专利名称：：一种肠道乳酸杆菌培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物技术，特别涉及一种肠道乳酸杆菌培养方法。
背景技术：
：在人体的肠道内栖息着大约1014个约400500种细菌，是人体细胞总数的1020倍。肠道内的细菌对人体肠道的生长发育、免疫功能、消化吸收等功能起着重要的作用。为了更好的研究肠道正常菌群的功能以及与机体的相互关系，对肠道内细菌的分离、鉴定和定量非常重要。到目前为止，人们对肠道正常菌群的了解是通过对粪便标本选择性培养计数菌落数而获得的。随着分子生物学的发展以及分子生物学技术在微生态领域的应用，人们对微生态学的研究取得了突破性的进展，如SuauA等用针对16SrRNA的细菌域通用引物采用PCR法对粪便标本的DNA进行特异性扩增，得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段，对这些片段进行测序和种系分析发现284个16SrDNA片段对应于82个分子菌种(1);变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一个遗传指纹技术，根据PCR扩增16SrDNA片段的电泳，它能检测微生物的多样性。但这些技术有明显的不足，它们仅仅只提供样本中的细菌种类和数量，而对于每一细菌的特性，如生化特性、代谢特性、遗传特性等则不能反映。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种肠道乳酸杆菌培养方法，取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上，按连续稀释法，释成10-il(T8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37'C孵育培养72小时;所述培养基为乳酸杆菌选择性培养基，取MRS62g，盐酸半胱氨酸0.5g,亮绿O.lg，加入lLddH20，用2.5MHCL调pH至5.0，121。C高压15分钟，冷却至55。C，万古霉素浓度至20mg/L，混匀后倒平板。所述稀释液A的组成及配比为在1000ml水中KH2P044.5g，Na2HP046g，盐酸半胱氨酸O.5g，吐温-800.5g，琼脂lg。取新鲜粪便25克于0.5小时内放入加有玻璃珠的9mL稀释液A的试管中，在混匀器上混匀330分钟，按连续稀释法，释成10—i10—s个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各50nL的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37。C孵育培养72小时。本发明具有以下有益效果本发明的方法较为直观地反映标本中是否有肠道乳酸杆菌，及其数量，且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析，生化特性、代谢特性、遗传特性等。目前，虽然分子生物学技术可以快速鉴定肠道乳酸杆菌，但此类技术主要依据细菌的RNA或DNA来鉴定，并不能区分活菌或死菌，也不能反映出细菌的生理状态。具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述本技术采用连续稀释法，即留取观察对象新鲜粪便标本25g，于0.5小时内送检。称取0.5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中，在混匀器上混匀至少3分钟，按连续稀释法，释成10—i10—8个稀释度。根据不同细菌的正常菌数范围，选择不同的稀释度进行培养。将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各50uL的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀；所用平板放入厌氧盒内，于恒温箱37'C孵育培养72小时后，计数培养基上生长的菌落数。用对数值表示其优势菌数量(LogN/g湿便)。一、培养基配方乳酸杆菌选择性培养基在1000mL中，MRS(BROTH)62g，盐酸半胱氨酸0.5g，亮绿0.1g，上加入1LddH20，用2.5MHCL调pH至5.0，121。C高压15分钟，冷却至55°C,万古霉素浓度至20mg/L，混匀后倒平板。稀释液A:在誦mL中，加入KH2P044.5g，Na2HP046g，盐酸半胱氨酸0.5g，吐温_800.5g，琼脂lg，加入1000mL水，将混合液煮沸，按每支试管9mL分装(每8支试管中，有一支加入10粒左右的琉璃珠)，在分装后，用氮气将试管的空气部分替换，加上塞子，12rC高压15分钟。二、菌落形态及细菌镜下形态如下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注l:P表示耐氧试验阳性，即细菌未见有生长三、具体实例乳酸杆菌培养方法留取观察对象新鲜粪便标本3g，于0.5小时内送检。称取0.5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10—')，在混匀器上混匀至少3分钟，用灭菌的移液管取lmL上已混匀液加到另一未加玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10—2)，在混匀器上混匀，用此法连续稀释至浓度为10—8。将各培养基平皿作四区标志，按上表中的涂布浓度，取各50uL的稀释后的混合液分别加到四区中，用涂布棒将混合液在各自的区内涂布均匀。把乳酸杆菌平皿放入厌氧盒内，于恒温箱37'C孵育培养72小时后观察结果。计数时，挑取典型细菌菌落，作下菌落形态的文字描述记录，同时将细菌作革兰染色并镜检，观察和记录革兰染色结果。记录各种培养基中细菌的数量，如在浓度为10—7的区域内计数所得57个菌落即记作57X10—7。菌数量(LogM/g湿便)，M二20XNX107m(CFU/g)N为最小稀释浓度的菌落数n为最小稀释浓度指数的绝对值m为标本称重的质量例如上在浓度为10—7的区域内计数所得57个菌落即记作57X10—7，原标本的称量为0.5g，M二20X57X107/0.5(CFU/g)=22.8X109，那么该细菌在标本中的菌数量(LogM/g湿便)为Log(22.8X109)/g，即10.358。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。权利要求1、一种肠道乳酸杆菌培养方法，其特征在于取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上，按连续稀释法，释成10-1～10-8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37℃孵育培养72小时；所述培养基为乳酸杆菌选择性培养基，取MRS62g，盐酸半胱氨酸0.5g，亮绿0.1g，加入1LddH2O，用2.5MHCL调pH至5.0，121℃高压15分钟，冷却至55℃，万古霉素浓度至20mg/L，混匀后倒平板。2、根据权利要求1所述的肠道乳酸杆菌培养方法，其特征在于所述稀释液A的组成及配比为在1000ml水中KH2P044.5g,Na2HP046g，盐酸半胱氨酸0.5g，吐温-800.5g，琼脂lg。3、根据权利要求1所述的肠道乳酸杆菌培养方法，其特征在于取新鲜粪便25克于0.5小时内放入加有玻璃珠的9mL稀释液A的试管中，在混匀器上混匀330分钟，按连续稀释法，释成10—'10—8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各50uL的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37X:孵育培养72小时。全文摘要本发明公开了一种肠道乳酸杆菌培养方法，取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上，按连续稀释法，释成10<sup>-1</sup>～10<sup>-8</sup>个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37℃孵育培养72小时；所述培养基为乳酸杆菌选择性培养基。本发明的有益之处在于本发明的方法较为直观地反映标本中是否有乳酸杆菌，及其数量，且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析，生化特性、代谢特性、遗传特性等。文档编号C12Q1/10GK101440393SQ20081016305公开日2009年5月27日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者吴仲文,健左,徐凯进,李兰娟,王建国,肖党生,瑜陈,陈云波,陈春雷申请人:浙江大学