检测牛羊感染细菌的基因芯片、制备及检测方法、试剂盒的制作方法

专利名称：：检测牛羊感染细菌的基因芯片、制备及检测方法、试剂盒的制作方法检測牛羊感染细菌的基因芯片、制备及检測方法、试剂盒技术領域本发明涉及生物检測
技术领域：
，具体涉及检瀕牛羊感染细菌病原体的基因芯片、芯片的制备方法、检洲方法和检渊用试剂盒。牛布氏病、绵羊布氏病、山羊布氏病、牛结核病、人结核病是世界各国动物检疫部门重点防范的动物传染病及人畜共患病,我国质量监督检验检疫局也将其列为牛羊属动物出入境检验检疫的必检疫病。随着大型动物及相关制品的国际贸易日益频繁，相应的病原徵生物检渊技术应运而生。常规技术包括微生物培养技术、免疫技术、PCR技术等，尽管这些检測技术已发挥了巨大的作用，但仍存在如下缺陷徵生物培养技术繁瑣而费时；免疫技术要有特异性强的抗血清PCR技术本身的优越性无可厚非，但反应条件控制不当很容易引起交叉污染，出现假阳性。这些缺陷的存在使得常规的检測方法无法适应动物疫病检拥快速、准确、髙通量的要求，新的动物疫病检測方法的开发已迫在眉睫。病原微生物基因组计划的突破性进展使得从基因水平检测病原徵生物感染成为可能,近几年发展起来的生物芯片技术更是为病原微生物的基因检拥提供了强有力的手段。生物芯片技术是具有微型化、高通量、并行处理及易于自动化等优势的前沿生物技术，它将大量的靶基因片段高密度、有序地排列在玻片、硅片等载体上，用相应的检湖手段检測后,通过计算机软件进行数据比较和分析，一次试验就可对上万种基因进行快速、准确、高效的检測.
发明内容本发明的目的是提供一种检拥牛羊感染细菌病原体的基因芯片，以弥补传统的检測方法技术存在的不足。本发明的另一个目的是提供检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的制备方法。本发明的更进一步的目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测牛羊感染细菌病原体的方法。本发明还有一个目的是提供用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒。为达到上述的目的，本发明的技术方案如下本发明的检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌中的至少一种细菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。其中一个优选的技术方案是所述的寡聚核苷酸检测探针包括从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。本发明技术方案中所述的检测探针分别具有以下序列:从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中的SEQIDN0:8所示的碱基序列;从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:10所示的碱基序列。本发明制备检测牛羊传染病细菌的基因芯片的方法，包括以下的步骤(1)探针的设计经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用PrimerPremier5.0和01igo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针；(2)检测探针的合成由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列；(3)芯片的制备包括切膜、贴膜，然后将上述得到的检测探针点膜，紫外交联10分钟，再经存膜即得芯片。其中点膜后得样品点直径在200ura—1000um。上述基因芯片的制备方法中，所述的相对保守区的序列如下牛布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:1所示的碱基序列；山羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDNO:2所示的碱基序列；绵羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:3所示的碱基序列；牛结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:4所示的碱基序列；人结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:5所示的碱基序列。所述检测探针即为上述牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。其序列分别如下从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的碱基序列；从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDNO:IO所示的碱基序列。本发明牛羊感染细菌病原体的检测方法包括以下的歩骤(1)待测样本处理采用常规方法提取待测样品的DNA，进行标记PCR扩增；(2)杂交显色；将歩骤(1)得到的标记后的PCR产物和权利要求1、2或3所述的基因芯片进行杂交，然后显色；(3)结果阅读与分析利用生物芯片阅读仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。由于步骤.(i)中提取的餘观胖品的DNA^i總氐，必须针对^n^列ffl^HarcRrif，^Bi4行^。根据J^相对保守区的麻ij，即,U，设计以下引物用于标记PCR扩增扩增SEQIDN0:1所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:11和NO:12所示；扩增SEQIDNO:2所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:13和NO:14所示；扩增SEQIDN0:3所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:15和NO:16所示；扩增SEQIDNO:4所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDN0:17和N0:18所示；扩增SEQIDN0:5所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDN0:19和N0:20所示。本发明的用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒，包括上述基因芯片、待测样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书。本发明具体的实施方案如下一、基因芯片的制备1、检测探针的设计和合成(1)检测探针的设计经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用PrimerPremier5.0和0.igo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针，所述的检测探针分别具有如下所述的序列牛布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQIDN0:6所示的碱基序列，山羊布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQIDN0:7所示的碱基序列，绵羊布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQIDN0:8所示的碱基序列，牛结核分枝杆菌的检测探针为序列表中SEQIDN0:9所示的碱基序列，人结核分枝杆菌的检测探针为序列表中SEQIDN0:10所示的碱基序列；(2)检测探针的合成由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列。得到探针片段后，配置探针溶液，准备芯片点样。2、芯片的制备(1)切膜选用合适的硝酸纤维素膜，于切膜机中准确裁剪成方形芯片。规格1.5cmX1.5crao(2)贴膜将芯片用胶固定于1.5cmXl.5cm芯片方皿中，使之紧贴芯片方皿底部，放置2溯，臓固后，芯片平^于芯片方鹏部，在芯片方皿的边mi:作一定向标志鄉号。(3)点膜:对探针分布进行合理布局，设质控点。再将已配制好的探针溶液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时己吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作l-3次，点样完毕。(4)存膜点样完毕，待芯片自然千燥，将芯片方皿敬體外:kTT照浙10溯，繊4C保存。(5)芯片布局如图1质控主要指从芯片制备到样本处理，'到杂交扫j^环节的监控，目前主要的控制包括:1)点样过程质控用于监控点样过程，采用有色染料，该染料在芯片杂交过程中将被洗掉，因而不会对芯片检獮结果造成影响；2)杂5LR控用生物素点于芯片上，监控显色过程；3)空白对照是不含任何基因片段的空白点样液，作为芯片制备过程中的污染监控指标。本实验中采用1倍的点样缓冲液4)阴性内参(质控探针)是一段与检測基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标；阴性内参探针序列为5'-CTGGCGAATCTGAATGCAGnTAACGGCTCAACCAAGTTGAACTCAGACGC-3'(序列表中的SEQIDNO:22),由专门的生物公司合成上述探针片段序列。5)阳性内参(质控探针〉是一段与检測基因没有同源性的其他基因片段，在5种常见病原体引物扩塌的同时可以扩增该序列片段，作为PCR扩増过程中的对照，主要用于pcR扩増标记过程的监控。本^it^&片^mm^Hf^i伪5'-TTTGGGGTGCTTGArGAACAATTACArCGTAATAGGGGCTACAGAGATAGA-3'(序列表中的SEQIDNO:21),由专门的生物公司合成上述探针片段序列。二、芯片的使用方法以下，aii基因芯片在检測牛羊感染细菌病原体的试剂盒中的使用，进一步详细说明牛羊感染细菌病原体的检測方法。1、试剂盒组成(1)样本处理试剂细苗处理液l:4%NaOH302ml;细茵处理液2:灭菌生理&^25mh细菌处理液3:0两厶提取液1.261011(2)PCR体系组分PCR反应液1:PCR虹XIIOOjiL,包括引物、生旨、dAT、dTT、dCTP、dGTP、dUTP、10XPCRbuffer、无菌^fe(C嗨1:T叫酶4pL+UNG酶(尿瞎啶DNA糖基化籌)24iLPCR阴性对照(超纯水，用MilliQ纯水仪制备)lnlX3管PCR阳性对照(牛布备氏杆菌、山羊布备氏杆苗、绵羊布番氏杆菌、牛结核分枝杆菌、人结核分枝杆菌五种细菌质粒的混合物〉:'larX3貧。阳性对照制备的方法如下牛肉汤培养基的准备将10g蛋白胨、5g氣化钠、3g牛肉裔溶解在1升水中，用10%丝氣化钠将其班调至7.0，分装，121X:灭菌20分钟，备用。以下，以牛布备氏杆菌为例说明阳性对照制备的过程牛布鲁氏杆苗样品进行PCR扩增，所得的PCR,(^!|)細市糊多雄DNA纯化i^iicafcfi^化，纯^WW^鹏在预先用紫外灯照射30分钟的生物安全柜中，用接种环将大肠杆茵接种在无菌的牛肉汤培养基中，220转/分钟，37"，培养过夜，将培养过夜的菌液收集后，采用质粒提取试剂盒进行质粒提取。将所得各质粒分别用紫外分光光度计定量，计算拷贝数，稀释成表1中记录的浓度后，分装，备用。将五种质粒等体积混合，即得阳性对照，表l五种质粒各自稀释后的浓度细菌名称牛布备氏杆苗山羊布香氏杆苗绵羊布鲁氏杆苗5x10°牛结核分枝杆菌5x10°人结核分枝杆菌5x10°(3)杂交、显色试剂预杂交液12ml,含有甲醮胺(DMF)50%(体积比)，20XSSC25%(体积比〉，50XDenhartds10%(糊比)，鱼精咖A(10mg/ml)5M(糊比)，1MPBS(pH6.4)5%(㈱比〉，0.1MEDTA5%(ftSR比)；杂交液t12ml,含有甲酰胺(DMF)站^(体积比),加XSSC25%(体积比)，50XDenhartds2%(糊比)，鱼精DNA(10mg/ml)2%(糊比)，1MPBS(pH6.4)2%(條比)，20%琉酸葡聚糖钠24%(㈱比)洗液l:2XSSC20ml,含有20XSSC10%(休积比〉，10%SDS1%(体积比)，蒸馆水89%(体积比)；洗液2:0.1XSSC20ml,含,20XSSC0:5%(糊比〕，10%SDS1%(体积比)，蒸馏水98.5%(体积比)；封闭液20ml,0.75gBSA溶于17.5ml蒸馆水中，加入2.5nllMTris-HClpH7.5;瞎联缓冲液40ml,含有1^8~!00.1111)[17.5，MgCl22nM，TritonX-100O.O战(体积比)，NaCl1.0M:酶2:亲和素-碱性碑酸嗨(SAv-AP)0.01ml;终止液12ml,0.5MEDTA:底物缓沖液10ml，含有Tris-HCl0.1MpH9.5,MgCl25mM,NaCl0.1M;底物l:5-溴-4-氣-3画吲哚碟酸(BCIP)0.05ml,2.5mgBCIP溶于0.05mlDMF中底物2:氨蓝四唑(NBT)0.05ml,3.75mgNBT洛于0.05ml70%DMF中。注20XSSC:NaCl17.55%,二水合拧樣酸三钠8.82%,pH7.0:1MPBS:NaClO.挑，KC10.02%,Na^HP0,120.l楊，，12貼0.02鄉，pH6.4;0.1MEDTA:EDTA3.72*，pH8.0;1MTris-HClpH7.5:Tris12.196，MgCl20.19%，TritonX-1000.05%(体积比)，NaCl5.战:EDTA:乙二胺四乙酸；SDS:十二烷基碘酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS):PBS:—种碟酸盐缓冲液；BSA:牛血淸白蛋白；TritonX-100:聚乙二醉辛基苯基醚。(4)采样工具无菌试管。(5)点好探针的芯片18张。2、样本处理(1)取家畜的唾液或粪便，用无菌5mL试管收集l3ml:(2)向试管中加入4倍体积的4%的Na0H,摇匀，室皿置1530分钟待液化(3)取液化后标本1.0ml至1.5ml离心管，12,000转/分钟离心5分钟(4)去上清，沉淀加灭菌生理盐水lnl混匀，12,000转/分钟离心5分钟(5)去上淸，沉淀加灭菌生理盐水lml混匀，12,000转/分钟离心5分钟(6)去上清，沉淀中加入50H1咖A提取液(市售试剂盒，150mlDNA提取液lMTris1015ml,0.5MEDTA6d1，5MNaCl范mT，CT紐4.5g,PVF3g，琉代琉糊0.3g,瑰基乙醉充分混匀，1001C恒温处理10分钟；(7)2，000转/分钟离心5分钟，上淸即为样本DNA，取上请至0.2nl离心管，备用。样品存放:制备的样品在21C-81C条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70lC以下，但应避免反复冻融。3、样本扩增标记依据下表所示的PCR体系，加入各种组分，同时配制阴、阳性对照质控体系，然后在鍵涡振荡器上振费混匀，接着在离心机上快速离心10秒，最后放入PCR仪中按表3所述反应程序进行扩增'注阳性对照反应体系中的模板为2rt阳性对照品，其他组分不变检渊反应体系中的模板为2til待检样品DNA,其他组分不变；阴性对照反应体系中的模板为阴性对照,其他组分不变。表2扩増反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中阳性内参引物的序列为"上游引物3*-GGOiTSCAGTCCTCATCCAG-3'(序列表中的SEQIDNO:23〉，下游引物5'-ACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(序列表中的SEQIDNO:24〉，表3PCR反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.杂交、显色(1)预杂交在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号(包括待測样品和阴、阳性对照样品)，向小皿中加入450W预杂交液，置杂交仪上401C预杂交30分钟；(2〉杂交在预杂交过程中，将PCR产物置于PCR仪中变性10分钟，然后立刻置于冰水浴10分钟，在杂交小皿中加45014杂交液，将PCR产物加入杂交小皿中于46*0杂交90分钟(3)洗涤分别用2XSSC洗涤液450H1将杂交芯片洗涤两次，再用0.1XSSC洗涤液450W将杂交芯片洗潘两次，每次各3分钟豕(4)封闭向杂交芯片中加入400W封闭液，置杂交仪上于40"封闭20分钟；(5)酶联取适量的瞎联级冲液，按SAv-AP:瞎联缓冲液-l:1200比例加入SAv-AP,振荡混匀，取混和液400H1加入杂交芯片中，置杂交仪上于401C,联反应20分钟(6)洗涤取400W的瞎联缓冲液将杂交芯片洗涤3次，每次3分钟；(7)显色配制显色液(400W底鄉冲液+2W'BCIP+2WNBT),在小皿中加入400W显色液，401C显色3分钟，随时观察杂交芯片上的显色情况及本底深浅(8)终止显色用终止液终止显色，然后用蒸馏水反复冲洗数次；(9)放于芯片阅读仪上阅读结果。5、结果阅读(1)适用于和利时全自动芯片成像分析仪(2)杂交完毕后，将霈要阅读的芯片连同芯片载盘一起取出，放入芯片分析仪中，并固定载盘(3)打开分析仪开关，登录实验员帐号进入主界面，选择"芯片分析"，进入芯片选择界面，选取待分析芯片所对应的载盘位号(4)点击"下一步"进入芯片预处理和条形码读取界面，若有仪器无法识别的条形码需在条形码输入界面中手动输入条形码编号(输入条形码号时注意芯片类型是否正确)(5)输入完成后点击"保存"，然后"开始分析"，分析所得结果可于"结果处理"选项中査询，也可直接生成报告单打印或传输到与此成像分析仪相连的PC机上的配套管理软件中；(6)分析仪会经过阅读和计算得出各点检測值，并与参考值(Cutoff值)进行比较得检渊结果。结果类型如下+:阳性一阴性芯片污染空白对照点检測值高于参考值，该样本需重新检拥。非特异阴性内参点的检渊值高于参考值，该样本需重新检測。实验失败阳性内参点的检渊值低于参考值，该样本需重新检獮。注推荐使用软件进行结果分析，可减少人为误差影响。本发明方法能在短时间内检渊5种牛羊感染细菌病原体,快速准确地获取样品中的信息，检獮效率是传统检測手段的数十倍。本发明提供了一整套芯片的制备杂交显色过程。本发明提供了完整的探针排布，优化方案。此方案依据实例调整，具有合理性。芯片可大规模生产，无污染。此发iim量、糖^9r、'效率i^传统细菌检測方法均有提高，易于加工操作，使用简便。附圉说明图l牛羊感染细菌病原体检拥芯片设计模式图质控点女点样过程质控隨阳性内参争杂交质控；口阴性内参众空白对照检測探针①山羊布氏②牛布氏③人结核④绵羊布氏⑤牛结核。图为2牛羊感染细菌病原体险測阳性结果。为进一步说明本发明用于检糖牛羊感染细菌病原体的基因芯片及其检渊方法,特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了觯释而不是以任何方式限制本发明。具体实攤方式实施例l牛布备氏杆菌(Brucellaabortus)DEHNTnONBrucellaabortusstrain544uracilpermeasehomolog(bmel6)andB咖ll(bmell)genes,partialcds.检涠探针的设计与合成—、设计通过文献检索及美国国家生物信息中心(NCBI)的比对获得该细茵病原体的检渊探针。第一步，根据大量的前期文献调研，确定了该病原体的目标基因。经Genbank检索，BLAST序列比对得到相对保守区(祀序列)第二步，依据探针设计原则，采用PrimerPreBier5.0和01igo6.0软件，在此保守区内设计针对病原体的检糖探针得到检涠探针的序列后，由专门的生物公司去合成相应的探针片段。相应的核S^列如下以下是选取的牛布备氏杆菌基因组核酸序列中的相对保守区(祀序列)片段l(SEQIDNO:l)GATCAGATGCAGAAGCGTACCGCCGCAACCGATCTCGATATCGTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGT6AATATCGGCAGCGGAGAAGAAATCTCGATCAAGGAACTGGCACTCACCGTTGCACGTATCGTTGGCTATCAAG将上述细茵片段1输入软件Pri鹏Multiplex3.4MultiplexPCRPri鹏rDesi抑，设定好参数，运行程序，(5'PRIMERO"2003，PRIMER-20(H)TM:571CTMFormulaNearestN%GC50ANYCheckprimer-primerdimmerAvoidbackgroungprimingMultiplexPCR5SpecificityMedi咖其余参数为默认值。)选取长度合适的计算结果，嚴终作为细菌的检測探针片段。该检測探针为GTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGTG(SEQIDN0:6)。二、合成探针的合成将设计好的探针交给专门的生物公司去合成。实施例2山羊布备氏杆菌(Brucella.Melitensis)DEFINITIONBrucellamelit抑sisinserti加sequ抑ceIS711,partialsequ節ce.检測探针的设计与合成方法同实施例1,选取的山羊布鲁氏杆菌基因组核^列的相对保守区(靶序列)为片段2(SEQIDNO:2)TCGGCTCAGAATAATCCACAGAAGGTAGAGCAGTAATATCCAATAGACGCCAnAACAATAGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAAnATCGCTGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTTTCTGACAATTTCCAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAGATCATAGCGCATGCGAGATGGACGAAGCCCATGAATGCGGTCAATGTTTTCTCGCATCG检渊探针为ACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTATCGCT(SEQIDNO:7),实施例3绵羊布备氏杆苗(BrucellaOvis)DEFINITIONBrucella鹏lit抓sisbiovarOvis63/290siteoflargedeletioninvolving卿25bandwboA.检澜探针的设计与合成方法同实施例l，选取的绵羊布备氏杆菌基因组核酸序列的相对保守区(IC^列)为片段3(SEQIDNO:3)nAAGAGTGGAGCGGGTAGCGGGAATCGAACCCGCGCGnCAGCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATAAGCGCTTCGCACTTTTGCTGGTAAA根据片段3设计的检獮探针GCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATA(卿IDN0:8)。实施例4牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)DEFINITIONMycobacteriumbovisBCGPasteur1173P2,completegenome.检涠探针的设计与合成方法同实施例l，选取的牛结核分枝杆菌基因组核酸序列的相对保守区(祀序列)为片段4(SEQIDN0:4〉GCCGCAAAACTCG6ACACGCTTGCATAGTCTCGGTCGACTGTGAACGCGACGACCTCATATTCCGAATCCCTTGTGAAGTAGTAATCTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGnTGGTCATGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTCAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACACTCTTGGAGTGGCCTACAACGGCGCTCTCCGCGGCGCGGGCGTACCGGATATCTTAGCTGGTCAATAGCCATTTTTCAGCAATTTCTCAGTAACGCTACGGGGCGCGCCGTGCCGTAGTAGCGTCOCCACTGATGTGGACGATGGTGCTCCTTTTGGGGnGG检渊探针CAAGGGATTCGGAATATGAGGTCGTCGCGTTCACAGTCGACCGAGACTA(SEQIDNO:9)。实施例5人结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)DEFINITIONMycobacteriumtuberculosisH37Rvcompletegenome:segment5/13.检拥探针的设计与合成方法同实施例l,选取的人结核分枝杆菌基因组核黢序列的相对保守区(祀序列〉为片段5(SEQIDNO:5):GAAATTGCGTGTGCATCATCTGGCAGGCTATGTTCCCGCTACGCTGCAGCCCATCATGGATCTGCGGCTAACGAAGAGGTAATGACATGGCGCAAGCGACATCGGGCATTCGCGCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGGATTGCGGGCGCTAAAAGCGGGCTTGCGTGGATCACAACCGACCCCATCCAGTCGTTGCCAGGCAT6CGTACTCTCGACCTCGGTTGCT检測探针GCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGG(SEQIDNO:10)。实施例6检測牛羊感染细苗病原体的基因芯片的制备1、探针定量用紫外分光光度计定量实施例l-5合成的检測探针以及合成的阴、阳性内参质控探针，然后将探针稀释成50ng/u1,准备芯片点样，探针的点样量为50nl。2、切鹏朋合适的硝酸纤维素膜，于切旗机中准确裁剪成方形芯片，规格为1,5cmX1.5cn3、貼膜将芯片用胶面定于i:.'5cmX1.5cm芯片方皿甲，使之紧貼芯片方皿底部，放置2分钟，胶凝固后，芯片平整地貼于芯片方皿底部，在芯片方皿的边框上作一定向标志鄉号，4、点族按下列芯片布局对探针进行点样。点样时将已配制好的探针洛液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时已吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作1-3次，点样完毕。芯片布局如图1所示点样过程质控所用试剂为有色染料；杂交质控所用试剂为生物素；空白对照所用试剂为1倍的点样缓冲液(1,籌糖溶液〉；阴、阳性内参质控探针的序列及合成如以上本发明具体的实施方案er基因芯片制备"—节中所述。5、交联把点好样的芯片放入在紫外灯下照射10分钟，封装后4"C保存。实施例7试剂盒在五种细菌检拥中的应用1、样本的处理过程(1〉取病畜的唾液，用无菌5mL试管收集l3nL:(2)向玻璃管中加入4倍体积的4免的NaOH,描匀，室温放置1530分钟待液化(3)取液化后标本1.0mL至1.5mL离心管，12,000转/分钟离心5分钟(4)去上清，沉淀加灭菌生理盐水lBL混匀，12,000转/分钟离心5分钟；(5)去上淸，沉淀加灭苗生理盐水lmL混匀，12，000转/分钟离心5分钟豕(6)去上清，沉淀中加入50WDNA提取液充分混匀，100TC恒温处理10分钟(7)2,000转/分钟离心5分钟，上清即为样本咖A，取上淸至0.&1离心管，备用2、5种细菌病原体DNA的PCR扩增标记标记PCR扩塌的反应体系和程序按本说明书的具体实施方案中所述进行,循环条件和次数如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>40次循环3.PCR标记产物变性sPCR循环后的产物置PCR仪中991C加热变性10分钟，然后迅i&i&入冰上骤冷10分钟。4.杂交、显色(1)预杂交在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号(包括待渊样品和阴、阳性对照样品)，向小皿中加入450H1预杂交液，置杂交仪上40"C预杂交30分钟；(2〉杂交在预杂交过程中，将PCR产物置于PCR仪中变性IO分钟，然后立刻置于冰水浴IO分钟，在杂交小皿中加450W杂交液，将PCR产物加入杂交小皿中于461C杂交90分钟(3)洗涤分别用2XSSCiSfe涤液45(mi将杂交芯片洗潘两次，再用O.IXSSC洗錄液450W将杂交芯片洗涤两次，每次各3分钟(4)封闭向杂交芯片中加入400W封闭液，置杂交仪上于401C封闭20分钟(5)酶联取适量的酶联缓冲液，按SAv-AP:酶联缓冲液-l:1200比例加入SAv-AP,振荡混匀，取混和液400W加入杂交芯片中，置杂交仪上于40t!籌联反应20分钟；(6)洗涤取400W的酶联缓冲液将杂交芯片洗錄3次，每次3分钟(7)显色配制显色液(40(HH底物液+2Ji1BCIP+2WNBT)，在小皿中加入400W显色液，40"显色3分钟，随时观察杂交芯片上的显色情况及本底深浅(8)终止显色用终止液终止显色，然后用蒸馏水反复冲洗数次；(9)放于芯片阅读仪上阅读结果。5.结果观察结果见图2按照本试剂盒的检涠方法操作，芯片杂交后各点的显色情况较好。芯片阅读结果_牛羊细菌病原体基因'芯片检测结果户主姓名王力送检单位北京检fi^采样时间20071210病畜ID:07121001牲畜类别羊送检医生,王奇检糖时间2007-12-19样本编号07121001畜齡辨临床诊断::无样本类型t唾液芯片ID:060000000007中文名称结果参考值山羊布鲁氏杆菌阳性阴性缩羊布鲁RfF菌阳性阴性牛布餐氏杆菌阳性阴性牛结核分枝杆菌阳性阴性人结核分枝杆菌阳性阴性录入时间，2007-12-19报告时间:2007-12-19检#:左静审核者梁涛注此报吿只对本样本负贲！SEQUENCELISTING<110>北京爱普益生物科技有限公司<120>检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片、试剂盒及其制备方法、检测方法<130〉SGF<160>24〈170〉Patentlnversion3.2<210>1<211〉166<212>DM〈213〉牛布鲁氏杆菌<德1gatcagatgcagaagcgtaccgccgcaaccgatctcgatatcgtcggaatgtgcctgcat60ctcctgcgcttttataatggcatcgagccggtgaatatcggcagcggagaagkaatctcg120atcaaggaactggcactcaccgttgcacgtatcgttggctatgaag166<210>2<211>292<212>DNA〈213〉山羊布鲁氏杆菌<2tcggctcagaataatccacaga鄉t卿gcagtaatstccaatagacgccattaacaat60agcgagattggaatagcttacccgccaatcttcgccctgccaccagccaataacggcaat120tatcgctgtcactgttgcaagtatggcagcgagcgctctagcgtgacgaagcactgtctt180tctgacaatttccagattcacccctagggcgtgtctgcattc幼cgtaaccagatcatag240cgcatgcgagatggacgaagcccatgaatgcggtcaatgttttctcgcateg292<21.0>3<211>114<212〉■<213>绵羊布鲁氏杆菌<400〉3ttaagagtggagcgggtagcgggaatcgaacccgcgcgttcagcttgggaagctgacagg60ctaccattacatcatacccgcaccgcataagcgcttcgcacttttgctgg114<210〉4<211>361<212>DNA<213〉牛结核分枝杆菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><210〉14<211>18<212〉DNA<213〉artificialsequence<220〉<223〉primer<400〉14cgatgcgagaaaacattg18<210〉15<211>19<212〉DNA<213〉artificialsequence<220><223〉primer<400〉15tttaccagcaaaagtgcga19<210〉16《211〉18<212>腿<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>16ttaagagtggagcgggta<210>17<211>16<212〉DNA<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>17gccgcaaaactcggac16<210>18<211>16<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>primer<400>18ccaaccccaaaaggag16<210>19<211〉6<212>DNA<213>artificialsequence<220〉<223>primer<400>19gccgcaaaactcggac16<210>20<211〉16<212>腿<213>artificialsequence<220〉<223>primer<柳〉20ccaaccccaaaaggag16<210〉21<211〉51<212>DNA<213>阳性内参<400>215,-Utggggtgcttgatgaacaattacatcgt;aataggggctacag卿taga-3'<210>22<211〉51<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>阴性内参<400>22ctggcgaatctgaatgcagtttaacggctcaaccaagttgaactcagacgc51<210>23<211〉20<212>DM<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>23ggcatacagtcctcatccag20<210〉24〈211〉18<212>DNA<213〉artificialsequence<220><223〉primer〈400〉24acggctcttccctccaag18权利要求1、一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，包括固相载体硝酸纤维素膜和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，其特征在于芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌中的至少一种细菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。2、如权利要求l所述的检测牛羊感染细菌病原体的的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸检测探针包括从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。3、如权利要求1或2所述的检测牛羊感染细菌病原体的的基因芯片，其特征在于所述的从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的碱基序列；从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQIDNO:IO所示的碱基序列。4、制备权利要求1所述的检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的方法,其特征是包括以下的步骤(1)检测探针的设计经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用PrimerPremier5.0和01igo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针；(2)检测探针的合成由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列；(3)芯片的制备包括切膜、贴膜，然后将上述得到的检测探针点膜，紫外交联10分钟，再经存膜即得芯片，其中点膜后所得样品点的直径在200iim—1000um。5、如权利要求4所述的方法，其中所述的相对保守区的序列如下牛布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:1所示的碱基序列；山羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:2所示的碱基序列；绵羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:3所示的碱基序列;牛结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:4所示的碱基序列；人结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQIDN0:5所示的碱基序列。6、一种利用权利要求1、2或3所述的基因芯片检测牛羊感染细菌病原体的方法，其特征是包括以下的歩骤(1)待测样本处理采用常规方法提取待测样品的DNA，进行标记PCR扩增；(2)杂交显色；将歩骤(1)得到的标记后的PCR产物和权利要求1、2或3所述的基因芯片进行杂交，然后显色；(3)结果阅读与分析利用生物芯片阅读仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于歩骤(1)所述的标记PCR扩Jt(^用以下引物扩增SEQIDN0:1所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:11和NO:12所示扩增SEQIDN0:2所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDN0:13和N0:14所示；扩增SEQIDN0:3所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:15和NO:16所示;扩增SEQIDN0:4所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDN0:17和N0:18所示；扩增SEQIDN0:5所用的一对引物的序列如序列表中的SEQIDNO:19和NO:20所示。8、用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒，其特征是包括权利要求l、2或3所述的基因芯片、待测样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书。全文摘要本发明涉及一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段。本发明还涉及该芯片的制备方法、利用该芯片检测牛羊五种感染细菌病原体的方法，包括合成探针，制备芯片，与处理标记好的待测样品进行杂交的过程。本发明还进一步涉及由上述芯片和样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书组成的牛羊感染细菌病原体的检测试剂盒。利用本发明的基因芯片可达到同时检测五种细菌的目的，操作简便、准确性高、重复性强，对于实验室研究和生产实践都具有重要的意义。文档编号C12Q1/68GK101333556SQ200810114428公开日2008年12月31日申请日期2008年6月5日优先权日2008年6月5日发明者骋周,姚志建,存姜,逄建涛申请人:北京爱普益生物科技有限公司