专利名称：一种hiv药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，又称艾滋病毒， 由HIV感染而引起的疾病称为艾滋病，全称为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+ 细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度 快、病死率高，目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。HIV的流行呈世界 性分布，非洲为HIV的发源地和重灾区，欧洲和美洲也为主要流行区，近年HIV在 亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者，至今已有60 80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均 30Q/o的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国 家，HIV的感染率达总人口 30%以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救 个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。
HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)， 目前已发现两种HIV，分别为HIV-l和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途 径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，毒力 和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界 各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。
艾滋病病毒(HIV)颗粒呈球形，直径90nra 130nm。病毒的核心呈中空锥形， 由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成。核心之外为病毒衣壳，呈20 面体立体对称，含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜，包膜上的糖蛋白有刺突状结构， 是HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点。HIV RNA中含有gag、 env禾口 pol基因以及6种调控基因(tat， vif， vpr， vpx (vpu), nef， rev〕 。 gag基因 编码病毒的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需要的酶类(逆转录酶、整合酶和 蛋白酶)；env基因所编码的病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。 HIV主要侵犯人体的CD4+ T淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸附、 侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时，病毒的外膜糖 蛋白gpl20首先与细胞表面的CD4分子结合并与辅助受体CCR5或CXCR4等结合， gpl20空间构象发生改变，暴露出跨膜蛋白gp41与细胞膜作用，导致病毒包膜与细 胞膜融合，病毒核心进入细胞内，脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模 板合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，在病毒整合酶IN的作用下随机整 合到细胞染色体上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞。该前病 毒即为病毒复制时的转录模板，病毒进行复制时，早期转录的长链m咖A经剪接后 表达病毒的调节蛋白，待调节蛋白的量到达一定阈值后，病毒进入晚期转录，产生 的未拼接的mRNA部分用来指导合成病毒的结构蛋白，部分作为病毒的基因组，与 结构蛋白进行装配成为病毒核心颗粒，由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白。
目前，国内HIV药物筛选主要采用具有感染性的HIV病毒感染人淋巴细胞系， 这种细胞模型由于使用了野生型HIV病毒，对人具有感染性，必须严格限制在负压 的P3实验室进行，此外该系统不含报告基因，结果检测程序复杂且灵敏的不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。 本发明提供了一种表达HIV的Gag基因(gag)和Pol基因(pol)的重组表达 质粒。
所述表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒具体可为如图1所示的 pGag-Pol。
本发明还提供了一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表 达质粒和表达报告基因的重组慢病毒质粒。
所有常规报告基因均可使用，如荧光素酶基因(包括萤火虫荧光素酶和海洋腔 肠荧光素酶)，荧光蛋白基因(包括绿色荧光蛋白及其各种衍生物，红色荧光蛋白 等)，氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)， ！3-半乳糖苷酶基因(e-Gal)或葡萄醛酸糖 苷酶基因(GUS)。
所述混合质粒还可包括表达HIV的Rev基因(rev)的重组表达质粒和表达疱疹 性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV外膜糖蛋白)基因的重组表达质粒。
所述表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒具体可为图1所示的 pGag-Pol;所述表达报告基因的重组慢病毒质粒具体可为图2所示的pLenti-Luc;
所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒具体可为如图3所示的pRev;所述可表达 疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒具体可为pVSV-G。
本发明还提供了一种假型慢病毒，是通过如下方法得到的将所述混合质粒共 转染哺乳动物细胞，得到假型慢病毒；所述哺乳动物细胞优选HEK 293细胞、293T 细胞、293FT细胞或Hela细胞。
含有所述假型慢病毒的细胞也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的HIV药物筛选细胞模型，是用所述假型慢病毒感染的哺乳动物 细胞；所述哺乳动物细胞优选HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。
所述假型慢病毒、所述细胞模型均可应用于HIV药物筛选。
通过用己知抗HIV药物对本发明提供的HIV药物筛选细胞模型进行测试，HIV药 物处理组细胞中的荧光素酶活性低于对照组。
本发明构建了表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒、表达报告基因的 重组慢病毒质粒和表达HIV的Rev基因的重组表达质粒。通过将上述3种质粒和 pVSV-G质粒共转染哺乳动物细胞，成功获得了假型慢病毒。将该假型慢病毒感染哺 乳动物细胞，即可得到基于报告基因的HIV药物筛选细胞模型。本发明提供的药物 筛选模型，使用单次感染的病毒，具有良好的安全性，而报告基因使该药物筛选模 型具备极高的敏感性。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1 HIV Gag和Pol基因表达质粒pGag-Pol示意图。 图2重组慢病毒质粒pLenti-luc示意图。 图3 HIV Rev基因表达质粒pRev示意图。 图4为质粒pLenti-Luc的构建流程图。 图5中间质粒pEGFP-Nl-lac示意图。 图6中间质粒pUC19-Luc示意图。 图7中间质粒pEGFP-Nl-lac-luc示意图。 图8中间质粒pLenti-Link示意图。 图9为质粒pLenti-Luc的酶切鉴定图。
具体实施例方式
AZT (Zidovudine,齐多呋啶)是1987年美国食品与药品管理局(FDA)批准的第
一个治疗艾滋病的药物，是一种抗逆转录药物，以下以AZT为例，进一步阐述本发 明的技术方案和效果。
各种DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶I (Klenow大片段)、克 隆载体质粒pUC18/pUC19及碱性磷酸酶CIAP均购自Takara公司，含EGFP的真核表 达载体pEGFP-Nl购自Clontech公司，表达VSV糖蛋白的质粒pVSV-G来源于 addgene质粒保存机构(原名pCMV-VSV-G)，真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)和 pcDNA3. 1(-)、质粒pG5Luc、质粒pEGFP-Nl、 293FT细胞和细胞转染试剂 Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，细胞培养基DMEM购自GIBC0公司，优等 胎牛血清购自德国BI0-C服0M公司，质粒提取试剂盒分别购自北京博大公司和 Qiagen公司，玻璃奶DNA纯化试剂盒购自北京博大公司，Lucif erase Assay System 购于Proraega公司。含HIV-1 NL4-3株的重组质粒pHIV-NL4-3来源于美国国立卫生研 究院艾滋病试剂参比品保存机构(AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID， NIH)
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例1、 HIV的药物筛选 一、质粒pLenti-Luc的构建
参见图4构建含荧光素酶基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc。
1、 中间质粒pEGFP-Nl-lac的构建
BamHI和PvuII双酶切质粒pUC19，回收209bp片段；PvuII和EcoRI双酶切质 粒pUC19，回收92bp片段；将上述两种片段混合，与经BamHI和EcoRI双酶切并脱 磷的载体pEGFP-Nl连接，转化大肠杆菌DH5a，经IPTG诱导后挑取绿色菌落，进行 酶切鉴定，得到能够同时在大肠杆菌和真核细胞中表达EGFP蛋白的重组质粒 pEGFP-Nl-lac (见图5)。
2、 中间质粒pUC19-Luc的构建
Ws/和7feo/双酶切含荧光素酶基因的质粒p6"5Zwc，切胶回收1656bp的 基因片段，Klenow处理后，与经5)ssl酶切的载体pUC19相连。连接产物转化DH5 a后，挑选重组克隆进行酶切鉴定，得到中间质粒pUC19-Luc (见图6)。
3、 中间质粒pEGFP-Nl-lac-luc的构建
5棚#/和&0/ /双酶切质粒pUC19-Luc，回收含有Zwc基因的长约1700bp的片 段，连接到经AcoW和i5^n双酶切的含CMV启动子的质粒pEGFP-Nl-lac上。连接产物转化DH5a后，挑选重组克隆进行酶切鉴定，获得了质粒pEGFP-N1-lac-luc (见图7)。
4、 中间质粒pLenti-Link的构建 人工合成两条寡核苷酸序列如下
5， - tatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtac -3， (序列l); 5， - cgtcgacgggcccgaattcggatccaagcttca -3， (序列2)。 上述两条寡核苷酸经变性后退火，形成末端分别为M/el和A^"I的 linker。用和f/wl双酶切慢病毒载体pLenti6/V5gwLacZ (购自 Invitrogen公司)，与上述linker连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克 隆，得到含多克隆位点的中间质粒pLenti-Link (见图8)。
5、 质粒pLenti-Luc的构建
vWel和^co^双酶切质粒pEGFP-Nl-lac-luc，回收含有CMV早期启动子和 基因的长为2056bp的DNA片段，连接到含部分CMV启动子的经vWel和^bo^T双酶 切的质粒pLenti-Link上，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，进行勤"I及6bsl
酶切鉴定，结果见图9。图9中，1: Jp/7l酶切；2: 5"scl酶切；M: DNA分子
量标准。琼脂糖凝胶电泳结果与预期完全相符。对阳性克隆进行序列分析，证实所 筛选到克隆的插入序列是完全正确的。获得含完整CMV启动子的、能表达Luc基因 的重组慢病毒质粒pLenti-Luc (图2)。
二、 表达HIV Rev基因的辅助质粒pRev的构建 人工合成下列两条引物
Rev-rEco: 5'-CGGAATTCGGAGTGTATTAAGCTTGTGT -3'(序歹U3); Rev-fB亂.5'-AGGGATCCAAAGAGCAGTGGGAATAGGA -3'(序列4)。 以质粒pHIV-NL4-3为模板，扩增HIV Rev基因。扩增产物经Sa历HI和^coT I
双酶切后插入经相同酶切的真核表达载体pcDNA3. l(-)中，得到表达HIV Rev
基因的辅助质粒pRev (图3)。
三、 表达HIV Gag和Pol基因的辅助质粒pGag-Pol的构建 人工合成下列两条引物
RRE-fNde: 5'-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3，(序列5);
RRE-r: 5'-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3，(序歹ij6)。
以质粒pHIV-NL4-3为模板，扩增HIV的RRE序列(该序列为顺势作用元
件，能将与之相连的rna转录物高效转移至胞浆以利于表达)。扩增产物经
y^/ei和^'"dn双酶切后回收，同时用万wn和；w/ei双酶切phiv-nl4-3，回
收含Gag-Pol基因的DNA片段，将上述两个片段与经"s历HI和^//^1II双酶 切的整合表达载体pcDNA3. 1 (-)共同连接，得到表达HIV Gag和Pol基因的辅 助质粒pGag-Pol (图1)。 四、抗HIV的药物筛选
将下述四种质粒共转染HEK 293FT细胞荧光素酶重组慢病毒表达质粒 pLenti-Luc、辅助质粒HIV Gag-Pol表达质粒pGag-Pol、辅助质粒HIV rev基因表 达质粒pRev、辅助质粒疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因表达质粒pVSV-G。其中， 辅助质粒表达的HIV组分协助重组慢病毒基因组复制、包装并且分泌出具有单次感 染能力的假型慢病毒。将假型慢病毒加入到新鲜培养的HEK 293FT细胞上，可导致 新鲜培养的细胞被感染并且表达假型慢病毒所携带的外源报告基因。在假型慢病毒 再感染新鲜293FT细胞的过程中，加入待选药物，观察药物对细胞模型中荧光素酶 表达的影响，从而判断待选药物是否具有潜在HIV药物的性能。
1、 HEK 293FT细胞的培养
服K 293FT细胞用含10%胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素lOOu g/ml) 的DMEM培养基(GIBC0)进行培养。
2、 假型慢病毒的制备
HEK 293FT细胞于转染前一天铺于24孔板，密度约5xl(f个细胞/孔。24个孔 分为3组(甲组、乙组、丙组)，每8个孔一组。采用脂质体Lipofectamine"12000 转染方法，参照Invitrogen公司的转染试剂使用说明，主要步骤如下
针对每一个孔，取pLenti-Luc、 pGag-Pol、 pRev和pVSV-G各0.2吗， 一同加 入到无血清和抗生素的DMEM培养液中；取Lipof ectaraine 2000试剂1 W 加入到另外50W无血清和抗生素的DMEM培养液中；室温孵育5 min后将二者混合， 再于室温放置20 min;静置期间，用1 ml无血清和抗生素的DMEM培养液洗涤细胞， 总共洗涤3次，然后加入0. 5ml的含血清但不含双抗的匿EM培养液；最后将上述 Lipofectamine 2000和DNA的混合物滴加到培养板，每孔滴加放入含5% C02 的孵箱中于37'C培养。次日，对不同组别进行如下处理.-
甲组(AZT组)每孔加入终浓度为lpmol/L的抗HIV药物AZT。
乙组(维生素C对照药物VitC组)每孔加入终浓度为lpmol/L的维生素C。 丙组(阴性对照组)每孔加入10ri无菌去离子水。
继续培养2天后收集含有重组假型慢病毒的细胞培养液的上清进行步骤3的操作。
3、抗HIV的药物筛选
将新鲜的HEK 293FT细胞铺于一个新的24孔板，密度约5xl()S个细胞/孔。24 个孔分为3组(甲组、乙组、丙组)，每8个孔一组。将步骤2得到的甲、乙、丙 组含有假型病毒的细胞培养液上清，对应的加入新24孔板的甲、乙、丙组孔中， 每孔50(mi。次日，对不同组别进行如下处理
甲组(AZT组)每孔加入500Hl含lpmol/L AZT药物的新鲜培养基。 乙组(维生素C对照药物VitC组)每孔加入500W含lpmol/L维生素C的 新鲜培养基。
丙组(阴性对照组)每孔加入500W新鲜培养基。
两天后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，具体操作如下
收集细胞，用PBS漂洗，吸出PBS后加入10(^11X裂解缓冲液(CCLR)裂解细 胞，最后将细胞及所有液体移至新离心管，离心后取上清10ul加入50ul荧光素 酶检测底物，充分混合后，立即用照度计(Tuner Biosystem， luninoraeter)检测 荧光素酶活性。
甲组荧光素酶的活性为93584土6212;乙组荧光素酶的活性为193039士6343; 丙组荧光素酶的活性为197604±8492。
结果发现，甲组和丙组荧光素酶活性差异十分显著，表明AZT会抑制假型慢病 毒复制，最终导致第二代感染的细胞中报告基因luc表达的荧光素酶活性减弱。乙 组和丙组荧光素酶活性相似，表明维生素C不具备抑制假型慢病毒复制的能力。
上述结果说明，本发明的HIV药物筛选细胞模型可安全、灵敏进行体外HIV药 物筛选。
序列表
<110〉中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120〉 一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒
<130> CGGNARY81599
<160〉 6
〈210〉 1
<211〉 39
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 1
tatgaagctt ggatccgaat tcgggcccgt cgacggtac 39
<210〉 2
〈211〉 33
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 2
cgtcgacggg cccgaattcg gatccaagct tea 33
<210〉 3
〈211〉 28
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400〉 3
cggaattcgg agtgtattaa gcttgtgt 28
<210> 4
<211〉 28
<212> 腿 〈213〉人工序列
<400> 4
agggatccaa agagcagtgg gaatagga 28
<210〉 5
<211> 21
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400〉 5
catatgaggg acaattggag a 21
<210> 6
<211〉 25
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 6
ggagtgtatt aagcttgtgt aattg 2权利要求
1、表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒。
2、 如权利要求l所述的质粒，其特征在于所述重组表达质粒为图l所示的 pGag-Pol。
3、 一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒和表达 报告基因的重组慢病毒质粒。
4、 如权利要求3所述的混合质粒，其特征在于所述报告基因为荧光素酶基因。
5、 如权利要求3或4所述的混合质粒，其特征在于所述混合质粒还包括表达 HIV的Rev基因的重组表达质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质 粒。
6、 如权利要求5所述的混合质粒，其特征在于所述表达HIV的Gag基因和Pol 基因的重组表达质粒为图1所示的pGag-Pol;所述表达报告基因的重组慢病毒质粒为 图2所示的pLenti-Luc;所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒为图3所示的pRev， 所述表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒为pVSV-G。
7、 一种假型慢病毒，是通过如下方法得到的将权利要求5或6所述的混合质 粒共转染哺乳动物细胞，得到假型慢病毒；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、293T 细胞、293FT细胞或Hela细胞。
8、 含有权利要求7所述假型慢病毒的重组细胞。
9、 一种HIV药物筛选细胞模型，是用权利要求7所述假型慢病毒感染的哺乳动 物细胞；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。
10、 权利要求7所述假型慢病毒、权利要求9所述细胞模型在HIV药物筛选中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。本发明构建了表达HIV的Gag基因和Pol基因的重组表达质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达HIV Rev基因的重组质粒。将上述3种质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒共转染哺乳动物细胞，成功获得了假型慢病毒。将假型慢病毒感染哺乳动物细胞，可得到基于报告基因的HIV药物筛选细胞模型。本发明提供的药物筛选细胞模型，使用单次感染的病毒，具有良好的安全性，并且报告基因使该细胞模型具备极高的敏感性。
文档编号C12Q1/70GK101353666SQ20081011843
公开日2009年1月28日 申请日期2008年8月15日 优先权日2008年8月15日
发明者周育森, 安小平, 昕 张, 李敬云, 童贻刚 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所