专利名称：：利用黑曲霉发酵花生根提取白藜芦醇的方法
技术领域：
：本发明公开了一种黑曲霉发酵花生根提取白藜声醇的新方法，属于利用植物提取天然产物的
技术领域：
。具体的说就是各种不同种类的植物，都可以利用黑曲霉发酵产生纤维素酶进行酶解提取天然产物。白藜,醇(又名芪三酚)，是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，在抑制癌细胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延缓衰老等方面有较显著的作用，被喻为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物；同时也被美国专著《抗衰老圣典》一书列为"ioo种最热门有效抗衰老物质之一"。我国花生资源极其丰富，是世界花生生产量最高、出口量最多的国家，占世界总量的i/3,然而花生作物特别是花生根利用率极低，几乎全部以固体废料被遗弃或被燃烧掉，造成资源的浪费和环境的污染，且近期的研究发现，花生根中含有丰富的白藜芦醇，因此以花生根为原料提取白藜,醇，既可以提高对花生的综合利用，增加其附加值，又可以拓宽白藜,醇原料来源，具有重要的现实意义。在白藜芦醇提取技术上，主要有有机溶剂提取技术、超临界C02提取技术、但有机溶剂提取白藜芦醇有以下缺点提取时间长，对热不稳定成分易被破坏，杂质含量高不易纯化，萃取溶剂消耗量大以及污染环境等。为解决上述问题，人们开始研究开发新型提取方法。超临界提取技术具有提取时间短、得到的产品纯度高，且对环境无污染等优点，但这种技术在生产应用上存在设备一次性投资大，维护费用高等缺点。酶法提取白藜芦醇具有提取条件温和、提取时间短、乙醇用量少等，但目前主要问题是商品酶的价格昂贵，且很难从反应混合物中回收有活性的酶以重复使用，增加了生产成本。
发明内容有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种花生根白藜芦醇提取的新方法,利用黑曲霉发酵花生根产生的纤维素酶来酶解花生根，破坏花生根的细胞壁，有利于白藜芦醇提取，大大提高了白藜芦醇的得率，且提取时间短，提取剂用量少；同时酶解所需的纤维素酶为花生根发酵所得，成本极低，解决了酶法提取中商品酶价格昂贵的问题，大大降低了生产成本。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的一种利用黑曲霉发酵提取白藜芦醇的方法，其特征在于利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇。比较理想的是其具体生产过程包括如下步骤(1)将黑曲霉菌液接种于灭菌后的花生根，3(TC培养3天；(2)将步骤(1)发酵所得的花生根加入乙醇提取白藜芦醇；(3)将步骤(2)的液料混合物真空抽滤，得提取液，提取液经真空旋转蒸发浓缩，回收乙醇，将浓缩液冷冻干燥，得白藜芦醇样品。本发明提供了一种花生根白藜芦醇提取的新方法，利用花生根中的纤维诱导黑曲霉发酵产生纤维素酶，并利用产生的纤维素酶来酶解花生根，破坏花生根中的细胞壁，有利于白藜芦醇的溶出。本方法具有酶法提取的优点提取条件温和、提取时间短、乙醇用量少，同时克服了使用商品酶价格昂贵的缺点，更符合工业化生产的需求。图1为乙醇浓度和提取温度对白藜芦醇提取影响；图2为乙醇浓度和提取时间对白藜芦醇提取率影响；图3为乙醇浓度和液固比对白藜,醇提取率影响；图4为提取温度和提取时间对白藜芦醇提取率影响；图5为提取温度和液固比对白藜芦醇提取率影响；图6为提取时间和液固比对白藜,醇提取率影响。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。实施例1在150ml的三角瓶中加入5g花生根，再加入15ml蒸馏水搅拌均匀，在0.15MPa下灭菌20min，冷却后加入2ml的菌液，搅拌均匀，于30。C培养3天。发酵后向三角瓶中再加入25ml蒸馏水，37。C浸提lh，过滤，滤液经冷冻离心得粗酶液，粗酶液经冷冻干燥即到粗酶粉。采用CMCase法测定其酶活大小，A锡，值为M2U/ml，说明黑曲霉发酵花生根可以产生纤维素酶。实施例2向6个150ml的三角瓶中分别加入5g花生根，再分别加入15ml蒸馏水搅拌均匀，在0.15MPa下灭菌20min,冷却后分别加入2ml的菌液，搅拌均匀，于3(TC培养3天。以3个发酵后的花生根为一组，分成两组。第一组分别加入加入33.3ml的pH4.5醋酸缓冲液,45。C反应60min,过滤，滤渣加入60%的乙醇50ml,5(TC提取40min,过滤,定溶到100ml,稀释20倍测A305nm,得平均值为0.669;向另一组中分别加入60%的乙醇50ml,50。C提取40min,过滤,定溶到100ml，稀释20倍测A3。5nm,得平均值为0.611。说明发酵后的花生根经过酶解反应和不经过酶解反应直接提取白藜芦醇，白藜芦醇的提取率差距不大，因此确定发酵后直接乙醇提取的方法。实施例3在前期单因素实验的基础上，对黑曲霉发酵后的花生根进行白藜芦醇提取工艺的优化。以发酵后的花生根提取液稀释20倍的吸光值A3()5nmx20作为响应值Y。试验釆用四因素五水平二次回归中心组合实验设计，选取乙醇浓度(X,)、提取温度(X2)、提取时间(X3)和液固比(X4)对提取率(Y)的影响，实验因素及水平见表1与表2,实验设计与结果见表3。实验设计与分析釆用Design-expert软件。表l因素水平编码<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2中心组合实验设计与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根据实验数据，对自变量编码XpX2、X3和X4进行回归分析，得二次多项回归方程为)Y:0.76+0.043X+0.016X2+0.019X3+0.018X4-0.019XX2隱0.033X,X3-0.025XjX4-4.625xio.3X2X3-0.028X2X4-0.011X3X4-0.030X!2-8.917xio.3X22-0.017X32-8.917x10—3X42通过Design-Expert软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著度，结果如下表3模型的ANOVE分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>由方差分析可以看出，模型Prob〉F值小于0.01,表明该模型方程高度显著，不同处理间的差异高度显著。模型失拟项的Prob〉F值为0.059>0.05，模型失拟项项不显著，模型选择合适。且模型相关系数112为94.89%，大于90%,说明模型拟合程度良好,试验误差小，该模型是合适的。变异系数反映模型的置信度，变异系数越低模型的置信度越好;本实验的变异系数为3.24%，说明模型方程能很好的反应真实的实验值。因此可以用该模型方程来分析和预测不同提取条件下花生根中白藜芦醇的提取率的变化。由表3的P值可以知道，方程中X,，X2，X3，X4,X,X2，X,X3，X,X4,X2X4，X/对Y值的影响高度显著，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，交互项和二次项都有显著影响。实施例4根据回归分析结果，作出乙醇浓度和提取温度对白藜芦醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图1。图1可以看出，乙醇浓度和提取温度交互作用对白藜声醇提取影响显著。在提取温度较低时，随着乙醇浓度的增加白藜芦醇的提取率逐渐增加；当温度增高后，乙醇浓度增大到61-63%时，总提取率达到最大，再增大乙醇浓度，提取率反而下降，分析原因可能是在高温高浓度乙醇条件下，花生根中一些醇溶性杂质溶解量增大，这些物质与白藜芦醇竟争同乙醇-水分子的结合，从而导致白藜F醇提取率降低。实施例5根据回归分析结果，作出乙醇浓度和提取时间对白藜声醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图2。从图2可以看出，乙醇浓度和提取时间交互作用对白藜芦醇提取影响显著。在乙醇浓度较低时，提取率随着提取时间的延长而增加；但当乙醇达到一定浓度时，提取时间在55min左右提取效果最好，再延长提取时间，提取效果反而下降，其原因可能是白藜芦醇为热不稳定性物质，提取时间越长，分解的越多。实施例6根据回归分析结果，作出乙醇浓度和液固比对白藜芦醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图3。从图3中可以看出，乙醇浓度和料液比的交互作用对白藜芦醇提取影响显著。在乙醇浓度较低时，提取率随着液固比的增加而增加；但当乙醇达到一定浓度时，液固比在10:l左右提取效果最好，再增加提取溶剂的量，提取效果反而下降。实施例7根据回归分析结果，作出提取温度和提取时间对白藜芦醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图4。从图4中可以看出，提取温度和提取时间的交互作用对白藜芦醇的提取影响不显著。当提取时间固定时，提取率随着提取温度的升高增加，温度增加到59t:左右时提取率达到最高，之后提取率下降。当提取温度固定时，提取率随着提取时间的增加而增加68min达到，时间再延长，提取率反而下降。实施例8根据回归分析结果，作出提取时间和液固比对白藜声醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图5。从图5中可以看出，提取温度和提取时间的交互作用对白藜声醇的提取影响显著。当液固比较小时，提取率随着提取温度的增加而增加；当液固比较大时，提取率随着提取温度的增加是先增加后减少；但当液固比达到最大时，提取率随着提取温度的增加而减少实施例9根据回归分析结果，作出提取温度和液固比对白藜芦醇提取影响的响应面和等高线图，其结果见图6。从图中6可以看出，提取时间和液固比的交互作用对白藜,醇的提取影响不显著。当提取时间固定时，提取率随着液固比的增大而增加，液固比增大到12:1左右时，提取率达到最高，之后提取率下降。当液固比固定时，提取率随着提取时间的增加而增加，在66min左右达到，时间再延长，提取率反而下降。实施例10进一步用Design-Expert软件对实验模型进行典型性分析，以获得最优的提取条件。经分析得，在X产0.85，X产1.00,Xf-0.06,X4二1.00即在乙醇浓度为64.25%,提取温度为55°C，提取时间为59.55min，液固比8:1,得到理论最大值(A鄉腦x20)为0.78306。为了验证响应面法的可行性，采用得到的最佳提取条件进行白藜,醇提取实验，同时考虑到实际操作和生产的便利性，将提取条件修正为乙醇浓度64%，提取温度55'C，提取时间60min，液固比为8:1。3次平行实验得到的实际平均值(A，加x20)为0.759,白藜芦醇提取率为0.191%，与理论值相差3.07%。因此响应面法对花生根白藜芦醇提取条件的优化是可行的，得到的白藜,醇提取条件具有实际应用价值。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。权利要求1、一种利用黑曲霉发酵花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇。2、如权利要求1所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将黑曲霉菌液接种于灭菌后的花生根中，30。C培养3天；(2)将步骤(1)发酵所得的花生根加入乙醇提取白藜芦醇；(3)将步骤(2)的液料混合物真空抽滤，得提取液，提取液经真空旋转蒸发浓缩，回收乙醇，将浓缩液冷冻干燥，得白藜芦醇样品。3、如权利要求2所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜声醇的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的黑曲霉菌液的制备方法为将斜面培养基上的黑曲霉孢子用无菌水淋洗制成悬浮液，再接入装有100mlPDY培养基中，于25。C150r/min培养3d。4、如权利要求2或3所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于所述的提取剂乙醇的浓度为64%。5、如权利要求2或3所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于所述的提取温度为55°C。6、如权利要求2或3所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于所述的提取时间为60min。7、如权利要求2或3所述的利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇的方法，其特征在于所述的提取液料比为8:1。全文摘要本发明公开了一种黑曲霉发酵花生根提取白藜芦醇的新方法，属于利用绿色植物提取天然产物的
技术领域：
，其特征在于利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇。本发明的优点在于利用花生根黑曲霉发酵产生的纤维素酶代替商品纤维素酶进行酶法提取，且利用酶法提取白藜芦醇提取时间短，提取条件温和，极大的提高了白藜芦醇得率，极大地降低了白藜芦醇的生产成本，更适合大规模化工业生产。文档编号C12P7/22GK101353675SQ20081014743公开日2009年1月28日申请日期2008年8月15日优先权日2008年8月15日发明者张初署,杨庆利,潘丽娟,禹山林申请人:山东省花生研究所