 做共生真菌的分离工作。用流水把尼龙网袋上的泥土洗净，取出袋内的种子、原球茎和幼苗 材料，进行表面消毒处理，方法为5%的次氯酸钠溶液中消毒3分钟，然后用无菌水冲洗4 次。
表面消毒后的材料使用两种方法分离共生真菌(1)把材料切为2-3份，接种到分离共
生真菌的培养基上培养，(2)显微镜下挑取单个菌丝圈，接种到分离共生真菌的培养基上培 养。培养条件为25-30°C，黑暗培养。接种的材料周围生长出真菌后及时转接到PDA培养 基中进行纯化，获得纯菌株。
分离共生真菌的培养基组成以重量百分比计为蛋白胨0.1%，玉米汁2%，麦芽浸粉3%， 树皮浸提液3%，葡萄糖2%，琼脂粉1.3%，青霉素0.008%。
3、 萌发真菌的筛选确定
将鼓槌石斛种子播种在经过灭菌的滤纸上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接种 上述纯化的真菌，同时将播种子的滤纸放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养容 器置于15-2(TC的环境中共培养，光照条件为每日光照10-12小时，光照强度为2000Lx， 培养2个月后，发现了能促进鼓槌石斛种子萌发的真菌，此即为有效真菌。
有机物培养基为大麦4g/L，绿豆5g/L，树皮浸提液20g/L，琼脂llg/L。
权利要求
1、一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及筛选方法，包括步骤(1)兰科植物种子的播种采集兰科植物近成熟或成熟期的果实，收集种子并装在袋中，将袋放置于适宜兰科植物生长的环境中；制作袋的材料可以为微孔塑料膜或化纤布或棉布或尼龙网；(2)促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及纯化装好种子的袋子放置后，定期检查种子发育情况，发现种子萌发后，取出袋子带回；取出袋内的种子或原球茎或幼苗材料，表面消毒处理后，将其剪切成小块或挑取单个菌丝圈接种到分离真菌的培养基上培养，待生长出真菌菌丝后，将真菌转接到常规真菌培养基上进行纯化；(3)兰科植物种子萌发真菌的筛选采集兰科植物果实获得种子，将种子播种在经过灭菌的载体上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接种上述纯化的真菌，同时将播种子的载体放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养容器置于8-27℃的环境中共培养，其中能促进兰科植物种子萌发的真菌即为有效真菌。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于种子或原球茎或幼苗材料的表面消毒方法为以 下两种(1) 0.1%升汞溶液浸泡0.5-4分钟，无菌水冲洗2-4次； (2) 2-5%次氯酸钠溶液浸泡1-4分钟，无菌水冲洗2-4次。
3、 如权利要求1所述的方法，其特征在于真菌的分离培养基的组成按重量百分比计可以 为以下3种(1) 燕麦粉0.3%-0.6%，酵母浸膏0.05%-1.0%，葡萄糖1.5%-3.0%，麦芽浸粉0.05%-1.0%， 土壤或树皮浸提液1°/。-10%，琼脂粉1.0%-1.5%，青霉素0.005%-0.01%或硫酸链霉素 0.005%-0.015%;(2) 蛋白胨0.05%-0.2%，玉米汁1%-5%，麦芽浸粉1.0%-5.0%,土壤或树皮浸提液1%-10%， 葡萄糖1.5%-3.0%，琼脂粉1.0%-1.5%，青霉素0.005%-0.01%或硫酸链霉素0.005%-0.0150/0;(3) 土豆15%-30%， 土壤或树皮浸提液1%-10%，葡萄糖1%-3%，琼脂粉1.0%-1.5%， pH5.0-6.0，青霉素0.005%-0.010/0或硫酸链霉素0.005%-0.015%。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于兰科植物种子萌发真菌筛选用的载体可以是 树叶或纸片或尼龙网或薄膜或树皮或布料或铜网。
5、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，兰科植物种子萌发真菌筛选用固体培养基的 有机物可以为谷类水提物或豆类水提物或麦类水提物或土壤或树皮浸提液。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域的一种方法，特别是公开了一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及筛选方法。主要是将种子放置到适宜兰科植物生长的环境中，种子萌发后，取回种子、原球茎和幼苗，表面消毒后，把上述材料切为小块或挑取单个菌丝团放到分离共生真菌的培养基上，获得纯化的菌株，使用筛选体系筛选出促进兰科植物种子萌发的有效真菌。本方法简便易行，材料易于回收，种子共生萌发真菌分离效果好，筛选工作量小。
文档编号C12N1/14GK101565677SQ20081009395
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者孟志霞, 房慧勇, 卉 王, 肖培根, 郭顺星, 陈晓梅 申请人:中国医学科学院药用植物研究所