一种分离提取糜蛋白酶的方法

专利名称：一种分离提取糜蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种糜蛋白酶的分离提取方法；属于生物制药领域，涉 及到药用蛋白酶的生化分离技术。
背景技术：
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的 一种蛋白酶它在 药理和临床上的功用主要有两方面 一、消炎对各种炎症、炎性水肿、 血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌能促进抗癌药物向病灶渗 透，促使化疗药物发挥作用，有报道在抗癌增效上有效率超过50%，局 部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫 颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。
中国专利CN1944641A公开了一种糜蛋白酶的制备方法，采用亲和 层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶。该方法是使用粉碎机粉碎 原料，原料粒径约为3mm,包含在细胞内的内源性糜蛋白酶不能充分释 放，糜蛋白酶的产量相对较低。在粗制阶段，该制备方法是通过30%饱 和度(某种溶液的饱和度是指，在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量 分数， 一般情况下， 一种溶液的饱和度在同一温度下不会变，要想使不 饱和溶液饱和度增加可以选择增加溶质，在刚好有晶体析出时，就是溶 液刚好饱和的时候)硫酸铵和70。/。饱和度好u酸铵进行分级盐析，过程中 需要使用大量的硫酸铵沉淀剂，不利于环境保护；而且操作程序复杂， 生产成本^支高；截取的目标物也不十分准确。在酶原粗品酶解激活阶段， 该制备方法是加入激活剂后在2 8。C冷库中酶解40-60小时，由于糜蛋白 酶干态稳定，溶液状态很不稳定，尤其当PH值为8左右时极易自溶，因 此酶解时间过长不仅不利于目标蛋白的充分激活，还会导致激活的糜蛋 白酶因自溶变性而失去活性。具有在固定时间内产品活性由低到高，再 由高到低出现衰减的缺点；酶解操作不够准确、科学；工作时间较长。 在精制阶段，该制备方法是将结晶后的粗品酶解，激活后用亲和层析介质进行分离纯化，但是亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少；介质的 使用量大，不适于规模化大生产。

发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种分离提取糜蛋 白酶的方法，该方法能够解决亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的 缺点；能够减轻层析工序负担，减少介质的使用量，不仅减少投资和生 产成本，又能获得高比活糜蛋白酶，适用于规;漠化大生产。
为实现上述目的，本发明提供一种分离提取糜蛋白酶的方法，该方 法包括如下步骤
1) 将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；
2) 对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；
3 )将精制浓缩液加入硫酸铵，并用氢氧化钠调节PH值进行培养使糜蛋 白酶原析出结晶；
4) 对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用， 加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；
5) 用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用0.02mol/L乙酸緩冲液进行 平衡，平衡后用上一步培养物抽滤液直接上样，用上述平衡液洗柱，洗 至流出液OD28o值小于0.1,换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠緩冲 液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；
6) 合并第一半成品和第二半成品，用5KD中空纤维超滤器脱盐浓缩，用 0.22pm除菌滤器除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。
进一步，所述步骤l)具体为
选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，进行超樣t粉碎，力口入3-6 倍体积0.125mol/LH2SO4溶液，在5 ~ 15。C冷媒液保护下，搅拌过夜，加 入适量助滤剂，通过压滤方式进行固液分离。
进一步，所述步骤2)具体为
取压滤液通过40KD中空纤维超滤柱去除杂蛋白，超滤液再通过 10KD中空纤维超滤柱进一步精制浓缩。
进一步，所述步骤3)具体为将精制浓缩液加入^1酸铵干粉至70%饱和度溶液调节PH值为3 ~ 6,在20 ~ 35。C条件下静置培养30 ~ 50小时， 使糜蛋白酶原充分析出结晶。
进一步，所述步骤4)具体为
对得到的培养物进行抽滤，所得滤饼即为糜蛋白酶原，抽滤液回收 待用；将糜蛋白酶原用4倍纯化水溶解，完全溶解后按每公斤滤饼加入 10ml体积的比例加入0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠緩冲液，用 NaOH调整PH到7.6,按每升溶液加入4 ~ 12mg高比活胰蛋白酶，于2 ~ 8。C条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到 1500u/mg时用HC1调PH值为3-3.5,溶液回复稳定状态，即终止激活， 将溶液在0.5~2kg负压条件下用布氏漏斗减压、抽滤，滤饼弃之，溶液 即为第一半成品。
本发明在原料粉碎、提取阶段使用高压匀浆机对原料进行超微粉碎， 可达到细胞破壁的程度，使包含在细胞内的内源性糜蛋白酶充分释放， 提高糜蛋白酶的产量。在粗制阶段，使用40KD和IOKD超滤器进行超 滤，截留分子量为10000~40000的目标蛋白，大大减少石克酸铵沉淀剂的 用量，有利于环境保护；简化操作程序，降低生产成本；以分子量为标 准截取蛋白，目标物更为准确。在酶原粗品酶解激活阶段，是在2 8。C条 件下，加入高比活激活剂并定时监测溶液活性，当糜蛋白酶比活达到 1500u/mg终止酶解，大大提高糜蛋白酶的活性，达到1500u/mg以上；按 照分子激活规律进行酶解，操作更为准确、科学；大大缩短工作时间， 降低生产成本。在精制阶段，是结晶后将培养物进行抽滤，滤饼溶解、 激活、酶解后即为第一半成品，滤液用CM-sopharoseFF层析介质进行分 离纯化，洗脱液得第二半成品，第一半成品和第二半成品合并后脱盐、 浓缩、除菌过滤、冷冻真空干燥后得成品，解决了亲和层析介质昂贵， 可重复使用次数少的缺点；减轻层析工序负担，减少介质的使用量，不 仅减少投资和生产成本，又能获得高比活糜蛋白酶，适用于规模化大生 产。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说吸 图1为本发明实施例1和实施例2的流程图。
具体实施例方式
实施例1:
① 在6000L反应罐中配制4000L 0.125mol/L的硫酸溶液。将-18。C到-20。C冷库保存新鲜牛胰1000 kg用切片机切成片状，再用高压匀浆机 粉碎成浆液，加入上述反应罐中，在反应罐夹套中加入5~ 15。C冷媒 液保护，搅拌提取24小时，提取完成后，加入助滤剂搅匀，将提取 液泵入40 m2板框压滤机，进行液固分离。分离后固体残渣装袋按环 保要求处理。所得清液应澄清，无混浊，泵入超滤罐。用40KD超滤 器对超滤罐中液体进行超滤分离。超滤结束后，再用IOKD超滤器对 上述超滤液进行超滤，全部液体超滤结束后，获得液体320L,加入固 体硫酸铵至70%饱和度，用NaOH调整PH值至5.0士0.5放入方盘中， 置28。C温室，孵育40小时，析出结晶。
② 将结晶好的蛋白液取出，用真空减压抽滤机抽滤。滤饼即为糜蛋白原 4.1 kg，滤液主要为胰蛋白酶和糜蛋白酶的半激活液76L。
③ 滤饼用16L纯化水溶解，完全溶解后加入40ml0.25mol/L的磷酸二氢 钠-磷酸氬二钠緩冲液，用NaOH调整PH值至7.6,加入100mg高比 活胰蛋白斷3000u/mg以上)，于2 ~ 8。C条件下酶解，每隔20分钟监 测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时，用HC1调PH3.2， 终止激活，将溶液在0.5-2 kg负压条件下用真空减压抽滤机减压抽 滤，滤饼弃之，滤液即为第一半成品。
用150LCM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用300L 0.02mol/L乙酸 緩沖液进行平衡，平衡后用第②步滤液上样，用300L上述平衡液洗 柱，洗至流出液OD28o值小于0.1,换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢 二钠緩冲液洗脱，收集洗脱峰60L,所得溶液即为第二半成品。
⑤ 将第一半成品与第二半成品合并，用5KD超滤膜脱盐、浓缩，浓缩 至25L，通过0.22^1111除菌滤器进行除菌过滤。
⑥ 除菌后的溶液装冻干盘，放入冷冻真空干燥机中冷冻干燥，得到成品， 成品按中国药典2005版第二部标准进行全项检查，检查结果全部符 合中国药典标准，糜蛋白酶活性达到1600u/mg。实施例2:
① 在5000L反应罐中配制2500L 0.125mol/L的碌^酸溶液。将-18。C到-20。C冷库保存新鲜牛胰500 kg用切片机切成片状，再用高压匀浆机粉 碎成浆液。加入上述反应罐中，在反应罐夹套中加入5~ 15。C冷媒液 保护，搅拌提取18小时，提取完成后，加入助滤剂搅匀，将提取液 泵入30 1112板框压滤机，进行液固分离。分离后固体残渣装袋"l姿环保 要求处理。所得清液应澄清，无混浊，泵入超滤罐。用40KD超滤器 对超滤罐中液体进行超滤分离。超滤结束后，再用IOKD超滤器对上 述超滤液进行超滤，全部液体超滤结束后，获得液体160L，加入固体 硫酸铵至70%饱和度，用NaOH调整PH值至5.0±0.5放入方盘中， 置30。C温室，孵育35小时，析出结晶。
② 将结晶好的蛋白液取出，用真空减压抽滤机抽滤。滤饼即为糜蛋白原 2.5 kg,滤液为胰蛋白酶和糜蛋白酶的半激活液35L。
③ 滤饼用IOL纯化水溶解，完全溶解后加入25ml0.25mol/L的磷酸二氢 钠-磷酸氢二钠緩沖液，用NaOH调整PH值至7.6,加入60mg高比 活胰蛋白斷3000u/mg以上)，于2-8。C条件下酶解，每隔20分钟监 测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时，用HC1调PH3.2， 终止激活，将溶液在0.5-2 kg负压条件下用真空减压抽滤机减压抽 滤，滤饼弃之，滤液即为第一半成品。
用70LCM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用140L 0.02mol/L乙酸緩 沖液进行平衡，平衡后用第②步滤液上样，用140L上述平衡液洗柱， 洗至流出液OD28o值小于0.1,换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠 緩冲液洗脱，收集洗脱峰25L,所得溶液即为第二半成品。
⑤将第一半成品与第二半成品合并，用5KD超滤膜脱盐、浓缩，浓缩 至13L,通过0.22^m除菌滤器进行除菌过滤。
◎除菌后的溶液装冻干盘，放入冷冻真空干燥机中冷冻干燥，得到成品， 成品按中国药典2005版第二部标准进行全项检查，检查结果全部符 合中国药典标准，糜蛋白酶活性达到1600u/mg。
权利要求
1.一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；2)对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；3)将精制浓缩液加入硫酸铵，并用氢氧化钠调节PH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；4)对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用，加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；5)用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用上一步培养物抽滤液直接上样，用上述平衡液洗柱，洗至流出液OD280值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；6)合并第一半成品和第二半成品，用5KD中空纤维超滤器脱盐浓缩，用0.22μm除菌滤器除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。
2. 根据权利要求l所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述 步骤l)具体为选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，进行超微粉碎，加入3~6 倍体积0.125mol/LH2SO4溶液，在5 ~ 15。C冷媒液保护下，搅拌过夜，加 入适量助滤剂，通过压滤方式进行固液分离。
3. 根据权利要求l所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述 步骤2)具体为取压滤液通过40KD中空纤维超滤柱去除杂蛋白，超滤液再通过 10KD中空纤维超滤柱进一步精制浓缩。
4. 根据权利要求l所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述 步骤3)具体为将精制浓缩液加入硫酸铵干粉至70%饱和度溶液调节 PH值为3-6,在20 35。C条件下静置培养30-50小时，使糜蛋白酶原 充分析出结晶。
5. 根据权利要求l所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述 步骤4)具体为对得到的培养物进行抽滤，所得滤饼即为糜蛋白酶原，抽滤液回收待用；将糜蛋白酶原用4倍纯化水溶解，完全溶解后按每^^斤滤饼加入 10ml体积的比例加入0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠緩冲液，用 NaOH调整PH到7.6， 4妄每升溶液加入4 ~ 12mg高比活胰蛋白酶，于2 ~ 8。C条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到 1500u/mg时用HC1调PH值为3-3.5，溶液回复稳定状态，即终止激活， 将溶液在0.5~2kg负压条件下用布氏漏斗减压、抽滤，滤饼弃之，溶液 即为第一半成品。
全文摘要
本发明公开一种分离提取糜蛋白酶的方法，包括将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；加入硫酸铵并用氢氧化钠调pH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用，加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用培养物抽滤液上样，用平衡液洗柱，洗至流出液OD₂₈₀值小于0.1，换用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；合并第一半成品和第二半成品，脱盐浓缩，除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。本发明解决了亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的缺点，适用于规模化大生产。
文档编号C12N9/64GK101302505SQ20081011598
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者吕向广 申请人:北京格源天润生物技术有限公司