专利名称：：用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列及其鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列及其鉴定方法。
背景技术：
：曲霉属真菌寄生曲霉(Apergz7/ws;"raw'"cw)和黄曲霉(A^"v附)表型特征相近且都可产生严重致癌代谢产物黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素Bl,其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的隐形杀手。目前对寄生曲霉和黄曲霉的鉴定十分困难，主要采用传统的形态学方法，根据分生孢子梗的排列方式、分生孢子的形状、分生孢子壁的厚度和光滑程度及菌落在一系列培养基(察氏培养基(CZ)、黄曲霉鉴别培养基(AFPA)和椰浆培养基(CCA))上的颜色和形态来加以鉴定区分。已有大量研究报道了产毒素黄曲霉菌抹的检测方法，但从未报道过寄生曲霉和黄曲霉的分子鉴定方法。传统的鉴定方法费时、费力。
发明内容本发明提供了用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，该引物特异性高，能够快速鉴定寄生曲霉和黄曲霉。用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:l所述的碱基序列，笫一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:4所述的碱基序列。寄生曲霉和黄曲霉共有糖利用基因簇中的g/W基因序列，而其它真菌没有该基因序列，第一组引物就^/"基因序列中部分序列，利用第一组引物对寄生曲霉和黄曲霉的基因组DNA进行PCR扩增，可得到745-bp的DNA片断，对其它真菌的DNA进行PCR扩增则不能得到任何DNA片断。寄生曲霉能产生Bl、B2、Gl和G2四种毒素，黄曲霉只能产生Bl和B2两种毒素，对产毒寄生曲霉和产毒黄曲霉的毒素合成基因簇进行研究发现，产毒黄曲霉中的毒素合成基因"oW、c》;/W或它们两者之间的间隔序列发生缺失，而产毒寄生曲霉则含有完整的毒素合成基因簇。如图1所示，产毒黄曲霉在"o^和cyp4间存在两种缺失类型(I和II):缺失类型I:产毒黄曲霉缺失的1-280位氨基酸、qy/W基因的1-112位氨基酸以及mr^和cy/W的间隔区。缺失类型II:产毒黄曲霉缺失wo^基因的1-181位和300-310位氨基酸、c用j基因的1-29位氨基酸和ww5和qyp^的间隔区(如图1所示)。第二组引物就是两种缺失类型产毒黄曲霉的共有缺失片段的部分序列，利用第二组引物对寄生曲霉基因组DNA进行PCR扩增，可以得到462-bp的DNA片段，对其它真菌或黄曲霉的DNA进行PCR扩增则不能得到任何DNA片断。本发明还提供了一种利用上述引物序列鉴定寄生曲霉和黄曲霉的方法，包括以下步骤(1)提取待测菌的DNA;(2)以待测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；(3)PCR产物凝胶电泳后用EB显色，根据凝胶上的DNA条带数量，判断待测菌的类型；当DNA条带数量为2时，判定待测菌为寄生曲霉；当DNA条带数量为1时，判定待测菌为黄曲霉；当DNA条带数量为0时，判定待测菌为其它真菌或细菌。本发明提供了用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，该序列特异性高，通过利用该引物序列通过PCR扩增鉴定寄生曲霉和黄曲霉，速度快，可靠性高，为研究黄曲霉毒素污染的土壤或农作物中两种真菌的分布和动态变化奠定理论基础，进而为黄曲霉毒素的治理提供科学依据。图l为本发明引物序列在"o"-c^B基因序列上的位置图谱；图2为特异性检测中各菌抹PCR扩增产物的凝胶电泳图"i普。具体实施方式所选菌林芸苔链格孢(兹e画"a6ra肌'認)、甘蓝链格孢(」.6ra咖'c/co/")、尖孢镰刀菌(Fw^Wwwcay^poraw)、禾谷镰刀菌(Egramz'"ean/m)、小麦纟丈枯病菌(i/z/zotow'"cere"/^)灰葡萄孢(^Bo/7fe"'werea)、指状青霉菌(Pew'c/〃/ww^g/tofww)、核果褐腐病菌(Mo"///"/a/n/"/co/a)以及3个寄生曲霉菌林(SD1-1、SX6-6和ZJHZ27)和5个黄曲霉菌抹(SD3-6、SD5-1、SX6-8、GS10-1和ZJHZ2)。上述菌株保藏于浙江大学生物技术研究所，也可通过常规的平板划线分离纯化得到，上述菌林只是作为实验材料，当然也可选择其它菌抹，对本发明实施没有影响。提取DNA用接种针从PDA平板上刮取菌丝(100mg)，置于1.5-mLEppendorf管中，加500pLDNA提取裂解液(200mMTris-HCl,50mMEDTA,20mMNaCl，l%SDS,pH8.0)，用电钻充分研磨，振荡混匀，室温静止10min;13200r/min4°C，离心5min;取上清液约400)iL于新的1.5-mLEppendorf管中，加750pL无水乙醇，混和混匀，13200r/min4°C，离心5min,弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min,溶于S0^iLTE(pH8.0),-20。C保存备用。上述的8种真菌以及寄生曲霉和黄曲霉的DNA均采用上述方法提取。引物合成根据寄生曲霉和黄曲霉共有糖利用基因簇中的g/"基因序列，设计了引物组GLF1和GLR1;如
发明内容中所述，相对于寄生曲霉的基因组DNA,黄曲霉的基因組DNA中的毒素合成基因"or5、和两者之间的间隔序列发生缺失，缺失类型分为两种，根据这两种缺失类型的共同缺失片断，设计了引物组NCF2和NCR2。上述引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述引物在"w^-c^B基因序列上物理位置如图l所示。上述序列的引物由上海博彩合成，也可通过常规的引物合成方法合成。菌林鉴定以上述所有菌抹的DNA为模板，用GLF1/GLR1和NCF2/NCR2两組引物进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照(用无菌水代替DNA模板)。25jiL反应体系1^LDNA模板(约0.4ng),引物各0.2pmol厂1，dNTP0.2^imol「、MgCl22mmoll"，lx緩冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶L5U个单位，双蒸水补足至25pL。反应条件为95。C预变性3min，94。C变性30s，56。C退火30s,72°C延伸30s,进行35个循环，最后72。C延伸5min。PCR产物用1.5。/。的琼脂糖在lxTAE緩沖液中电泳后，用EB(溴化乙锭))显色拍照。从电泳照片上看(如图2所示)，寄生曲霉的扩增产物经凝胶电泳后显色，凝胶上显现两条DNA条带，即745-bp和462-bp扩增产物；黄曲霉的扩增产物经凝胶电泳后显色，只显现一条DNA条带，即745-bp扩增产物，其它真菌的扩增产物经凝胶电泳后显色，凝胶上不显现DNA条带，即说明没有扩增到任何产物。SEQUENCELISTING<110>浙江大学<120>用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列及其鉴定方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>1aagacacagtcatcgcctgtt21<210>2<211>20<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>2acgcctttatcgagccaata20<210>3<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>3attcgccaaacatctctccgt21<210>4<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>4cacagtcaaggccaccaacaa2权利要求1、用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的碱基序列。2、一种鉴定寄生曲霉和黄曲霉的方法，包括以下步骤(1)提取待测菌的DNA;(2)以待测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；(3)PCR产物凝胶电泳后用EB显色，根据凝胶上的DNA条带数量，判断待测菌的类型；当DNA条带数量为2时，判定待测菌为寄生曲霉；当DNA条带数量为1时，判定待测菌为黄曲霉；当DNA条带数量为0时，判定待测菌为其它真菌或细菌。全文摘要本发明公开了一种用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的碱基序列。本发明引物列特异性高，通过利用该引物序列通过PCR扩增鉴定寄生曲霉和黄曲霉，速度快，可靠性高，为研究黄曲霉毒素污染的土壤或农作物中两种真菌的分布和动态变化奠定理论基础，进而为黄曲霉毒素的治理提供科学依据。文档编号C12Q1/04GK101376911SQ20081012149公开日2009年3月4日申请日期2008年10月8日优先权日2008年10月8日发明者尹燕妮,马忠华申请人:浙江大学