专利名称：：一种快速从抗辐射菌中提取总rna的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
中提取RNA的方法，主要是一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，适用于此类细胞壁结构复杂的细菌的总RNA的提取。
背景技术：
：抗辐射菌"ey/wcocc^^^2'o^^朋s是一种革兰氏阴性的非孢子菌，对电离辐射、干燥、紫外线、强氧化剂和一些化学诱变剂有着极强的抗性。自从抗辐射菌被发现以来，就受到生物、医学和环境工程等领域的极大关注，纷纷从基因组学、蛋白组学水平对其进行研究。当前对小分子RNA的研究是生物学界的一项热点，要从这方面研究抗辐射菌Zfe/'"ococciWraA'ofl^i^/^,如何提取高质量的总RNA是关键。当前提取组织样本中的总RNA(核糖核酸)的基本方法主要有Trizol(RNA提取试剂)试剂盒、SDS(十二烷基硫酸钠)法、异硫氰酸胍法、CTAB(十六垸基三甲基溴化铵)法、苯酚法等。要提取组织样品中的总RNA,如何充分裂解组织样品的细胞壁是关键。对于动植物组织样本，一般采取液氮研磨的方式来帮助裂解组织；而对于一般的细胞和细菌样本，则采用直接加入Trizol等RNA提取剂提取。抗辐射菌"w7wcocc"sra^oo^r朋s的细胞壁可以划分为14-20nm的肽聚糖层和一个未知的分层结构，在电镜观察下，其结构至少可以分成六层。最初，人们认为抗辐射菌Zte化ococcMrsA'o^yra/^是革兰氏阳性菌，这是由于其细胞壁的肽聚糖层太厚且在革兰氏染色后难以脱色，显革兰氏阳性反应，实际上它的细胞壁成分和一般革兰氏阴性菌相似。抗辐射菌Zte&ococcwsra&'o^/rs/^的脂肪酸组成也与众不同，它既不含羟基脂肪酸、类脂以及庚糖、也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支脂肪酸，而是含有一个由15-、16-、17-以及18-碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混合物。这些就决定了按照一般的细菌的总KNA的提取方法是无法提取抗辐射菌Zfei/70coccwsra力'ofl^ra/w中的总RNA。
发明内容本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，一种能快速从抗辐射菌Zfei"ococcMra力'o^/ra/w中提取能满足下游分子生物学实验的高质量的总RNA的方法，整个实验过程快速便捷，提取的总RNA质量高，实验结果重复性好。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，包括以下步骤1)、材料指数生长期的抗辐射菌"e&ococcMra力'ooto"朋s;2)、提取总RNA:裂解加入500叱细胞裂解液(PH7-8)，涡旋混匀；加入12(3-200叫5Pmg/mL溶菌酶，5(TC保温15分钟。抽提加入lmLEzol(上海吉玛制药技术有限公司出品的一种RNA提取液)，室温裂解15分钟；加入200A氯仿，离心，取上清，然后加入1.5-2.5倍的异丙醇沉淀。样品的清洗和保存清洗RNA样品后加入DEPC水溶解，在-8CTC下保存。3)、RNA质量的检测通过NanoDropND-1000分光光度计(美国NanoDrop科技有限公司)和甲醛琼脂糖变性胶检测提取的总RNA的纯度、得率和完整性。在步聚2)中，加入的裂解液的pH为7.5，用量是500-1000yL/mL菌液。在步聚2)中，加入的溶菌酶的最终浓度是0.95mg/inL。在步聚2)中，加入的异丙醇的体积是上清液体积的2倍。本发明的有益效果本技术通过加入细胞裂解液和溶菌酶，使抗辐射菌Ztei"ococc^ra力'o&ra/:s的细胞壁得到了充分裂解，使在提取抗辐射菌Zte/"ococcf/sra力'o&ra/w总RNA的过程中免除了使用研钵研磨的过程，简化了实验过程，縮短操作时间，同时也避免了在研磨过程中发生的污染、氧化和总RNA的损失。该方法同时还适合细胞壁厚、成分复杂的细菌总RNA的提取。图1是本发明提取的抗辐射菌中总RNA的电泳图2是本发明提取总RNA后取RTPCR(反转录聚合酶链式反应)后的产物的电泳图；其中，图1上的2个样品是重复；图2中1:16SrRNA(16S核糖体核糖核酸)；2:SAMriboswitch(S-甲腺甲硫氨酸核开关)；3:PyrococcusC/DboxsmallnucleolarRNA(PyrococcusC/D方块小核仁RNA)。具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细描述这种快速从抗辐射齒Z^7ococc^ra必o^/r朋s中提取总RNA的方法，包括以下步骤1、取k)L指数生长期的抗辐射菌液入2niL离心管，室温下4,000rpm离心4分钟，去上清。力口500ML细胞裂解液，充分混匀，使菌悬浮在裂解液中，然后加入120-200PL50mg/inL溶菌酶，振荡混匀，50'C保温15分钟；注意上清要尽量去干净，细胞裂解液(pH7-8)的配方是10mMTris-HCl(pH7.5)(三羟甲基氨基甲垸-盐酸缓冲液)，10mMEDTA(pH8.0)(乙二胺四乙酸)，0.5%(g/v)SDS。溶菌酶的最终浓度是0.95-1.5mg/mL。2、加入lmLEzol，室温放置15分钟。在丄.5mL离心管中加入20Q"I氯仿，充分混匀，4'C,12，OOOXg,离心15分钟；3、取上清，加到一个新的EP管中，加入lmL异丙醇，充分混匀，-20'C沉淀过夜；注意异丙醇的最佳用量是取上清液的1.5-2.5倍。如果实验最终需要的是威NA，沉淀时间是2个小时左右，如果实验的目的是小RNA,则需要沉淀过夜。4、4'C,12,OOOXrpm，离心IO分钟，去上清，加lmL75%乙醇；4'C，7,500Xg,离心5分钟，去上清，真空干燥.溶T30叱DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水,待用。5、力B1叱样品溶液到NanoDropND-1000分光光度计中，测定其纯度；然后加入Wg左右的总RNA，W甲醛琼脂糖MOPS(3-吗啉丙磺酸)胶，60V,40分钟，检测其完整性。注意本实验中所用耗材均在O.On的DEPC水中浸泡过夜，然后120'C灭菌20分钟；DEPC处理水(RNaseFree)是将O.0W的DEPC水在37'C下放置16小时，然后120'C灭菌20分钟。经NanoDrop测定(表l)，本发明提取的总RNA的A260nm/A280nm的值为2.00左右，得率每微升菌能提取35ug左右的总RNA，这说明本发明提取的总RM的纯度很高。电泳结果(图l)表明，本发明提取的总RNA的23SrRNA(23S核糖体核糖核酸)、16SrMA和5SrRNA(5S核糖体核糖核酸)三条电泳条带清晰明亮，5S带浅，且23S/16S的亮度比大约为2:1,这表明本发明提取的总RNA是完整的、高质量的。将本发明提取的总RNA进行反转录聚合酶链式(RTPCR)反应，在200HLPCR管中加入2化经DNase1(脱氧核糖核酸酶1)(RnaseFree(无核糖核酸酶))处理总RNA，1叱反向引物，7MLDEPC水，70'C保温5分钟，然后冰上放置3分钟。再依次加入dNTP(脱氧核苷三磷酸)2HL、5XRTbuffer(5X反转录缓冲液)4Pi、RNaseinhibitor(核糖核酸酶抑制剂)1叱、Rtase(核糖核酸反转录酶)1A、DEPC水2叱，42。C保温60分钟，然后70。C放置10分钟，冰上放置3分钟。取O.4叱cDNA(互补脱氧核糖核酸)为模板进行PCR，反应条件是95°C5分钟；95°C15秒，60°C31秒，40个循环。然后将PCR产物进行2先琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。从电泳图上看出，条带大小和设计的目的片段相吻合，这说明本发明提取的总RNA符合下游分子生物学实验的要求。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。权利要求1、一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，其特征在于包括以下步骤1)材料指数生长期的抗辐射菌；2)RNA的提取裂解加入500μL细胞裂解液，涡旋混匀；加入120-200μL50mg/mL溶菌酶，50℃保温15分钟；抽提加入lmLEzol，室温裂解15分钟；加入200μL氯仿，离心，取上清，然后加入1.5-2.5倍的异丙醇沉淀过夜；样品的清洗和保存清洗RNA样品后加入DEPC水溶解，在-80℃下保存。2、根据权利要求1所述的快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，其特征在于在步聚2)中，加入的裂解液的pH为7.5，用量是500-1000uL/mL菌液。3、根据权利要求1所述的快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，其特征在于在步聚2)中，加入的溶菌酶的最终浓度是0.95mg/mL。4、根据权利要求1所述的快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，其特征在于在步聚2)中，加入的异丙醇的体积是上清液体积的2倍。全文摘要本发明涉及一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，该方法包括以下步聚1)材料指数生长期的抗辐射菌Deinococcusradiodurans；2)提取总RNA裂解加入500μL细胞裂解液，涡旋混匀；加入120-200μL50mg/mL溶菌酶，50℃保温15分钟；抽提加入1mLEzol，室温裂解15分钟；加入200μL氯仿，离心，取上清，然后加入1.5-2.5倍的异丙醇沉淀；样品的清洗和保存清洗RNA样品后加入DEPC水溶解，在-80℃下保存；3)RNA质量的检检测根据所得数据和电泳结果，表明所得总RNA的纯度高、产率高、完整性好。本发明有益的效果本发明实验过程快速、简洁、重复性好。该方法也适合于细胞壁结构复杂的细菌的总RNA的提取。文档编号C12P19/00GK101363038SQ20081012086公开日2009年2月11日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者丁先锋,徐根明,王星星,郭江峰申请人:浙江理工大学;郭江峰