专利名称：：生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法及其菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法，及其制备过程中所用到的一林新菌才朱-粘质沙雷氏菌(5^ra"amczrcescera)ZJB-09104。(二)
背景技术：
：吡口秦酰胺是一种重要的一线抗结核药物，主要用于慢性肺结核、发热、咳嗽、多痰等。它对细胞内结核杆菌有抑制作用，可进人细胞内及透过血脑屏障进人脑组织杀灭结核杆菌；对巨噬细胞緩慢代谢的半休眠菌有独特的灭菌作用，是结核病短程化疗的主要药物之一。由于吡，秦酰胺具有不同于其它抗结核杆菌药物的一些优点，因此近年来对吡嗪酰胺的研究逐渐成为热点。吡溱酰胺除了以抗结核药物闻名以外，它也是其它医药产品的重要中间体。其书于生物2-吡，溱酰胺-4-氧化物是一种抗过每文药物。吡。秦酰胺可以与金属离子形成无定形态络合物，可应用于分析化学领域或元素分析、热分析、红外光谱及磁场测定等。吡嗪酰胺还可用于感光材料方面，把含卤化银光敏性乳液层和非光敏性亲水胶体层及吡嗪酰胺类亲核试剂的材料处理可成像，这种材料具有很高的感光性和良好的储藏稳定性。同时，聚吡。秦酰胺也是一种高度透明、具有良好操作性能，并能阻抗水溶解的材料。它有着良好的价格和性能潜力，它还能提供优良的粘合性能和光泽特性，并具有良好的金属化特性。我国曾采用吡嗪-2，3-二羧酸为原料生产吡嗪酰胺，由于产品质量、成本等因素，20世纪90年代开始改用2-氰基吡溱作原料。由于我国2-氰基吡,合成技术较落后，直到20世纪末2-氰基吡嗪一直依靠进口解决。由于国内尚无能稳定正常生产的厂家，而进口供货无保障，国内市场价格与国际市场价同步，因产需矛盾突出已经严重制约我国抗结核药吡嗪酰胺的生产。20世纪80年代后期，生物催化在有机合成中的应用日益受到化学家的青睐。腈水合酶是某些微生物在进行坊或脲代谢过程中产生的一种蛋白质，利用其可将丙烯腈(AN)的腈基(-CN)催化水合为酰胺(-CONH2)。1980年，日本的Yamada等人首次发现微生物i^o^cococcwsp.N2774腈水合酶可降解有毒的乙腈，不久该菌种被成功地应用于工业生产丙烯酰胺，该工艺在我国、日本、俄罗斯已实现工业化。而利用腈水合酶生产吡溱酰胺，国内外尚未见工业化报道。本发明旨在筛选得到具有2-氰基吡嗪水合酶活性的菌林，以吡。秦酰胺产率为主要指标，建立一条新的吡嗪酰胺生物合成工艺。生物法生产吡嗪酰胺，为清洁生产吡嗪酰胺提供强有力的技术支持，开发具有自主知识产权的利用微生物腈水合酶清洁生产吡嗪酰胺的工艺势在必行。
发明内容本发明目的是提供一种生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法，及其制备过程中所用到的一抹新菌林一一粘质沙雷氏菌(marcescms)ZJB-09104。本发明采用的技术方案是一种生物催化2-氰基吡溱生产吡嗪酰胺的方法，所述方法包括在以2-氰基p比口秦为底物、以粘质沙雷氏菌(5^radamarcascera)培养获得的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.08.0、2040。C下进行催化水合反应，制得所述吡"秦酰胺。所迷腈水合酶用量以使2-氰基吡。秦充分反应为宜，也可过量。优选的，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌(Serraf/amarcescera)ZJB-09104,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学430072，保藏日期2008年11月18日，保藏编号CCTCCNo.M208231。优选的，所述反应体系中，所述底物2-氰基吡。秦初始浓度为1050g/L。所述腈水合酶来自粘质沙雷氏菌培养获得的含酶细胞，所述反应体系中含酶细胞终浓度以含酶细胞湿重计为l50g/L。所述含酶细胞由可如下方法制备得到粘质沙雷氏菌接种至适用于粘质沙雷氏菌的发酵培养基中，在2(TC40。C、初始pH4.08.0条件下震荡培养至菌体对数生长期，离心分离，得到所述含酶细胞。所述适用于粘质沙雷氏菌的发酵培养基为本领域常规适用于粘质沙雷氏菌的发酵培养基，本发明中，所述发酵培养基组成如下(g/L):葡萄糖5~50,酵母膏卜20，尿素1~20，味精0.15,K2HPO40.120,KH2P040.1~5,MgS040.1-20,CoCl2或FeS040.051，溶剂为水，pH值4.08.0。具体的，所述方法如下(1)粘质沙雷氏菌ZJB-09104接种至种子培养基，2832。C培养1824小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下(g/L):蔗糖580,酵母粉卜20,NaCl0.卜5,K2HPO40.1l,MgSO40.1l,溶剂为水，pH值4.08.0;(2)步骤(1)种子液以110。/。体积比接种至发酵培养基，在20。C40。C、初始pH4.08.0条件下震荡培养至菌体对数生长期，6离心分离，得到菌体含酶细胞；所述发酵培养基组成如下(g/L):葡萄糖550,酵母膏120,尿素1~20,味精0.1~5,K2HP040.120,KH2P040.1~5,MgS040.1~20，CoCl2或FeS040.05~1,溶剂为水，pHl直6.07.0;(3)步骤(2)菌体含酶细胞添加至含有2-氰基吡口秦的反应体系中，转化体系的溶剂选择纯水或磷酸盐緩沖液，所述反应体系中菌体含酶细胞以含酶细胞湿重计浓度为l~20g/L,2-氰基吡。秦浓度为10~30g/L，于pH6.08.0、2040°C下进行催化水合反应2030h,制得所述吡溱酰胺。反应液中吡噪酰胺浓度的测定采用高效液相色谱方法对步骤(4)获得的反应液中的吡嗪酰胺含量的测定lmL转化液，离心，上清液进行气相色谱分析GC-14C气相色语仪，不锈钢填充柱，填料为PorapakQ,长2m,内径4mm,柱温220。C,进样温度160。C,检测温度220。C,载气为氮气，流速30ml/min，进样量为0.8pl。其中，吡口秦酰胺出峰时间为4.2min-5.2min,确定样品中p比溱酰胺的含量。本发明还涉及筛选到的一林新菌林——粘质沙雷氏菌(6^ra"awarc^cew)ZJB-09104，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学430072,保藏日期2008年11月18日，保藏编号CCTCCNo.M208231。该菌4^由如下方法筛选得到从浙江省杭州市某药厂附近取土样10份，取完后在12h之内迅速筛选菌种，筛选的具体方法是将样品在富集培养基中富集培养24h后，再涂布于筛选培养基平板上；经过平板筛选，共分离获得5抹可生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的菌抹；经进一步复筛，最终得目标菌株ZJB-09104。本发明筛选得到的菌抹ZJB-09104，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》的生理生化鉴定，菌林的形态呈近似为5求形的短杆状，宽1.15(im~1.26(am,长1.15pm1.73(am,菌体运动，革兰氏阴性，周身生有鞭毛，在LB平板上30。C培养24h，菌落呈圓形,边缘整齐，稍突起，白色，不透明，无光泽、易挑取，于30。C恒温培养24h，单菌落直径约l2mm;16SrDNA序列分析以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物:pl6S-8:5'-agagtttgatectggetcag-3'和pl6S-1541:5'-aaggaggtgatecagccgca-3'扩增菌株的16SrDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1534bp，将该序列(已提交GenBank,GenBank登记号为FJ479790)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与粘质沙雷氏菌(5^ra"c;wa/r"cera)的同源性最高(homology,99%/1543bps,basedon16SrDNA)。根据以上微生物学特征鉴定，该新菌抹ZJB-09104属于粘质沙雷氏菌(&rra"amwcesce似)，该林微生物不属于现己公开菌种的任何一种，该抹微生物具有生物催化2-氰基吡。秦生产吡溱酰胺的能力，可以用于吡。秦酰胺的生产。本发明的有益效果主要体现在(1)、本发明从微生物群中筛选得到可生物催化生产吡。秦酰胺的粘质沙雷氏菌(5^ra^jfmwcwcera):CCTCCNo.M208231。，其在适合条件下，能有效生产吡口秦酰胺；(2)、本发明将粘质沙雷氏菌菌林ZJB-09104用于生物催化生产吡。秦酰胺实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产吡溱酰胺，12h内2-氰基吡溱转化率达到83.80/。(见实施例3、4),因此该菌在生物催化生产吡。秦酰胺的领域中具有广泛的应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:新菌抹ZJB-09104的筛选本发明从浙江省杭州市某药厂附近取得土样10份，在12h之内迅速从中筛选菌种；筛选的具体方法是先将样品在富集培养基中富集培养24h后，再涂布在含2-氰基吡。秦的筛选培养基平板上；经过平板筛选，共分离获得5林可生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的菌株；将该5抹菌抹先分别按5%接种量4殳入发酵培养基培养24h后，离心获得菌体。将0.1g湿菌体加入终浓度为10g/L的2-氰基吡。秦的反应液中，反应24小时后，分别测定吡嗪酰胺的含量，从中筛选出生产吡嗪酰胺能力最强的菌株ZJB-09104,作为进一步研究的出发菌抹。所述富集培养基配方为蔗糖2g,酵母粉10g,NaCl2g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g，以自来水补足至1000mL,pH值4.08.0。所述筛选培养基为蔗糖20g，酵母粉10g,NaCl2g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,2-氰基吡。秦10g,琼脂粉20g，以自来水补足至lOOOmL,pH值7.0。所述发酵培养基配方为葡萄糖30g,酵母膏20g，尿素10g,味精3g,K2HP040.5g,KH2P043g,MgS045g,CoCl20.5g,以自来水补足至1000mL，pH值7.0。9实施例2:新菌抹ZJB-09104的鉴定对实施例1筛选得到的菌株ZJB-09104按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，以及《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化特性鉴定(见表l):该菌林菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，白色，不透明，无光泽、易挑取，于30。C恒温培养24h,单菌落直径约l2mm,菌体呈短杆状；在上述基础上，进一步将菌林ZJB-09104按精编分子生物学实验指南方法提取染色体DNA,以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物pl6S-8:5'-agagtttgatectggetcag-3'禾口pl6S-1541:5'-aaggaggtgatccagccgca-3'扩增菌林的16SrDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托大连宝生物科技厶司对该菌16SrDNA扩增及测序，得到该菌一朱的16SrDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌林的16SrDNA基因序列，并进行同源性比对；基于形态、生理生化特征和16SrDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，将菌林ZJB-09104鉴定为粘质沙雷氏菌，拟命名为粘质沙雷氏菌(5ferra"a)ZJB-09104,此菌林已于2008年11月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M208231。。表1:菌抹ZJB-09104与沙雷氏菌属部分成员生理生化特性的鉴定对照<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注+90%以上阳性，-90%以上阴性。菌抹ZJB-09104CCTCCNo.M208231的16SrDNA序列如下:CGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCT。实施例3:利用菌抹ZJB-09104生物催化生产吡溱酰胺按以下步骤进行(1)斜面培养基的配制蔗糖10g,酵母粉10g，NaCl5g,K2HP040.1g，MgSO40.3g，琼脂粉20g，以自来水补足至1000mL,pH值6;种子培养基的配制(g/L):蔗糖10,酵母4分5，NaCll,K2HPO40.5,MgSO40.1,溶剂为水，pH值4.08.0。(2)菌种的活化培养采用步骤(1)斜面培养基，将粘质沙雷氏菌(Se/ra"amarcesce"s)新菌林ZJB-09104CCTCCNo.M208231，在30°C活化、培养18h后，备用；(3)种子液的制备将步骤(2)活化后的微生物2环接入(1)中所述种子培养基中，在培养条件30。C，200r/min下培养24h。(4)菌种的发酵培养将步骤(3)菌种液按5%体积比接种量接入发酵培养基中，在培养条件30。C，在200r/min下培养36h,至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；发酵培养基配方为葡萄糖20g，酵母膏10g,尿素15g,味精lg,K2HPO40.2g,KH2P042g,MgS043g,CoCl20.2g，以自来水补足至1000mL，pH值7.0。(5)生物催化2-氰基吡口秦生产吡。秦酰胺将步骤(4)得到的湿菌体O.lg加入到10ml含有0.2g2-氰基吡。秦的0.1M磷酸盐緩冲液(pH8.0)反应体系中，30°C,150r/min反应24h,;(6)转化液中吡嗪酰胺含量的测定lmL转化液，离心，上清液进行气相色谱分析GC-14C气相色谱仪，不锈钢填充柱，填料为PompakQ，长2m，内径4mm，柱温220。C,进样温度160。C,检测温度220。C,载气为氮气，流速30mL/min，进样量为0.8(iL。其中，吡嗪酰胺出峰时间为4.2min~5.2min,确定样品中吡溱酰胺的含量为16.7g/L,转化率为71.4%。实施例4:利用菌一朱ZJB-09104生物催化生产吡。秦酰胺(1)斜面培养基的配制该培养基的组分与各组分的重量百分比含量为蔗糖1.5%，酵母粉0.5%,NaCl0.5%,K2HP040.01%,MgS040.03%,琼脂粉2%,以自来水补足至100%,pH值6;(2)菌种的活化培养采用步骤(1)培养基，将粘质沙雷氏菌(5^ra^warc^cera)新菌林ZJB-09104CCTCCNo.M208231，30。C活化、培养18h后，备用；(3)种子液的制备将步骤(2)活化后的微生物2环接入(1)中所述种子培养基中，在培养条件30。C,在200r/min下培养24h。(4)菌种的发酵培养将步骤(3)菌种液按5%体积比接种量接入发酵培养基中，在培养条件28。C，在200r/min下培养36h,至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；发酵培养基配方为(g/L):葡萄糖15，酵母膏20,尿素10，味精3，K2HPO40.5,KH2P041,MgS045，FeSO40.5,以自来水补足至1000mL,pH值7.0。(5)生物催化2-氰基吡,生产吡。秦酰胺将步骤(4)得到的湿菌体O.lg加入到10mL含有0.2g2-氰基吡。秦的0.1M磷酸盐緩冲液(pH8.0)反应体系中，30°C，150r/min反应24h,;(6)转化液中吡。秦酰胺含量的测定同实施例3。经测定转化液中的吡溱酰胺含量为19.6g/L,转化率为83.8%。13序列表—ST25.txtSEQUENCELISTING<110>浙江工业大学<120>生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法及其菌株<130><160〉3<170〉Patentlnversion3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>20<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>2aaggaggtgatccagccgca20<210>3<211>1534<212>DNA<213>Serratiamarcescens<400>3aaggaggtgatccagccgcaggttcccctacggttaccttgttacgacttcaccccagtc60atgaatcacaaagtggtaagcgccctcccgaaggttaagctacctacttcttttgcaacc120cactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcatt180ctgatctacgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccgg240序列表一ST25.txtactacgacgtactttatgaggtccgcttgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatacgc300cattgtagqacgtgtgtagccctgctcgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccac360cttcctccagtttatcactggcagtctcctttgagttcccggccgaaccgctggcaacaa420aggataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacga480cagccatgcagcacctgtctcagagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttct540ctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccac600cgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccagg660cggtcgatttaacgcgttagctccggaagccacgcctcaagggcacaacctccaaatcga720catcgtttacagcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgca780cctgagcgtcagtcttcgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctct840acgcatttcaccgctacacctggaattctacccccctctacgagactctagcttgccagt900ttcaaatgcagttcccaggtt眺cccggggatttcacatctgacttaacaaaccgcctg960cgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctg1020ctggcacggagttagccggtgcttcttotgcgagtaacgtcaattgatgaacgtattaag1080ctcaccaccttcctcctcgctgaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgc1140ggcatggctgcatcagacttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtag1200gagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggat1260cgtcgcctaggtgagccattaccccacctactagctaatcccatctgggcacatctgatg1320gcaagaggcccgaaggtccccctctttggtcttgcgacgttatgcggtattagctaccgt1380ttccagtagttatccccctccatcaggcagtttcccagacattactcacccgtccgccgc1440tcgtcacccagggagcaagctcccctgtgctaccgctcgacttgcatgtgttaagcctgc1500cgccagcgttcaatctgagccaggatcaaactct15341权利要求1.一种生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法，所述方法包括在以2-氰基吡嗪为底物、以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)培养获得的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～8.0、20～40℃下进行催化水合反应，制得所述吡嗪酰胺。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌(5"erraft'amarcescem)ZJB-09104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2008年11月18日，保藏编号CCTCCNo.M208231。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述反应体系中，所述底物2-氰基吡。秦初始浓度为10-50g/L。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述腈水合酶来自粘质沙雷氏菌培养获得的含酶细胞，所述反应体系中含酶细胞终浓度以含酶细胞湿重计为150g/L。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶细胞由如下方法制备得到粘质沙雷氏菌接种至适用于粘质沙雷氏菌的发酵培养基中，在20。C40。C、初始pH4.08.0条件下震荡培养至菌体对数生长期，离心分离，得到所述含酶细胞。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述适用于粘质沙雷氏菌的发酵培养基组成如下葡萄糖550g/L，酵母膏120g/L,尿素120g/L,味精0.1~5g/L,K2HPO40.1~20g/L，KH2PO40.15g/L,MgSO40.120g/L，CoCl2或FeS040.051g/L,溶剂为水，pH值4.08.0。7.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)粘质沙雷氏菌ZJB-09104接种至种子培养基，2832。C培养18-24小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下蔗糖580g/L,酵母粉l~20g/L,NaCl0.1~5g/L,K2HPO40.1lg/L，MgSO40.1~lg/L，溶剂为水，pH^直4.0-8.0;(2)步骤(1)种子液以1~10%体积比接种至发酵培养基，在20。C40。C、初始pH4.0~8.0条件下震荡培养至菌体对数生长期，离心分离，得到菌体含酶细胞；所述发酵培养基组成如下葡萄糖5~50g/L，酵母膏l~20g/L,尿素l~20g/L，味精0.15g/L，K2HPO40.120g/L,KH2PO40.15g/L,MgS040.1~20g/L，CoCl2或FeS040.05~1g/L,溶剂为水，pH值6.07.0;(3)步骤(2)菌体含酶细胞添加至含有2-氰基吡嗪的0.1M、pH8.0的磷酸盐緩沖液反应体系中，所述反应体系中菌体含酶细胞以含酶细胞湿重计浓度为l20g/L,2-氰基吡。秦浓度为1030g/L,于pH6.0~8.0、2040。C下进行催化水合反应20~30h，制得所述吡。秦酰胺。8.粘质沙雷氏菌(&rrariam^r"cm)ZJB-09104,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学430072,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2008年11月18日，保藏编号CCTCCNo.M208231。全文摘要本发明提供了一种生物催化生产2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法，及其制备过程中所用到的一株新菌株——粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJB-09104。所述方法包括在以2-氰基吡嗪为底物、以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)培养获得的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～8.0、20～40℃下进行催化水合反应，制得所述吡嗪酰胺。本发明将粘质沙雷氏菌菌株ZJB-09104用于生物催化生产吡嗪酰胺实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产吡嗪酰胺，12h内2-氰基吡嗪转化率达到83.8％，因此该菌在生物催化生产吡嗪酰胺的领域中具有广泛的应用前景。文档编号C12P17/12GK101481713SQ200810163750公开日2009年7月15日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者柳志强,沈寅初,薛亚平,郑裕国,金利群申请人:浙江工业大学