专利名称：：山羊FAK基因cDNA编码区核苷酸序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从山羊睾丸细胞分离的编码FAK蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码FAK蛋白质的cDNA编码区418bp的核苷酸序列和与它的前417bp对应的氨基酸序列。
背景技术：
：细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它剌激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。黏附斑激酶FAK是非受体酪氨酸家族的一员，分子量125KD,在多数细胞中都有表达。具有调节细胞增殖、迁移、浸润、凋亡、死亡和血管生成的功能。生长因子和细胞黏附能够引起FAK(Tyr397)的磷酸化，然后导致其它氨基酸残基的磷酸化，包括Tyr407，Tyr576，Tyr577,Tyr925等，最后是Tyr861变的高度磷酸化。FAK不同部位的酪氨酸磷酸化对形成信号复合体的作用不同，可以引起不同的生物学效果。研究表明，在未激活的FAK分子内，氨基端和羧基端结构域相连接，掩蔽了激酶结构域。Tyr397磷酸化后,FAK发生构象改变,使激酶结构域处于活化状态。活化的FAK进而通过下游的与信号转导有关的多种分子，激活多条信号转导通路。因此，FAK被认为是整合素依赖性信号转导通路的基础分子,在整合素介导的信号转导途径中起着关键作用"迄今，关于FAK在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究己在牛、人、大鼠、小鼠和黑猩猩等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见山羊细胞中FAK的研究报道，也未见有山羊FAK基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊FAK蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚山羊的FAK基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组FAK蛋白制备的抗体可以检测FAK基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况
发明内容本发明人已经努力从山羊的不同组织细胞中分离FAK基因。作为结果，本发明人从山羊睾丸组织细胞分离了FAK基因的cDNA编码区418bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它的前417bp推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对己知的牛、人、大鼠和小鼠的FAK基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛的FAK基因(BC120297)cDNA编码区的序列，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增山羊FAK基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了山羊FAK基因的cDNA编码区418bp片段，序列分析表明与牛的序列(BC120297)同源性为99%(416/418)，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有1个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为"gFAK"。所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的FAK的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克隆山羊FAK基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊FAK蛋白的基因的cDNA的编码区418bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。附图的简要说明从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中图1显示了牛FAK基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号BC120297)。图2显示了417bp的山羊FAK基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQIDNO:1)和由此推断的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图3是显示从山羊睾丸组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(418bp的cDNAgFAK)的电泳图。图4是显示以质粒pMD19-T-gFAK为模板，以Pl、P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。图5是显示将质粒pMD19-T-gFAK进行酶切鉴定的电泳图。图6显示了山羊FAK基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(BC120297)的FAK基因cDNA的序列的比较。具体实施方式为了从山羊组织细胞中分离FAK基因，本发明人首先按照提取RNA的标准要求采集内蒙古白绒山羊(InnerMongoliaCashmereGoat，A/rci/s)的各类组织样本。即，现场宰杀内蒙古白絨山羊后立即采取肌肉、肝、肾、淋巴结、脾及睾丸等组织块(将组织块大小控制在3050ug),放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80'C冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRaRNAisoReagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织、睾丸组织、肾组织、肝组织、淋巴结组织及脾脏组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物FAK基因在各类组织中的表达情况和总RNA提取结果，选定以睾丸组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gFAK。为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gFAK，将其转化fDH5a感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gFAK转化了的&oh'DH5a细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37'C培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白色菌落为获得的重组菌落。重组菌落和重组质粒pMD19-T-gFAK的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行单酶切和五co及I/i/z7rara双酶切鉴定。经过了PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒PMD19-T-gFAK。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-gFAK的fco//DH5a液体培养的样品送宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了418bp的山羊FAK基因cDNA编码区的核苷酸序列。显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出山羊的FAK基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的羊FAK基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测FAK基因的组织表达特异性，也可进一步实现羊FAK基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的FAK蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的FAK基因的表达情况等等。在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。实施例l:山羊FAK基因的cDNA编码区418bp片段的克隆为了克隆来自山羊睾丸组织细胞的FAK基因包含418bp编码区的cDNA，根据图1公开的核苷酸序列(BC120297)，首先制备允许扩增418bp的cDNA的PCR引物，即上游引物Pl:5'CTTGACCCAAACTTGAATCAC3':下游引物P2:5'TCAAAGTTGGCTTGTCTTCAG3'。为了利用RT-PCR方法克隆FAK基因的cDNA，从山羊睾丸组织分离总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRaRNAisoReagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊睾丸组织总RNA,进行电泳检测和紫外测定RM浓度后置于-80'C冰箱保存备用。然后，禾拥TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。以上面得到的cDNA第一链为模板，Pl、P2为引物，利用TaKaRaLATaqDNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系如表l,反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物10ul进行0.7免琼脂糖凝胶电泳(0.5%TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5Mg/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了418bp的特异性目的片段(参见图3。为了将获得的418bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19-T克隆载体上,首先将电泳分离的418bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段，紫外测定浓度后按照pMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-gFAK，将其转化feo7/DH5a感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gFAK转化了的fcoh'DH5a细胞涂在含有氨苄青霉素和X-gal的选择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37'C培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白色的重组菌落。表4-2-7FAK基因PCR反应体系Table4-2-7FAKgenePCRsystem<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白色的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物Pl,、P2进行PCR鉴定。对阳性的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行化琼脂糖凝胶电泳(0.5%TAE,电压8v/cra,1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以P1、P2为引物，反应体系如表l，反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物10nl进行0.7%琼脂糖凝胶电泳(0.5%TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5化/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了418bp的特异性目的片段(参见图4)。酶切鉴定采用TaKaRafcaI单酶切和￡coiI////m/III双酶切，作为结果，质粒的单酶切得到了与预期结果大小相符的片段(参见图5)。经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌落样品lml送往宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了山羊FAK基因的cDNA编码区418bp片段的克隆。实施例2:山羊FAK基因的cDNA的核苷酸序列图2显示了实施例1中获得的418bp的cDNA克隆的前417bp的核苷酸序列(SEQIDNO:1),和由此推断的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。在图2中，显示的序列是FAK基因的核苷酸序列，它包括了cDNA编码区的417bp的核苷酸序列和由此编码形成推断的分子量15.3KDa的成熟蛋白质的139个氨基酸。图6显示了山羊FAK基因cDNA的核苷酸序列与牛(BC120297)的FAK基因cDNA的核苷酸序列的比较。表明1)山羊FAK基因cDNA的核苷酸序列与牛的FAK基因cDNA的核苷酸序列有99%的同源性。由山羊的这段核苷酸序列的前417bp推导出的氨基酸序列与牛的FAK蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(AAI20298)有l个氨基酸的差别，同源性99%(138/139)。正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆山羊FAK基因cDNA编码区的引物和编码山羊的FAK蛋白质的包括418bp的cDNA的核苷酸序列和由它的前417bp推断的氨基酸序列。此cDNA包括的417bp的核苷酸序列，它编码含有139个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的FAK蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的FAK基因的表达情况等等。1.山羊FAKcDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述。2.由cDNA编码区的核苷酸序列推断出的山羊FAK蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所述。山羊FAK基因cDNA编码区核苷酸序列.ST25SEQUENCELISTING〈110〉<120>山羊FAK基闲cDNA编码区核苷酸序列〈130>genesequence<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>417<212>靈<213>Caprahircus<220><221>CDS<222>(l)..(417)<400>1cttgacccaaacttg犯tcacacgc:gagtteaagtaccaagactcacLeuAspProAsnLeuAsnHisThrProSerSerSerThrLysThrHis151015ctgggaactggtgtggagcgttctcctgggaccatggagcgagtattaLeuGlyThrGlyValGluArgSerProGlyThrMetGluArgValLeu202530aaggtcUtcattattttgaaageaacagtgagccaaccacttgggccLysValPheHisTyrPheGluSerAsnSerGluProThrThrTrpAla354045agtattateaggcatggagatgcaaccgacgtcaggggcateattcagSerlielieArgHisGlyAspAlaThrAspValArgGlylielieGin5055604896144192aagatagtggacagtcacaaagtaaagcacgtggcctgctatggattt240LyslieValAspSerHisLysValLysHisValAlaCysTyrGlyPhe65707580cgcctgagtcacctgeggteagaggaggttcactggetccatttggat288ArgLeuSerHisLeuArgSerGluGluValHisTrpLeuHisLeuAsp859095atgggtgtctecaatgtgagggagaagtatgaacttgcccacccacca336MetGlyValSerAsnValArgGluLysTyrGluLeuAlaHisProPro100105110gaggagtggaaatatgaattgagaattcgttatttgccaa肌ggaUt384GluGluTrpLysTyrGluI^uArglieArgTyrLeuProLysGlyPhe115120125etaaaccagtttactgaagacaagccaactttg417LeuAsnGinPheThrGluAspLysProThrLeu130135<210>2<211>139<212>PRT<213>Capr已hircus<400〉2LeuAspProAsnLeuAsnHisThrProSerSerSerThrLysThrHis151015LeuGlyThrGlyValGluArgSerProGlyThrMetGluArgValLeu202530钢军干志东日i刘，旭，山羊FAK基因cDNA编码区核苷酸序列.ST25LysValPheHisTyrPheGluSerAsnSerGluProThrThrTrpAla354045SerlielieArgHisGlyAspAlaThrAspValArgGlylielieGin505560LyslieValAspSerHisLysValLysHisValAlaCysTyrGlyPhe65707580ArgLeuSerHisLeuArgSerGluGluValHisTrpLeuHisLeuAsp859095MetGlyValSerAsnValArgGluLysTyrGluLeuAlaHisProPro100105110GluGluTrpLysTyrGluLeuArglieArgTyrLeuProLysGlyPhe115120LeuAsnGinPheThrGluAspLysProThrLeu13013512权利要求本发明涉及一段从山羊睾丸细胞分离的编码FAK蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码FAK蛋白质的cDNA编码区核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。目前应用RT-PCR方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列是获得基因(cDNA)核苷酸序列的常用方法。本项发明设计了一对引物并应用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了山羊FAK基因cDNA的编码区特异性片段，经过测序后得到这一片段的418bp的核苷酸序列，其特征是在还没有羊FAK基因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的牛、人、大鼠、小鼠的FAK基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛FAK基因cDNA序列(BC120297)设计PCR引物，进而通过RT-PCR方法扩增出了山羊FAK基因cDNA的编码区片段，测序后得到了418bp的核苷酸序列和与它的前417bp对应的氨基酸序列，这一山羊FAK基因cDNA编码区片段的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列在国内外是首次获得。基于上述说明的本发明的技术特征，本发明的独立权利要求表述为一种自山羊分离的多核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序列之一1)序列表中SEQIDNO1的cDNA序列；2)与序列表中SEQIDNO1的cDNA序列对应的标注为SEQIDNO2的氨基酸序列。全文摘要本发明涉及从山羊睾丸细胞分离的编码FAK蛋白的cDNA的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明通过比对已知的牛、人、大鼠、小鼠的FAK基因cDNA的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛FAK基因cDNA序列(GenBank登录号BC120297)设计出了一对用于RT-PCR扩增羊FAK基因cDNA编码区片段的引物并用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了特异性片段，测序后得到了羊FAK基因cDNA的编码区的418bp的核苷酸序列和与它的前417bp对应的氨基酸序列。获得的这418bp的核苷酸序列可进一步用于羊FAK基因全长cDNA的克隆及用于通过RT-PCR或杂交的方法检测FAK基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测FAK的抗体。文档编号C12N9/12GK101565711SQ20081009399公开日2009年10月28日申请日期2008年4月25日优先权日2008年4月25日发明者刘东军,旭日干,王志钢申请人:王志钢;刘东军;旭日干