专利名称:一种富铁酵母及其生产方法
技术领域:
本发明涉及一种微生物,具体地说涉及一种富铁酵母,本发明 还涉及该菌种的选育方法以及使用这种菌种进行工业生产的方法。
背景技术:
铁是人体和动物维持生命和生长发育所必需的营养物质,是体 内必不可少的一种微量元素,参与血液中氧的运输作用。铁的缺乏 会引起人体及动物贫血以及其他症状。目前,巿场上的补铁产品琳 琅满目,品种繁多,但其铁源主要是无机盐,对胃的刺激很大,也 不利于人体的吸收和利用。
酵母细胞能直接将铁吸收,转化为生物铁,可以提高铁的生物 利用度,同时能消除对胃以及肠黏膜的刺激。以酵母为载体,将化 学状态下的铁转化为生物状态的铁,是开发新的铁源,提高铁的生 物利用度的有效措施。富铁酵母在预防和治疗人和动物缺铁性贫血 及其他一些缺铁性疾病方面发挥着显著作用。此外富铁酵母还含有 丰富的蛋白质、维生素等人体必需的营养物质。
近年来,尽管有些称作"富铁酵母"的产品,但这些产品存在
着明显的缺陷和不足
一是没有对酵母菌种进行筛选、育种和驯化,经常是用随机得 到的酵母菌种进行发酵生产富铁酵母。由于不同菌种对铁富集效果 的差异性很大,因此产品不稳定,不适合工业化生产。
二是没有对富铁酵母发酵培养基的铁离子浓度、培养条件进行 优化,虽然培养的产物称为"富铁酵母",但酵母细胞的含铁量低, 生物量不高,即使能生产,生产成本也较高,不具备可行性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种铁含量较高的富铁酵 母菌种以及利用该菌种进行工业生产的方法。
由于高浓度铁离子对酵母的生产有一定的抑制, 一般的酵母很 难在含有高浓度铁离子的条件下生长,即使有生长速率但对铁的利 用率不高。因而本发明首先筛选出耐高铁的酵母,然后在高浓度铁 的培养基中不断驯化,接着通过氯化锂诱变,选出铁含量高、生长 速率快、对铁的利用率高的富铁酵母菌种,将其中优选的一株命名
为Z2丄该酵母菌株已经于2005年10月25日在中国典型培养物 保藏中心(CCTCC,武汉大学,邮编430072)进行了生物保藏,分 类命名为酉良酒酵母(iSacc/zoramyces cerev/s/ae),保藏编号为CCTCC M205127。
具体地说,通过如下方法选育菌种
1) 筛选耐高铁的酵母菌种将不同的酵母菌种接种到不同浓度 的含铁培养基中培养,挑选出耐铁菌种作为驯化菌种。
2) 将耐铁菌种接种到氨基酸螯合铁浓度高的培养基中多次传代 培养驯化。
3) 将多次传代培养驯化的菌种接种到不同氯化锂剂量上诱变。
4) 将诱变的酵母菌种再进行分离筛选,利用摇瓶和小型发酵罐 进行发酵选出铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高、耐高铁的 酵母菌种,即为富铁酵母菌种。
5) 筛选培养基配方
麦芽汁培养基含糖量5~25%,含铁(氨基酸螯合铁)浓度为 150~4500pg/ml, pH值为4 6.5。
6) 筛选培养条件
温度26 35。C,搅拌培养18~48小时。
在另一个方面中,本发明提供了生产上述富铁酵母产品的方法, 包括菌种活化、扩大培养、发酵罐培养,发酵罐培养结束后对培养 物进行分离、干燥、包装后即得成品。
其中,菌种活化可采用本领域技术人员熟知的常规方法进行, 如釆用斜面菌种培养活化。其中,扩大培养可包括一级液体种子培养、二级液体种子培养 以及发酵罐种子培养。
其生产流程如下斜面菌种培养4 一级液体种子培养—二级
液体种子培养4发酵罐种子培养4发酵罐培养4分离4干燥—包 装。
具体地说可釆用如下方法
1) 斜面菌种培养将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为5~ 25%、铁浓度为150~5000ng/ml、 pH值为4 ~ 6.5的麦芽汁固体斜面 上,在26-35。C培养24 48小时。
2) —级液体种子培养将斜面的酵母菌种接种1~4环到装有 100~500ml的含糖量为5~25%、铁浓度为150 ~ 5000ng/ml、 pH值 为4~6.5的麦芽汁专用培养瓶中,在26-35'C培养24 48小时。
3) 二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有10-40L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5~25 %、铁浓度为150~5000|ig/ml、 pH值为4 ~ 6.5的卡氏培养瓶中, 接种量为1%~10%,在26 35"培养18~48小时。
4) 发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有0.5~15m3 的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5~25%、铁 浓度为150~5000|ig/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4-6.5 的种子发酵罐中,接种量为1%~10%,在26-35"C培养18-48小 时。
5) 发酵罐发酵培养将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的含 糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5~25 % 、铁浓度为150 ~ 5000ng/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4 ~ 6.5的发酵罐中,接种量5%~15%,所用的营养源釆用流加方式, 铁釆用流加方式加入,在26 35。C培养14~36小时。
6) 分离采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框 压滤。
7) 干燥采用60-14(TC流化态干燥,干燥的产品具有活性;采 用100 18(TC喷雾干燥或者用0.3-0.6Mpa的蒸汽压力滚简干燥,
6干燥产品没有活性是粉状或小片状;也可以采用冷冻干燥法干燥。
8)包装可以釆用多种形式包装成为高铁含量的富铁酵母。铁 含量达到2000 ~ 50000mg/kg。
在发酵罐种子培养和发酵罐发酵培养中需要添加适量的氮源和 磷源,氮源选自硫酸氨、碳酸氢铵、氨水、磷酸氨、磷酸氢氨和磷 酸氢二氨,或是这些物质的组合。磷源为选自磷酸、磷酸氨、磷酸 氢氨和磷酸氢二氨,或是这些物质的组合。优选为磷酸氨、磷酸氢 氨和磷酸氢二氨。优选氮源和磷源的使用量均为培养基重量的 1~10%。铁源为选自硫酸亚铁、葡糖糖酸涯铁、乳酸亚铁、富马酸 亚铁、氨基酸螯合铁或是这些物质的组合,使用量为培养基重量的 1~10%。铁源优选氨基酸螯合铁,使用量为培养基重量的1~10%, 从发酵开始至发酵14小时内流加完。
如果是连续的生产可以增加一级发酵罐二级种子发酵,发酵条件 是将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的含糖(淀粉水解糖或糖 蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5 ~ 25 % 、铁(氨基酸螯合铁) 浓度为150~5000ng/ml、补充适当的氣源和磷源、pH值为4 ~ 6.5 的二级种子发酵罐中,所用的营养源采用流加方式,铁釆用流加方 式加入,在26 35。C培养14~36小时。然后再进行发酵罐发酵,或 者用离心机或板框进行分离,在4 1(TC储罐或冷库中保存,然后根 据需要接种到发酵罐中再进行下一级培养。此时发酵罐发酵的条件 优选为发酵罐种子培养液接种到1 -300吨的含糖量为5~25%、 铁浓度为150~5000ng/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4 ~ 6.5 的发酵罐中,所用的营养源采用流加方式,铁采用流加方式加入, 在26-35。C培养14~36小时。
本发明使用的耐高铁的富铁酵母菌种,耐铁性能稳定,生长速率 快,对铁的利用率高,含铁高可以达到80000mg/kg。而现有技术生 产的富铁酵母铁含量通常在1000mg/kg以下,最高才到2000mg/kg。 此外,本发明生产的高铁含量的富铁酵母生物铁含量高,可以达到 90%。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。除非特别指明,本
试剂。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明,而不能限制本发明 的保护范围。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明精神和实质 的前提下,对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离 加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1:本发明对酿酒酵母菌种的筛选
1 )将酉良酒酵母(Sacc/wramyc" cerev/w'ae)菌种接种到不同浓 度的含铁培养基中,筛选能够在高铁培养基中生长的菌种。挑选出 耐铁的菌种作为驯化的菌种。
2) 将耐铁的菌种接种铁含量更高的培养基上进行培养,并逐渐 提高培养基中铁的含量。然后在高氨基酸螯合铁浓度的培养基上多 次传代培养。
3) 将传代培养的酵母菌株再进行分离筛选,利用摇瓶和小型发 酵罐进行发酵选出铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高的耐高 铁的富铁酵母菌种,即为耐高铁的富铁酵母菌种。经筛选得到一株 铁含量高、生长速率快、对铁的利用率高的耐高铁的富铁酵母菌种, 将其命名为Z2.1,并进行了保藏。
4) 筛选培养基配方
麦芽汁培养基含糖量10%,含铁(氨基酸螯合铁)量150 ~ 5000吗/ml, pH值为5.5。
5) 筛选培养条件 温度3(TC,搅拌培养24小时。
实施例2:富铁酵母产品的生产
生产高铁含量富铁酵母的生产流程斜面菌种培养— 一级液 体种子培养—二级液体种子培养—发酵罐种子培养—发酵罐 培养—分离—干燥—包装。具体工艺如下
l)斜面菌种培养将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150吗/ml、 pH值为5.5的麦芽汁 固体斜面上,在30。C,培养24小时。
2 )—级液体种子培养:将斜面的酵母菌种接种2环到装有250ml 的含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为150pg/ml、 pH值为 5.5的麦芽汁专用培养瓶中,在30'C培养24小时。
3) 二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有25L 的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10%、铁(氨 基酸螯合铁)浓度为150)Lig/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中,在30°C 培养24小时。
4) 发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有81113的含糖 (麦芽汁和糖蜜各半)量为20%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为
150pg/ml,加5%磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中,在30°C 培养48小时。
5) 发酵罐发酵培养将发酵罐种子培养液接种到150吨的含糖 (淀粉水解糖和糖蜜各半)量为20%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为
150|ig/ml,加5%磷酸氢氨、pH值为5的发酵罐中,所用的营养源 釆用流加方式,铁釆用流加方式加入,在30'C培养24小时。
6) 分离釆用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框 压滤。
7) 干燥采用IO(TC流化态干燥,干燥的产品具有活性
8) 包装可以釆用多种形式包装成为高铁含量的富铁酵母。铁 含量达到2000mg/kg左右。
实施例3:富铁酵母产品的生产
生产高铁含量富铁酵母的生产流程斜面菌种培养— 一级液 体种子培养—二级液体种子培养—发酵罐种子培养—发酵罐 培养—分离—干燥—包装。具体工艺如下
l)斜面菌种培养将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500pg/ml、 pH值为5.5的麦芽汁 固体斜面上,在30。C,培养24小时。
2 )—级液体种子培养:将斜面的酵母菌种接种3环到装有100ml 的含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500!ig/ml、 pH值为 5.5的麦芽汁专用培养瓶中,在3(TC培养24小时。
3)二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有10L 的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10%、铁(氨 基酸螯合铁)浓度为500pg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中,在30°C 培养24小时。
4 )发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有2m3的含糖 (糖蜜)量为5 ~ 25 % 、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500|iig/ml,加1 ~ 5%磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中,在28'C培养48小时。
5) 发酵罐发酵培养将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的 含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为25 % 、 铁(氨基酸螯合铁)浓度为500pg/ml、加1%磷酸氢氨、pH值为6.5 的发酵罐中,所用的营养源采用流加方式,铁采用流加方式加入, 在35'C培养36小时。
6) 分离采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框 压滤。
7) 干燥采用60 14(TC流化态干燥,干燥的产品具有活性; 釆用100-18(TC喷粉干燥或者用0.3 0.6Mpa的蒸汽压力滚简干燥, 干燥产品没有活性是粉状或小片状;也可以釆用冷冻干燥法干燥。
8) 包装可以釆用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。 铁含量达到6500mg/kg左右。
实施例4:富铁酵母产品的生产
生产高铁含量富铁酵母的生产流程斜面菌种培养— 一级液 体种子培养—二级液体种子培养—发酵罐种子培养■>发酵罐
10培养 >分离—干燥■>包装。具体工艺如下
1) 斜面菌种培养将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为 10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000ng/ml、 pH值为5.5的麦芽汁 固体斜面上,在3(TC,培养24小时。
2) —级液体种子培养将斜面的酵母菌种接种1~4环到装有 100~500ml的含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000|ig/ml、 pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中,在30'C培养24小时。
3) 二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有10-40L的含糖(麦芽汁)量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000pg/ml、 pH值为5.5的卡氏培养瓶中,在30'C培养24小时。
4) 发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有0.5~15m3 的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为5 ~ 25 % 、铁(氨基酸螯合铁)浓 度为1000|ig/ml,力口 1 ~5%磷酸氢氨、pH值为4 — 6.5的种子发酵罐 中,在26-35。C培养18~48小时。
5) 发酵罐发酵培养将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的 含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5 ~ 25 %、铁(氨基酸螯合铁)浓度为1000ng/ml、力口 1~5%磷酸氢氨、 pH值为4~6.5的发酵罐中,所用的营养源釆用流加方式,铁釆用流 加方式加入,在26 35""C培养14~36小时。
6) 分离采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框 压滤。
7) 干燥釆用60-14(TC流化态干燥,干燥的产品具有活性; 釆用100 18(TC喷粉干燥或者用0.3 0.6Mpa的蒸汽压力滚简干燥,
干燥产品没有活性是粉状或小片状;也可以釆用冷冻干燥法干燥。
8) 包装可以釆用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。 铁含量达到13800mg/kg左右。
实施例5:富铁酵母产品的生产
ii生产高铁含量富铁酵母的生产流程斜面菌种培养— 一级液
体种子培养—二级液体种子培养—发酵罐种子培养—发酵罐
培养"> 分离—干燥包装。具体工艺如下
1)斜面菌种培养将耐高铁的富铁酵母菌种接种到含糖量为 10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为5000pg/ml、 pH值为5.5的麦芽汁 固体斜面上,在3(TC,培养24小时。
2 )—级液体种子培养:将斜面的酵母菌种接种4环到装有250ml 的含糖量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为500(Hig/ml、 pH值为 5.5的麦芽汁专用培养瓶中,在3(TC培养24小时。
3) 二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有25L 的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10%、铁(氨基酸螯合铁)浓度 为13000pg/ml、 pH值为5.5的卡氏培养瓶中,在30。C培养24小时。
4) 发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有10mS的含 糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为20%、铁(氨基酸螯合铁)浓度为 13000^ig/ml,加5%磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中,在30°C 培养48小时。
5) 发酵罐发酵培养将发酵罐种子培养液接种到150吨的含糖 (淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为20% 、铁 (氨基酸螯合铁)浓度为13000ng/ml、加5%磷酸氢氨、pH值为5.5
的发酵罐中,所用的营养源采用流加方式,氨基酸螯合铁釆用流加 方式加入,在3(TC培养36小时。
6) 分离釆用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框 压滤。
7) 干燥釆用60 14(TC流化态千燥,干燥的产品具有活性; 采用100 ~ 18(TC喷粉干燥或者用0.3 ~ 0.6Mpa的蒸汽压力滚简干燥, 干燥产品没有活性是粉状或小片状;也可以采用冷冻干燥法干燥。
S)包装可以釆用多种形式的包装成为高铁含量的富铁酵母。铁含量达到82000mg/kg。 实例6:富铁酵母产品的生产
本实施例增加一级发酵罐种子培养,生产工艺为斜面菌种培 养— 一级液体种子培养■> 二级液体种子培养— 一级发酵罐种 子培养_> 二级发酵罐种子培养—发酵罐培养—分离—干燥 —包装。所增加的一级发酵罐种子培养方法和发酵罐培养大致相 同,其他工艺同实施例2,只是发酵罐发酵培养选择淀粉水解糖8% 和糖蜜作碳源5%、氨水3%作氮源、磷酸氢氨2%作磷源,培养液 中的铁含量为2000pg/ml, pH值为5.2,温度28 ~ 32。C鼓风培养26 小时。
本实施例生产出来的高铁含量的富铁酵母铁含量达到 25900mg/kg。
实施例7:富铁酵母产品的生产
本实施例的生产方法同实施例2,但在干燥过程中釆用流化态干 燥的方法干燥出具有活性的高铁含量的富铁酵母,干燥工艺是进 风温度120~ 140。C,出风温度70 10(TC,干燥20 50分钟,水分 小于7%。
生产工艺
斜面菌种培养■> 一级液体种子培养—二级液体种子培养 ■>发酵罐种子培养—发酵罐培养~>分离—干燥■>包装。
本实施例生产出来的高铁含量的富铁酵母的活细胞率达到80% 以上。
综上所述,本发明的充分利用微生物遗传育种技术,微生物发 酵技术,根据酵母菌对铁耐受的特性进行筛选出耐高铁的酵母菌种, 再通过诱变技术选育出铁含量高、生长速率快、产率高、对铁的利 用率高的耐高铁的富铁酵母菌种。针对该菌种制定的特定工艺生产 出高铁含量的富铁酵母,特点是耐铁性能稳定,生长速率快,对铁的利用率高;生物铁含量高,可以达到90%;该高铁含量的富铁 酵母可以是活性也可是没有活性。具有更广阔的应用空间。
权利要求
1、一种富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z2.1 CCTCC M205127。
2、 权利要求l所述富铁酵母的生产方法,其包括菌种活化、 扩大培养和发酵培养。
3、 如权利要求2所述的方法,其还包括在发酵培养后对培养物进行分离、干燥和包装。
4、 如权利要求2或3所述的方法,其中菌种活化的方法是将 所述富铁酵母菌种接种到含糖量为5~25%、铁浓度为 150~5000ng/ml、 pH值为4~6.5的麦芽汁固体斜面上,在26 35。C 培养24~48小时。
5、 如权利要求2或3所述的方法,其中扩大培养包括 一级液体种子培养将活化的菌种接种1-4环到装有100 ~500ml的含糖量为5 ~ 25 % 、铁浓度为150 ~ 5000ng/ml、 pH值为4 ~ 6.5的麦芽汁专用培养瓶中,在26~35°。培养24~48小时;二级液体种子培养;将一级液体种子培养液接种到装有10 ~ 40L 的含糖量为5~25%、铁浓度为150~5000ng/ml、 pH值为4 ~ 6.5 的卡氏培养瓶中,接种量为1%~10%,在26 ~ 35°。培养18-48小 时;发酵罐种子培养将二级种子培养液接种到装有0.5 ~ 15m3的含 糖量为5~25%、铁浓度为150~500(^g/ml、补充适当的氮源和磷 源、pH值为4~6.5的种子发酵罐中,接种量为1%~10%,在26~ 35'C培养18~48小时。
6、如权利要求5所述的方法,其特征在于,发酵罐发酵培养的 方法是将发酵罐种子培养液接种到1 -300吨的含糖量为5~25%、 铁浓度为150~5000|ig/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4-6.5 的发酵罐中,接种量为5%~15%,所用的营养源釆用流加方式,铁 源采用流加方式加入,在26 35'C培养14~36小时。
7、 如权利要求5所述的方法,其还包括在二级发酵罐种子发酵 培养,培养方法是将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的含糖量 为5~25%、铁浓度为150~5000pg/ml、补充适当的氮源和磷源、 pH值为4~6.5的发酵罐中,接种量为1%~10%,所用的营养源釆 用流加方式,铁源采用流加方式加入,在26 35。C培养14~36小时。
8、 如权利要求7所述的方法,其特征在于,发酵罐发酵培养的 方法是将发酵罐种子培养液接种到1~300吨的含糖量为5~25%、 铁浓度为150~5000ng/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4-6.5 的发酵罐中,接种量为5%~15%,所用的营养源釆用流加方式,铁 采用流加方式加入,在26-35。C培养14~36小时。
9、 如权利要求3所述的方法,其中分离釆用叠片式分离机分离, 再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
10、 如权利要求3所述的方法,其中,干燥a) 釆用60 14(TC流化态干燥;或b) 釆用100 18(TC喷雾干燥;或c) 用0.3 0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥;或d) 釆用冷冻干燥法干燥。
全文摘要
本发明提供了一种富铁酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z2.1CCTCC M 205127。该菌株耐铁性能稳定,生长速率快,对铁的利用率高,含铁高,可以达到80000mg/kg,其中生物铁含量可达90%。
文档编号C12R1/865GK101575579SQ20081010597
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者余明华, 俞学锋, 夏长虹, 娟 姚, 彦 张, 李知洪 申请人:安琪酵母股份有限公司