专利名称：植物根生长发育相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物根生长发育相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个 来源于拟南芥的植物根生长发育相关蛋白及其编码基因与它们在植物生长发育中的 应用。
背景技术：
作为高等生物，植物与动物的最大的区别在于植物必须固着生长，这种生长的固 定以及营养物质的汲取必须强烈地依赖于植物根系的生长。所以根系的生长发育对于 植物整体的良好生长起着至关重要的作用。不论是单子叶植物还是双子叶植物，虽然 根系的结构和形态有所不同，但是成熟的根都是由根冠区、分生区、伸长区和成熟区 四部分组成，其中每部分都执行着不同的功能。根冠由中央根冠细胞和侧面根冠细胞 组成，随着根尖的不断生长，根冠最前端的细胞脱落从而对根尖起到了保护的作用； 同时中央根冠细胞内含有大量的淀粉粒，起到感受重力的作用，从而使植物的根产生 向地性的生长。分生区是由处于分裂期的细胞组成，正是这些细胞的不断分裂，使得 细胞的数目增加，根不断的生长。伸长区是由介于分裂状态和分化状态之间的细胞组 成，是二者之间的过渡阶段。成熟区由高度分化的细胞组成，这些分化成熟的细胞大 小形态不再变化，各自执行不同的功能。
拟南芥根分生组织中被称为原始细胞的干细胞通过立体的分裂产生了每层细胞 层中各种类型的细胞，这些细胞组成了一个无性繁殖的细胞系。原始细胞经过一次分 裂产生的两个子细胞中的一个仍保持着原始性，而另外一个细胞成为transit-amplifying cell (TA cell),这个细胞经过很多次的分裂后，分化形成自身的特性。围绕在原始细胞 中央的静止中心(QC)的细胞很少分裂，和周围的干细胞组成了根分生组织的干细胞生 境(stem cell niche)， QC是这个niche的组织中心。QC通过和周围干细胞的信号交流， 抑制其分化，保持干细胞的原始性，目前对于这些信号分子本质的了解甚少，但是从 根分生组织与芽分生组织的对比中发现，根的原始细胞类似于芽分生组织的干细胞， 而QC类似于表达WUS的OC细胞。
在调控拟南芥根生长发育的一些突变体及其基因的研究中，发现CLV类似的信 号传导途径也参与了根干细胞的调控，以及其他一些突变体的分离鉴定，如其中WoW roo^/^)和scwecrow(^r)突变体都表现为根短，并且这两个位点的突变都导致了根在表皮和内皮层之间少了一层细胞，SHR和SCR同时表达对于维持QC的特性是必须的。 另外，PLT基因对于根干细胞生境的确立也是必须的。并且PLT和SHR/SCR在参与 调控根分生组织干细胞的形成中是两条并行的途径，共同调控了从胚胎时期胚根到苗 期成熟根的分生组织的形成和发育。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物根生长发育相关蛋白及其编码基因与应用。 本发明所提供的植物根生长发育相关蛋白，名称为ARD1，来源于拟南芥 (Arabidopsisthaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质
(a) 由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b) 将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有根生长发育调控功能的由(a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列3由500个氨基酸残基组成。
上述植物根生长发育相关蛋白的编码基因"/ D7 )也属于本发明的保护范围。 上述植物根生长发育相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中序列1的DNA序列；
2) 编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；
3) 在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列1是由1925个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5'端第
268-1770位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基 序列的蛋白质。
上述植物根生长发育相关蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中序列2的DNA序列；
2) 编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；
3) 在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列2是由4881个核苷酸组成，自5'端第262-506位核苷酸为该
基因组基因的第一个外显子，自5'端第507-748位核苷酸为该基因组基因的第一个内 含子，自5'端第749-820位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5'端第821-916 位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子，自5'端第917-1093位核苷酸为该基因组基 因的第三个外显子，自5'端第1094-1178位核苷酸为该基因组基因的第三个内含子， 自5'端第1179-1248位核苷酸为该基因组基因的第四个外显子，自5'端第1249-1541 位核苷酸为该基因组基因的第四个内含子，自5'端第1542-1829位核苷酸为该基因组
4基因的第五个外显子，自5'端第1830-1937位核苷酸为该基因组基因的第五个内含子， 自5'端第1938-2078位核苷酸为该基因组基因的第六个个外显子，自5端第2079-2157 位核苷酸为该基因组基因的第六个内含子，自5'端第2158-2260位核苷酸为该基因组 基因的第七个外显子，自5'端第2261-2352位核苷酸为该基因组基因的第七个内含子， 自5'端第2353-2499位核苷酸为该基因组基因的第八个外显子，自5'端第2500-3085位 核苷酸为该基因组基因的第八个内含子，自5'端第3086-3132位核苷酸为该基因组基 因的第九个外显子，自5'端第3133-3219位核苷酸为该基因组基因的第九个内含子，自 5'端第3220-3273位核苷酸为该基因组基因的第十个外显子，自5'端第3274-3345位核 苷酸为该基因组基因的第十个内含子，自5'端第3346-3464位核苷酸为该基因组基因 的第十一个外显子，自5'端第3465-3552位核苷酸为该基因组基因的第十一个内含子， 自5'端第3553-3688位核苷酸为该基因组基因的第十二个外显子，自5'端第3689-3766 位核苷酸为该基因组基因的第十二个内含子，自5'端第3767-4092位核苷酸为该基因 组基因的第十三个外显子。
上述高严谨条件可为在0.1xSSPE(或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下 杂交并洗膜。
含有上述植物根生长发育相关蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及 宿主菌均属于本发明的保护范围。
利用植物表达载体，将本发明的植物根生长发育相关蛋白的编码基因C4/ D/)导 入植物细胞或组织，可得到根发育增强的植物。
使用乂7 D7构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型 启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所 用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤 光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。 从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明^^^的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞 或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、 小麦等单子叶植物，也可以是番茄、拟南芥、烟草、棉花等双子叶植物。
本发明的植物根生长发育相关蛋白及其编码基因可促进植物根的生长发育，对促 进植物根系生长，提高植物产量，在植物(特别是农作物)品种的改良中发挥巨大作 用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为正常野生型植物与"M7突变体根的生长情况
图2为Ji Z)/基因的图位克隆示意图
图3为转^ Z)/基因的突变体的生长状况照片
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均 由上海生工生物工程有限公司完成。
实施例1、本发明的来源于拟南芥的与根发育相关基因的获得及其功能验
证
一、 拟南芥J^/突变体的获得
通过对一个拟南芥(Col-0) T-DNA突变体库的筛选，得到一个在根生长发育缺 陷的突变体，命名为J/ D/，该突变体的表型主要为根生长缓慢，根系不发达，主 根变短，主根仅为野生型的1/3左右，如图1所示。图1中WT为野生型拟南芥(Col-0 生态型)；^ D7为上述筛选得到的v4/ D7突变体。
二、 用图位克隆法获得来自突变体」及D/的与根发育相关基因Ji D7 采用图位克隆法从上述获得的JW)/突变体中分离与根发育相关基因J^/，具
体方法包括以下步骤
1) 以v4i D7突变体(Col-0背景)与Ler(拟南芥的另外一个生态型，购自Arabidopsis Biological Resource Center)杂交所获得的F2代分离群体为材料，从中鉴定到了2100个 具有与上述Ji DJ突变体表型相同的个体进行遗传学分析，把^i D/基因定位到拟南 芥第1号染色体的一个BAC克隆(T6D22)上，与标记F21M12的物理距离约为550Kb， 如图2所示。图2中，箭头所示是附近相邻的BAC克隆。
2) 利用图位克隆的方法进一步縮小目的基因的范围，最后，根据公布的拟南芥 基因组序列，利用PCR方法扩增目的基因范围的候选基因，经过序列比对。最终确定 突变位点所在的基因。该基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为^ D/。 序列表中序列2是由4881个核苷酸组成，自5'端第262-506位核苷酸为该基因组基因 的第一个外显子，自5'端第507-748位核苷酸为该基因组基因的第一个内含子，自5' 端第749-820位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5'端第821-916位核苷酸 为该基因组基因的第二个内含子，自5'端第917-1093位核苷酸为该基因组基因的第三 个外显子，自5'端第1094-1178位核苷酸为该基因组基因的第三个内含子，自5'端第 1179-1248位核苷酸为该基因组基因的第四个外显子，自5'端第1249-1541位核苷酸为 该基因组基因的第四个内含子，自5'端第1542-1829位核苷酸为该基因组基因的第五个外显子，自5'端第1830-1937位核苷酸为该基因组基因的第五个内含子，自5'端第 1938-2078位核苷酸为该基因组基因的第六个个外显子，自5'端第2079-2157位核苷酸 为该基因组基因的第六个内含子，自5'端第2158-2260位核苷酸为该基因组基因的第 七个外显子，自5'端第2261-2352位核苷酸为该基因组基因的第七个内含子，自5'端第 2353-2499位核苷酸为该基因组基因的第八个外显子，自5'端第2500-3085位核苷酸为 该基因组基因的第八个内含子，自5'端第3086-3132位核苷酸为该基因组基因的第九 个外显子，自5'端第3133-3219位核苷酸为该基因组基因的第九个内含子，自5'端第 3220-3273位核苷酸为该基因组基因的第十个外显子，自5'端第3274-3345位核苷酸为 该基因组基因的第十个内含子，自5'端第3346-3464位核苷酸为该基因组基因的第十 一个外显子，自5'端第3465-3552位核苷酸为该基因组基因的第十一个内含子，自5' 端第3553-3688位核苷酸为该基因组基因的第十二个外显子，自5'端第3689-3766位核 苷酸为该基因组基因的第十二个内含子，自5'端第3767-4092位核苷酸为该基因组基 因的第十三个外显子。其cDNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序 列1的5'端第268-1770位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3 的氨基酸残基序列的蛋白质(ARD1)。
三、本发明的来源于拟南芥的与根发育相关基因^i i)7的转基因功能验证 根据步骤一获得的ARD1的基因组序列及载体pCAMBIA1300，将ARD1基因连 接入载体pCAMBIA1300多克隆位点的Smal禾B Sal I酶切位点之间得到的重组载体， 设计扩增乂肌/序列的引物，引物序列如下所示
弓l物1 (上游引物)5，-CCCGGGGTGAAGAACAAAATATTACA-3，(划线部分核苷酸为S脂 I识别位点)；
弓l物2 (下游引物)5，-GGTACCATGGCAAAATAACCTTGAGG-3，(划线部分核苷酸为 A:戶I识别位点)。
提取拟南芥品种Col-0的基因组DNA作为模板，在引物1和引物2的引导下进行 PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行1X琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化4881bp 的DNA片段，即」^/基因组片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的核苷 酸序列。
将上述获得的j/^7基因片段用限制性内切酶^"和A^wl进行双酶切后与经相 同酶酶切的载体pCAMBIA1300连接，将连接产物进行测序，将经测序表明正确的重 组载体命名为pCAMBIA1300- ARD1 。
将卩0八]^81八1300-ARD1在根癌农杆菌的介导下转化ARD1突变体 SALK_009847 (购自Arabid叩sis Biological Resource Center, ABRC)，然后用选择性标
7记基因潮霉素(在含50mg/L潮霉素MS培养基)进行抗性筛选，筛选得到在含50mg/L 潮霉素的培养基上能够生长的转？0八,仏1300-ARDl植株。用上述引物1和引物2 对抗性筛选得到的转pCAMBIA1300- ARDl植株进行PCR分子鉴定，得到PCR鉴定 表明正确的转入^ Z)/基因片段的转pCAMBIA1300- ARDl植株。
对PCR鉴定表明正确的转入乂i DJ基因片段的转？。八^181八1300-ARDl植株， 进表型分析，即将ARDl突变体SALK_009847 (购自Arabidopsis Biological Resource Center)(图3中的ARD1)和PCR鉴定表明正确的转入^ D/基因片段的转 pCAMBIA1300- ARDl植株(图3中的pCAMBIA1300- ARDl)同时播种在MS培养 基上，4X:黑暗培养3天后，转移到22摄氏度个光照培养8天，如图3所示，结果表 明，转？0八1^1八1300-ARDl植株比未转基因的ARDl突变体的生长状况好，表明 v4i D/基因的突变的确影响植物根系的生长发育。序列表
〈160>3
<210>1
<211〉1925
〈212〉DNA
<213〉拟南芥(AraZ 油萍'5" t)Wj.a朋)
<400〉1
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〈210〉3
<211〉500
〈212>PRT
〈213>拟南芥(ylraZ^zV。/ 57.51 t/Wi朋s) <400〉3
Met Gin Met Asn Ser 1 5 Ser Ser Val lie Gly 20
Thr Leu Val Lys Lys 35
Val Asn Lys Asp Lys 50
Val Pro Arg Thr Gly 65
Leu Tyr Asp Ser Ser 85
Phe Asn Pro Arg Lys 100
Tyr Ser Leu Met Ala 115
lie Val Arg Asp Pro 130
Val Glu Val Ala Ala 145
Val
Ser
Trp
Arg
Gly
70
Glu
Glu
Lys
lie
150
Trp
Phe
Ala
Ser
55
Arg
Glu
Lys
Leu
Ala 135 Phe
Lys
Ala
Asp
40
Leu
Thr
Cys
Cys
Pro 120 Arg
Leu
Leu
Glu 25 Ser
Lys
Tyr
Pro
Lys 105 Arg
Val
Val
Ser Leu Gly Leu 10
Leu Asp Phe Gly
Ser Ser Ser Arg 45
Asp Leu Leu Phe 60
Phe His Cys Phe 75
Arg Ser Tyr Asp 90
Leu Leu Ala Thr
Glu Arg Thr Ser 125
Leu Ser Thr Tyr 140
His Pro Asn Leu 155
Leu Leu Leu 15
His Cys Glu 30
Glu Glu His
Phe Leu His
Leu Arg Lys 80
Lys Leu His 95
His Asp Asp 110
Val Met Thr
Glu Phe Ser
Thr Ser Ala 160
12Ser Arg
Asp lie
Phe Ala
Asp Asp 210 Tyr Leu 225
Phe Gin
Glu Val
Leu Gin
Thr Glu 290 Ser Gin 305
Lys Ala
Asp Lys
Ala Glu
Tyr Glu 370 Val Asn 385
Arg Thr
Asn Leu
Glu His
lie Val 450 Glu Glu
Met
Trp
Arg 195 Asn
Asp
lie
Arg
Val 275 Glu
Val
Leu
Ser
Ala 355 Gly
Ser
Arg
Asp
Glu 435 Asp
Lys
Ser
Pro 180 Arg
Pro
Ala
Ala
His 260 Ala
His
Leu
Lys
Asn 340 Lys
Cys
Leu
Val
Val 420 Leu
Leu
Leu
Ser 165 Trp
Asp
Tyr
Pro
Gly 245 Cys
Lys
Arg
Ser
Ser 325 lie
Ser
lie
Lys
Pro 405 Glu
Val
Pro
Trp
Arg
Lys
Ala
Asp
Thr 230 Leu
Val
Arg
Glu
Gin 310 Glu
Gin
Gly
Thr
Arg 390 Lys
Leu
Ser
Ser
Lys
lie
Tyr
Arg
Met 215 Ala
Thr
Gin
Arg
Ser 295 Val
Ala
Asn
Asn
His 375 lie
Glu
Tyr
Asn
Glu 455 Phe
Arg
Leu
Lys 200 Glu
His
Asn
Lys
Leu 280 Ala
Val
Ser
Gly
Met 360 Leu
Thr
Val
Lys
Lys 440 Leu
Val
Lys
Val 185 Leu
Glu
Asp
Asn
Phe 265 Asp
Ser
Pro
Val
Thr 345 Thr
Arg
Pro
lie
Tyr 425 Leu
Lys
Pro
Ser 170 Pro
Lys
Met
lie
Ser 250 Lys
Ser
Leu
Ser
Thr 330 Ser
Val
Lys
Ala
Gin 410 Ala
lie
Ser
Val
Asn
Trp
Glu
Leu
lie 235 His
Ser
Met
Phe
Asn 315 lie
Glu
Lys
Ser
Asn 395 Gin
Lys
Ser
Val
Ala
Val
Met
Val
Met 220 His
Leu
Leu
Leu
Ala 300 Ala
Ser
Val
Thr
Gin 380 Phe
lie
Val
Ser
Leu 460 Leu
lie
Arg
Val 205 Pro
Asn
Ser
Gly
Tyr 285 Asn
Thr
Glu
Thr
Leu 365 Gly
Thr
Lys
lie
Ser 445 Gly
Met
Ser
Glu 190 lie
Leu
Gly
Glu
Glu 270 Val
Val
Ala
Thr
Leu 350 Met
Thr
Arg
Ser
Phe 430 Lys
Glu
Leu
Thr Leu 175
Asp Leu
lie Glu
His Lys
Ala Thr 240 Ala His 255
Ser Val
Gly Leu
Val Gly
Lys lie 320 Gly Ser 335
Asn Lys
Glu Val
Arg Arg
Gly Thr 400 Leu Asn 415
Ala Lys Arg Ser Met Gly Leu Leu465 470 475 480
lie Val Leu Phe Phe Leu Phe Val Asn Ala Lys Arg Arg Arg Thr Ser 485 490 495
Lys Val Lys lie 500
权利要求
1、一种植物根生长发育相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物根生长发育相关蛋白活性的蛋白质。
2、 权利要求l所述的植物根生长发育相关蛋白的编码基因，具有自序列表中序 列2的5'端第268-1770位核苷酸序列。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述植物根生长发育相关蛋 白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQIDW2: 2的核苷酸序列；2) 编码序列表中SEQIDW: 3蛋白质序列的多核苷酸；3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQIDJV2: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述植物根生长发育相关蛋 白的基因组基因具有下述核苷酸序列之一-1) 序列表中SEQID地l的核苷酸序列；2) 编码序列表中SEQIDW2: 3蛋白质序列的多核苷酸；3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQIDW2: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。
5、 含有权利要求2-4中任意一项所述的植物根生长发育相关蛋白编码基因的重组 表达载体。
6、 含有权利要求2-4中任意一项所述的植物根生长发育相关蛋白编码基因的转基 因细胞系。
7、 含有权利要求2-4中任意一项所述的植物根生长发育相关蛋白编码基因的宿主菌。
8、 权利要求2-4中任意一项所述的植物根生长发育相关蛋白编码基因在促进植物 根生长发育中的应用。
9、 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种植物根生长发育相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物根生长发育相关蛋白活性的蛋白质。本发明的植物根生长发育相关蛋白及其编码基因可促进植物根的生长发育，对促进植物根系生长，提高植物产量，在植物(特别是农作物)品种的改良中发挥巨大作用。
文档编号C12N1/19GK101560251SQ20081010408
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月15日 优先权日2008年4月15日
发明者吴晓燕, 孙加强, 李传友, 李常保, 蒋红玲, 韦丽荣 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所