专利名称：一种快速诊断唐氏综合征的方法
一种快速诊断唐氏综合征的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，特别是一种扩增21号染色体上D21S1440、D21Sll和PentaD3个STR基因座诊断唐氏综合征的方法。
背景技术：
唐氏综合征(Down's syndrome, DS)又称21-三体综合征，是人类最常见的染色体病。主要表现为智力低下，常合并多种畸形，生活基本不能自理。我国每年大约有26 600个DS患儿出生，平均每20分钟出生一个，每出生1例DS患儿大约给社会造成几十万元的经济负担，我国每年治疗DS的总费用超过25亿元人民币。迄今医学上尚无根治DS方法。降低DS患儿出生率的有效方法是产前诊断。通过产前诊断发现DS患儿，积极采取干预措施，避免DS患儿的出生。
由于DS筛查的普及，使产前诊断的需求呈明显上升的趋势。天津市2007年有近60 000例孕妇进行DS筛査，有3 600例左右孕妇需进行产前诊断一羊水细胞染色体检査。但实际羊水细胞染色体检査例数只有1 000例左右，检出染色体病胎儿20余例。也就是说有2 600例孕妇因未做羊水细胞染色体，而导致50余例DS患儿出生。羊水细胞染色体检查率低的原因除与孕妇的经济状况、对羊膜腔穿刺并发症的恐惧心理有关外，还与羊水细胞染色体报告时间过长有关。因为羊水细胞染色体的检测需要10 14天的细胞培养，21 28天方可出诊断报告，而且技术要求高，有培养失败的可能性。现有的细胞遗传学方法已不能满足日益增长的产前诊断需要。这就要求我们建立一种适合本民族的快速产前诊断DS的方法，与细胞遗传学互补，提高产前诊断率，真正做到防止先天缺陷儿的出生，降低我国人口出生缺陷率，提高我国人口素质。
已知机体的各种有核细胞均有人类全套基因组DNA，而基因组中含有大量的重复序列，其中不少是短串联重复序列(Short Tandem Repeat, STR )。 STR基因座数量多、稳定具有高度多态性，可提供较多的遗传信息量，而且在上下代的传递过程中遵循孟德尔共显性遗传定律；STR基因座具有种族的差异；STR基因座的每一个基因代表着一条染色体，是目前检测染色体数目异常最合适的遗传学标记。国外己将扩增STR基因座作为诊断DS的方法之一。但由于STR基因座具有种族的
4差异，而且我国汉族群体占91.6。/。，因此有必要建立中国汉族群体扩增STR基因座诊断DS的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速诊断唐氏综合征的方法。该方法是扩增21号染色体D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座，测序胶检测扩增产物，通过对扩增产物条带及面积的分析达到诊断DS的目的。
本发明为实现上述目的所采用的方案是设计一种扩增21号染色体D21S1440、D21Sll和PentaD STR基因座诊断DS的方法。其特征在于所述方法包括
(1) 用常规方法采集样本，于一20'C保存备用；所述样本是羊水样本、绒毛样本或外周血样本；
(2) 提取样本中的DNA ，其中外周血样本采用DNA提取试剂盒进行DNA提取；羊水样本或绒毛样本采用盐析法进行DNA提取；
(3) 选择与合成引物，其中
a. D21S1440引物序列
f-F AM-GAGTTTGA AAAT AAAGTGTTCTGC;r-CCCC ACCCCTTTT AGTTTT A;扩增产物为157 175bp;
b. D21S11引物序列
f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC;扩增产物为172 260bp;
c. PentaD引物序歹!j:
f隱FAM -GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;r- CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT;扩增产物为398bp 433bp;
5(4) PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板，在9600 PCR仪上进行扩增；反应体系为25^L 50pL，其中模板0.2 0.4pL其终浓度0.6ng， dNTPs 0.5pL l.(VL其终浓度0.2mmol/L， T叫酶0.5^L l.OpL其终浓度0.04 U/pL， 10xPCR buffer 2.5pL 5.0pL其终浓度lxPCR buffer,引物f-FAM 0.03pL 0.06^L其终浓度0.12拜ol/L，引物r 0.03^L 0.06nL其终浓度0.12|xmol/L，最后补充ddH20至25pL 5(^L。
(5) PCR扩增产物的检测
采用ABI PRISM 377测序电泳、GeneScan 3.1软件及核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析扩增产物，对电泳条带进行峰面积定量检测。
本发明扩增D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座诊断DS的方法，用以联
合应用诊断DS。
本发明将DNA模板通过D21S1440、 D21S1 l和PentaD荧光引物进行PCR扩增，
荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过荧光的采集、分析和对扩增产物条带进行峰面积定量，实现对原始模板量的定量。应用D21S1440、 D21Sll和PentaD扩增进行DS的基因诊断时，染色体iH常样本扩增可出现2种情况杂合子显示2条带/峰，0.7《峰下面积比值《1.4;纯合子显示l条带/峰，峰面积与杂合子的比值〉1.4。DS个体样本扩增可出现3种情况(1)任何1个基因座在目标片段范围内出现3条带/峰；(2)在目标片段范围内出现2条带/峰，峰下面积比值<0.7或>1.4; (3)在目标片段范围内出现l条带/峰，峰面积相当于杂合子的3倍。
本发明应用QF-PCR扩增D21S1440、 D21Sll和PeritaD STR基因座产前诊断DS，与染色体核型分析相比有以下优势(1)快速， 一般24 48小时即可得出结果，而通过染色体核型分析一般3 4周。(2)灵敏度为100%，特异度为97.39%。(3)取材少，0.5 3mL羊水即可以用于诊断，而染色体核型分析需用羊水20mL左右。(4)可以对大批量标本同时进行诊断，结果分析省时省力。(5)通过比较母亲和胎儿的扩增结果，可以对母血污染的样本做出正确诊断。(6)可以区分单卵双胎和双卵双胎。(7)可以对多种样本包括上皮细胞、性腺细胞等进行分析，而且适用于少量及微量的DNA样本，如孕妇外周血中胎儿细胞、卵裂球、极体和经宫颈富集的胎儿细胞等。
应用QF-PCR扩增STR基因座具有精确度高、自动进样和结果数据化等优势，是大规模产前诊断DS的理想工具。
图1为D21S1440 STR基因座电泳图2a泳道l迁移率曲线图2b泳道l峰面积定量图3a泳道5迁移率曲线图3b泳道5峰面积定量图4为DS个体D21S1440 STR基因座电泳图;
图5a泳道4迁移率曲线图5b泳道4峰面积定量图6a泳道5迁移率曲线图6b泳道5峰面积定量图7 为D21S11 STR基因座电泳图8a泳道4迁移率曲线图8b泳道4峰面积定量图9a泳道2迁移率曲线图9b泳道2峰面积定量图IO DS个体D21S11 STR基因座电泳图lla泳道3迁移率曲线图llb泳道3峰面积定量图12a泳道2迁移率曲线图12b泳道2峰面积定量图13 PentaD STR基因座电泳图；图14a泳道4迁移率曲线图；图14b泳道4峰面积定量图；图15a泳道5迁移率曲线图；图15b泳道5峰面积定量图16 DS个体PentaD STR基因座电泳图； 图17a泳道5迁移率曲线图； 图17b泳道5峰面积定量图； 图18a泳道4迁移率曲线图； 图18b泳道4峰面积定量图。
以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。
具体实施方式
本发明选取汉族个体719例，包括外周血样本389例、羊水样本282例和绒毛样 本48例。719例样本经细胞遗传学确诊DS67例，652例染色体核型分析正常。
实验方法
(一) 样本采集
1. 羊水样本按常规方法经腹抽取2~3 mL羊水一2(TC保存备用；或8 000rpm 离心5min，细胞沉淀用80%乙醇固定，一20'C保存备用。
2. 绒毛样本按常规方法经阴道取10 20mg绒毛，Hank's平衡溶液漂洗后， 一2(TC保存备用。
3. 外周血样本取静脉血2mL于EDTA-抗凝管中；或取200pL EDTA-抗凝 血按本室常规方法提取白细胞(white blood cell， WBC) ， 一20'C保存备用。
(二) DNA提取
1.外周血样本均采用DNA提取试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司出 售)，提取过程按说明书进行。其过程如下
(1) 取200pL分离好的WBC, 8 000rpm离心3min，弃上清，生理盐水洗涤 沉淀一次。
(2) 加入300nL 5mol/L异硫氰酸胍，用移液器反复吸打沉淀物4~6次，加 入10nLRNaseA， 37°C温浴10min。
(3) 加入800pL 4 mol/L NaC104 (PH: 5.2) ， 20pL Resin混匀，室温5min。
(4) 8 000rpm离心30s，弃上清。
(5) 加入500pL 200mM NaCl、 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 、 10mM EDTA、 无水乙醇的混合液，混匀，一20。C放置20min， 8 000rpm离心60s，弃上清。
8(6) 重复步骤(5)。
(7) 12 000rpm离心30s，吸干剩余液体，室温放置5-10min。
(8) 加入50~100(iL TE Buffer,混匀，50。C保温10min， 12 000 rpm离心60s， 吸取上清，即为基因组DNA。
2.羊水及绒毛样本均采用盐析法提取DNA。其过程如下
(1) 样本处理取100laL80X乙醇固定的羊水细胞悬浮液，8 000rpm离心 5min，弃上清，生理盐水洗涤沉淀2次；新鲜及冻存的羊水则直接取1 1.5mL， 12 000rpm离心10min，弃上清，生理盐水洗涤沉淀2次；挑取10~20mg绒毛样本 在Hank's液中漂洗去除血污后置于离心管中，生理盐水洗涤2次。
(2) 加入300nL STE溶液，充分混匀后分别加入30pLSDS溶液和20(iL蛋 白酶K溶液。
(3) 混匀后5(TC恒温水浴2.5~3h，至细胞完全融解，其间颠倒混匀数次。
(4) 自然冷却至室温，加入1/3体积的过饱和NaCl溶液(约llOpL)，强 烈振荡数次，5 OOOrpm离心15min。
(5) 转移上清至一新离心管中，加入等体积CHC13 (约40(HiL)，混匀后 8 OOOrpm离心15min。
(6) 转移水相至一新离心管中，加入2倍体积一20。C预冷的无水乙醇，一2(TC 冷冻至少2h， 12 000rpm离心30min，弃上清。
(7) 75%乙醇洗涤沉淀1次，12 000rpm离心15min，弃上清，沉淀即为所 需DNA，过夜晾干。
(8) 加15~30|iLTE Buffer溶解沉淀。
所有提取的基因组DNA用2.5%琼脂糖凝胶以100V电压电泳25min，以 1 OOObp DNA Marker为片段长度标记，确定标本DNA质量和浓度。提取的DNA 于一20'C冰箱保存备用。
(三)引物的选择与合成
经过21号染色体上D21S1440、D21Sll、PentaD、D21S258、D21S212、D21S210 和D21S215等7个STR基因座的筛选，确定D21S1440、 D21S11、 Penta D 3个 STR基因座为诊断DS的候选基因座。根据GDB人类基因组数据库和文献报道， 确定D21S1440、 D21S11和PentaD 3个STR基因座的引物序列，正向引物5，-端 均由荧光染料5-羧基-荧光素(caboxyfluorescein國5-succimidyl ester， FAM)标记， 由北京鼎国生物技术有限责任公司合成。
9200810152923.31. D21S1440:定位于21q22.3， GDB: 684003，扩增产物为157 175bp 引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC;
r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA
2. D21S11:定位于21q21.1, GDB: 188664，扩增产物为172 260bp 引物序列f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;
r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC
3. PentaD:定位于21q，扩增产物为398bp 433bp
弓I物序列f- FAM隱GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;
r隱CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT (四)PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板，在9600 PCR仪上进行扩增。反应体系为 25nL~50pL。反应组分见表l。
表l PCR扩增体系
反应组分加样体积(pL)终浓度
模板0.2-0.40.6ng
dNTPs(10mM)0.5-1.00.2 mmol/L
Taq酶(2U/(iL)0.5-1.00.04 U/|iL
10xPCR buffer2.5-5.01 xPCR buffer
引物f-F AM0.03-0.060.12nmol/L
引物r (lOOpM)0.03-0.060.12|imol/L
ddH20补充体系至 25-5(^L
PCR扩增条件如下
预变性93°C~95°C 2min;变性93°C~95°C 30s，退火58°C~62°C 30s，延伸 72°C lmin共32个循环；延伸72°C 5min后6(TC保温30min， 4。C保存。
每次PCR反应均设空白对照，所有操作均戴一次性手套在冰浴上进行，所有 耗材均在高压灭菌后一次性使用。 (五)PCR扩增产物的检测
PCR扩增产物采用ABI PRISM 377测序电泳检测。
1.预电泳20 30min至胶的温度达到40°C。2. 取l^L的扩增产物与lpL内标混匀，95 'C变性2min，立即放在碎冰上冷 却，尽快取lpL上样。
3. 1 200V电泳2.5h。
4. 电泳结束后，打开胶图(胶图由测序仪软件自动生成)，即可分析结果。
1. 结果分析用GeneScan 3.1软件进行电泳数据分析。用GSG-核酸/蛋白凝 胶图像分析管理系统对电泳条带进行峰面积定量检测。所有操作均按操作指南进 行。
2. DS诊断标准
(1) 任何1个基因座在目标片段范围内出现3条带，经核酸/蛋白凝胶图像 分析管理系统分析可见3个峰，即可诊断DS。
(2) 在目标片段范围内出现2条带，经核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分 析可见峰下面积比值<0.7或>1.4的2个峰，可辅助诊断DS。
(3) 若在目标片段范围内出现1条带，则不能诊断DS。
本发明实验719例样本，D21S1440、 D21S11和Penta D 3个STR基因座均扩 增成功，扩增产物为156 438bp，与GDB人类基因组数据库和文献报道相符。 一、D21S1440 STR基因座结果分析
719例样本中染色体核型分析正常的652例，有645例电泳结果表现为2条 带/峰，0.7《峰下面积比值《1.4，或1条带，峰下面积与正常杂合子峰下面积比 M.4(见图l 3b);有7例出现3条带，为假阳性。
图1可见泳道1、 3、 4显示1条带；泳道2、 5可见2条带。图2a可见对应 泳道1的电泳条带显示1个峰，图2b显示峰下面积为l，为纯合子；图3a可见对 应泳道5显示2个峰，图3b显示峰下面积44.74/55.26，为杂合子。
67例染色体核型分析确诊为DS的样本，有21例样本出现3条带，峰面积均 值分别为32.72±3.63、 34.54±2.04和32.74±3.50; 27例样本出现2条带，峰面积均 值分别为66.06士2.84和34.12±2.77，其比值为1.96土0.24; 19例样本出现1条带。 48例可诊断为DS。
扩增D21S1440 STR基因座诊断DS的灵敏度为71.64% (48/67)，特异度为 98.93% (645/652)。
D21S1440 STR基因座峰面积定量数据见表2 3，电泳图及迁移率、峰面积定 量曲线图见图4~6b。
11表2 D21S1440 STR基因座21例3条带样本峰面积定量数据(％ )
样本号条带l条带2条带3样本号条带l条带2条带3
376333.2636.1330.61353732.2537.2330.52
379423.2735.0641.67365832.0833.2934.63
387129.3233.4937.19334532.0932.5330.75
386636.4135.2628.33071632.7535.4332.48
363030.6238.3431.04372836.7135.4231.83
352633.5736.0830.53373330.2632.2231.07
360833.4236.8329.75071739.636.5833.16
352335.2830.0934.63368836.7232.0828.32
364136.8233.0930.09376232.5833.9733.45
羊水230.6833.5935.73羊水432.2435.6632.10
羊水827.2933.0439.67
表3 D21S1440 STR基因座27例2条带样本峰面积定量数据(％)
样本号条带l条带2比值样本号条带l条带2比值
378465.3934.611.89387068.1631.842.14
375968.331.72,15071266,7133.292.00
378266.5433.461.99071369.3230.682.26
380665.1534.851.87377862.9337.071.70
380570.2729.732.36352262.3537.651.66
376463.4936.511.74354967.5532.452.08
376269.3230.682.26364570.0629.942.34
380863.1236.881.71324062.9437.061.70
381267.1432.862.04364966.3933.611,98
383563.2836.721.72355263.4836.521.74
385869.0330.972.23071863,7736.231.76
383062.7437.261.68羊水l61.0338.971.57
羊水369,4435.361.97羊水569.9530.052.33
羊水765.7334.271.92
图4可见泳道1、 3显示1条带；泳道2、 4可见2条带；泳道5可见3条带。 图5a可见对应泳道4的电泳条带显示2个峰，图5b显示峰下面积65.15/34.85; 图6a可见对应泳道5显示3个峰，图6b显示峰下面积23.27/35.06/41.67。
二、D21SU STR基因座结果分析
719例样本中染色体核型分析正常的652例，有643例电泳结果表现2条带/
12峰、0.7《峰下面积比值《1.4，或1条带、峰下面积与正常杂合子峰下面积比>1.4 (见图7 9b);有9例出现3条带，为假阳性。
图7可见泳道1、 4显示1条带；泳道2、 3、 5可见2条带。图8a可见对应 泳道4的电泳条带显示1个峰，图8b显示显示峰下面积为1，为纯合子；图9a 可见对应泳道2显示2个峰，图9b显示峰下面积41.49/58.51，为杂合子。
67例染色体核型分析确诊为DS的样本，有18例样本出现3条带，峰面积 均值分别为33.53±3.24、 34.11±3.10和32.36士3.36; 33例样本出现2条带，峰面积 均值分别为65.79±3.02和34.21±3.02，其比值为1.95士0.26; 16例样本出现1条带。 51例可诊断为DS。
扩增D21S11 STR基因座诊断DS的灵敏度为76.12% (51/67)，特异度为 98.62% (643/652)。
D21S11 STR基因座峰面积定量数据见表4-5，电泳图及迁移率/峰面积定量 曲线图见图10~12b。
表4 D21S11 STR基因座18例3条带样本峰面积定量数据(％)
样本号条带l条带2条带3样本号条带l条带2条带3
378929.3632.5538.09377836.4433.0730.49
380532.9733.4933.54352631.9836.5431.48
380233.9632.8333.21355226.8839.1433.98
380135.4436.5827.98364232.4635.8131.73
383535.1129,8435.05368532,4840.5326.99
383033.0635.8731,07071734.1330.9234.95
071230.2832.0937.63071838.4433.9127.65
071338.4928.4333.08羊水530.0333.3136.66
羊水833.4336.4230.15羊水938.5732.6228.81
表5 D21SU STR基因座33例2条带样本峰面积定量数据(％)样本号条带l条带2比值样本号条带1条带2比值
375866.3933.611.98360869.8830,122.32
377271.4328.572.50357968.5131.492.18
380665.4234.581.89361461.8138.191.62
379462.1337.871.64352867.3232.682.06
376464.1135.891.79364568.1331.872.14
376260.9239.081.56352366.4233.581.98
380860.1739.831.51324064.2535.751.80
13387268.5331.472.18364964.5935.411.82
385869.8130.192.31364166.7133.292.00
387162.9537.051.70353769.3230.682.26
385565.0234.981.86365865.4934.511.90
387061.9838.021.63071570.1629.842.35
071469.1330.872.24374166.3133.691.97
352269.3730.632.26373367.0632.942.04
354965.0834.921.86羊水l62.5737.431.67
羊水364.5935.411.82羊水462.0437.961.63
绒毛l63.5436.461.74.
图10可见泳道5显示1条带；泳道1、 3、 4可见2条带；泳道2可见3条 带。图lla可见对应泳道3的电泳条带显示2个峰，图lib显示峰下面积 64.11/35.89;图12a可见对应泳道2显示3个峰，图12b显示峰下面积 33.96/32.83/33.21。
三、PentaDSTR基因座
719例样本中染色体核型分析正常的652例，有651例电泳结果表现2条带/ 峰，0.7《峰下面积比值《1.4;或1条带，峰下面积与正常杂合子峰下面积比〉 1.4(见图13~15);有1例出现3条带，为假阳性。
图13可见泳道4显示1条带；泳道1、 2、 3、 5可见2条带。图14a可见对 应泳道4的电泳条带显示1个峰，图14 b显示显示峰下面积为1，为纯合子；图 15a可见对应泳道5显示2个峰，图15b显示峰下面积52.8/47.2，为杂合子。
67例染色体核型分析确诊为DS的样本，有26例出现3条带，峰面积均值 分别为33.55±4.06、 33.35士2.42和33.33±3.88; 34例样本出现2条带，峰面积均值 分别为65.55±3.02和34.45±3.02，其比值为1.92±0.26; 7例样本出现1条带。60 例可诊断为DS。
扩增Penta D STR基因座诊断DS的灵敏度为89.55% (60/67)，特异度为 99.85% (651/652)。
Penta D STR基因座峰面积定量数据见表6~7，电泳图及迁移率/峰面积定量 曲线图见图16~18b。
表6 Penta D STR基因座26例3条带样本峰面积定量数据(％ )样本号条带l条带2条带3样本号条带l条带2.条带3
378440.0232.4327.55354936.2935.1730.94
375932.0727.6640.29363738.4132.7730.96
378926.9433.9539.11357938.4730.6324.95
376224.5935.7239.69352828.7636.5834.42
380832.5430.6836.28355230.4436.8231.64
380139.4733.2827.25364130.6937.9235.59
385839.4028.7331.87071536.5333.7233.03
386635.2933.0631 65372835.1430.4432.09
383035.7732.5931.64071730.7832.7732.95
377831.3932.7735.84368837.2636.2729.27
363029.4433邻36.58352233.49334331.34
羊水l33.0833.9532.97羊水733.0833.9539.13
羊水929.7835.2235.0绒毛l33.0832.4934.43
表7 PentaD STR基因座34例2条带样本峰面积定量数据(％ )样本号条带l条带2比值样本号条带l条带2比值
376368.4831.522.17071367.5132.492.08
378267.1632.842.04071469.3730.632.26
377265.7434.261.92352669.3330.672.26
380659.7340.271.48360863.7236.281-76
379468.5931.412.18361463.7736.231.76
380560.9439.061.56364561.8738.131.62
380266.3233.681.97352366.5833.421.99
381260.5839.421.54324070.3329.672.37
387263.5936.411.75353765.7434.261.92
386762.4737.531.66334567.2832.722.06
383564.8935.111.85071669.0830.922.23
387161.4938.511.6037"71.5328.472.51
385567.0632.942.04368568.7331.272.20
387064.9335.071.85376264.7735.231.84
071264.1135.891.79羊水261.8038.201.62
15羊水3 66.8433.16 2.02羊水4 63.5436.46 1.74
羊水5 67.3232.68 2.06羊水6 63.4936.51 1.74
图16可见泳道3显示1条带；泳道1、 5可见2条带；泳道2、 4可见3条 带。图17a可见对应泳道5的电泳条带显示2个峰，图17b显示峰下面积 67.16/32.84:图18a可见对应泳道4显示3个峰，图18b显示峰下面积 26.94/33.95/39.11。
四、联合D21S1440、 D21S11和PentaD3个STR基因座 719例样本中染色体核型分析正常的652例，17例样本出现3条带，为假阳 性；67例DS样本均得到诊断，53例样本出现3条带，14例样本出现2条带/峰， 0.7〉峰下面积比值>1.4。
扩增D21S1440、 D21S11和Penta D STR基因座诊断DS的灵敏度为 100%(67/67)，特异度为97.39%(635/652)。
16序列表
<110>天津医科大学总医院
<120> —种快速诊断唐氏综合征的方法
<160〉 6
<210〉 1 <211>24 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(24)
<400> 1
gagtttgaaa ataaagtgtt ctgc 24
<210〉2 <211>20 <212〉DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(20)
<400> 2
ccccacccct tttagtttta 20
<210> 3 <211>8 <212> DNA <213>人工序列
<220〉
<221> gene
<222〉 (1)…(18)
<400> 3
gtgagtcaat tccccaag 18
17<210> 4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(22)
<400> 4
gttgtattag tcaatgttct cc 22
<210>5 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(19)
<400> 5
gaaggtcgaa gctgaagtg 19
<210〉6 <211>25 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(25)
<400> 6
cttgtgtcca gattaaagaa ttctt 25
18
权利要求
1、一种快速诊断唐氏综合征的方法，其特征在于所述方法包括(1)用常规方法采集样本，于-20℃保存备用；所述样本是羊水样本、绒毛样本或外周血样本；(2)提取样本中的DNA，其中外周血样本采用DNA提取试剂盒进行DNA提取；羊水样本或绒毛样本采用盐析法进行DNA提取；(3)选择与合成引物，其中a.D21S1440引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC；r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA；扩增产物为157～175bp；b.D21S11引物序列f-FAM-GTGAGTCAATTCCCCAAG；r-GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC；扩增产物为172～260bp；c.Penta D引物序列f-FAM-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG；r-CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT；扩增产物为398bp～433bp；(4)PCR扩增以提取的基因组DNA为模板，在9600PCR仪上进行扩增；反应体系为25μL～50μL，其中模板0.2～0.4μL其终浓度0.6ng，dNTPs 0.5μL～1.0μL其终浓度0.2mmol/L，Taq酶0.5μL～1.0μL其终浓度0.04U/μL，10×PCR buffer 2.5μL～5.0μL其终浓度1×PCR buffer，引物f-FAM 0.03μL～0.06μL其终浓度0.12μmol/L，引物r 0.03μL～0.06μL其终浓度0.12μmol/L，最后补充ddH2O至25μL～50μL；(5)PCR扩增产物的检测采用ABI PRISM 377测序电泳、GeneScan 3.1软件及核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析扩增产物，对电泳条带进行峰面积定量检测。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下-预变性93 'C~95 °C 2 min;变性93 °C~95 °C 30 s，退火58 °C~62 °C 30 s， 延伸72 °C 1 min共32个循环；延伸72 °C 5 min后60 'C保温30 min， 4'C保存。
3、 一种权利要求l所述的快速诊断唐氏综合征的方法，用以联合应用诊断唐 氏综合征。
全文摘要
本发明是一种扩增D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座诊断唐氏综合征的方法。该方法是扩增21号染色体D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座，测序胶检测扩增产物，通过对扩增产物条带及面积的分析达到诊断唐氏综合征的目的。本发明的方法与染色体核型分析相比具有以下优点快速；灵敏度、特异度高；取材少；可以对大批量样本同时进行诊断，结果分析省时省力等。应用QF-PCR扩增STR基因座方法快速、精确度高、自动进样和结果数据化等优势，是大规模产前诊断唐氏综合征的理想工具。
文档编号C12Q1/68GK101492730SQ20081015292
公开日2009年7月29日 申请日期2008年11月11日 优先权日2008年11月11日 公开号200810152923.发明者史云芳, 璐 孙, 岳天孚, 颖 张, 张秀玲, 岩 李, 李晓洲, 侃 王 申请人:天津医科大学总医院