专利名称：：一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒及其使用方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学的领域，具体涉及一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：口腔黏膜病(oralmucosaldisease)是发生在口腔黏膜及软组织上的类型各异、种类众多的疾病的总称[李秉琦，周曾同.口腔黏膜病学(第二版).北京人民卫生出版社.2005，1-15]。口腔教膜病具有同一病变的损害在病变的不同阶段可以发生不同类型的损害的特点，具有同一疾病在口腔黏膜的不同部位具有不同的临床表现的特点，具有多同翻膜病共存的特点，具有发病原因多不清楚的特点。同时，口腔白斑(oralleukoplakia,OLK)、口腔红斑(oralerythroplakia，OEK)、口腔扁平莒藓(orallichenplanus,OLP)、口腔粘膜下纤维化(oralsubmucousfibrosis,OSF)、上皮异常增生等口腔都膜病是口腔磷状上皮细胞癌(Oralsquamouscellcarcinomas,OSCC)的癌前病变。OLK的发病率约为3-6%,中年以上的男性多见，癌变率为3-5%;OEK的发病率约为0.05%，41-50岁的男性多见，癌变率为52%;OLP的发病率约为0.51%,好发于中年人，女性多于男性，癌变率为0.4-12.3%。口腔黏膜病的诊断除了从临床病损进行横向比较进行诊断和鉴别诊断外，还常需要结合病理检查进行诊断。但是，由于病损的重叠与更迭性，有时病损也难以确诊，因此，需要在临床上进行治疗性诊断。总之，由于口腔黏膜病的种类的多样性、临床表现的复杂性、现有诊断方法的滞后性、部分疾病的癌变性等特点，急需建立可行、可靠的临床诊断方法，特别是建立判定口腔黏膜病癌变趋势大小判定的临床诊断方法。
发明内容本发明提供了一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒及其使用方法。本发明采用如下的技术方案实现一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、01igo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c、试剂III-d和试剂III-e。其中试剂I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH20、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL组成；试剂II由Tris-HCL+KCL、灭菌蒸馏水、TaKaRaEXTaqHS组成；试剂III-a为基因NF-1的PCR引物，试剂III-b为基因ACP-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNN-B1的PCR引物，试剂m-d为基因SOCS-3的PCR引物，试剂III-e为基因卩-actin的PCR引物。上述各试剂的配比如下表1~表4所述。表1:本发明试剂盒所包含的试剂<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注本表所列试剂的量为10个样本反应表2:试剂I的组份<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表4:试剂III的组份<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下1)、样本的制备和贮存；2)、同时进行NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和p-actin基因的RT-PCR操作;3).NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和p-actin基因的琼脂糖凝胶电泳；4)、使用KodakDigitalScienceID软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，将NF-1、ACP-2、CTNN-Bl和SOCS-3的相对表达量带入方程"组织性质判定值非标准化判别公式Y=-16.811十0.477Xnw+0.540XACP-2-0.543XCTNN-B1-0.089乂50(:5-3"计算组织癌变程度判定值Y;5)、根据组织癌变程度判定值Y判定该口腔黏膜组织的癌变趋势大小，Y小于0.1117判断该组织为无癌变，Y介于O.1117和8.6513之间为轻度癌变组织，Y大于8.6513为癌变组织。所迷的GDF-15、NF-1、SOCS-3和P-actin基因的RT-PCR操作的退火温度为55°C。本发明具有如下有益效果使用本试剂盒提供的试剂可同时进行NF-1、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和p-actin五个基因的RT-PCR反应并同时可进行多个口腔翁膜组织样本的癌变程度的判定；判定时间短，准确性高。图1:使用本发明方法获得的12例组织RT-PCR电泳图。其中泳道l、6、7、10、11、15、16、20均为DNA分子量标准，本实例中使用的是DL-2000;泳道2、3、4、5、14、19为口腔黏膜癌变组织，共6例不同病例的组织；泳道8、9、13、18为口腔翁膜轻度癌变组织，共4例不同病例的组织；泳道12、17为口腔翁膜无癌变组织，共2例不同病例的组织；bp为basepair的简写，即为tt对，下方的数字显示为该电泳条带的bp值。具体实施例方式一、试剂盒包含的试剂及i兌明本发明所述的试剂盒包含试剂12种，分别为TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、01igo(dT)15、试剂i、试剂n、试剂in-a、试剂in-b、试剂m-c、试剂ni-d和试剂ni-e。其中，trizol、氯仿、异丙醇、乙醇为组织总RNA提取试剂，01igo(dT;h5和试剂I为mRNA反转录为cDNA试剂，试剂II为TaKaRa公司PCR操作试剂，试剂III-a为基因NF-1的PCR引物，试剂III-b为基因ACP-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNN-B1的PCR引物，试剂III-d为基因SOCS-3的PCR引物，试剂III-e为基因p-actin的PCR引物。具体如表l'所示，其中试剂I、试剂II和试剂HI的具体组份见表2'-4'。表l':本发明试剂盒所包含的试剂<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注本表所列试剂的量为IO个样本反应表2':试剂I的组份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3':试剂II的组份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4':试剂III的组份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>;主NF-1,英文全称是Neurofibromin1(neurofibromatosis,vonRecklinghausendisease,Watsondisease),在Genebank中的基因编号是NM—000267;ACP-2，英文全称是Acidphosphatase2，在Genebank中的基因编号是NM—001610;CTNNB-1，英文全称是Cadherin-associatedproteinbeta1,在Genebank中的基因编号是NM_001904;SOCS-3,英文全称是Suppressorofcytokinesignaling3,在Genebank中的基因编号是NM—003955;(3-actin，荚文全称是Homosapiensactinbeta(ACTB),在Genebank中的基因编号是NM_001101.2。上述各基因引物可以通过本领域技术人员通过现有基因合成仪合成，其基本信息表述如下(1)一般信息(ii)发明名称一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒及其使用方法(iii)序列数目10(2)SEQIDNO:l的信息(i)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:1:GTCATTGCCTTCCGTTCC18(3)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核芬酸(xi)序列描述SEQIDNO:2:CACCCAAAGACAACAAGAGC20(4)SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核香酸(xi)序列描述SEQIDNO:3:CGCTCCAGACCTATGATGACTT(5)SEQIDNO:4的信息(i)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:4:CCTTGAGCCCATTCCACA(6)SEQIDNO:5的信息(i)序列特征(A)长度19bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:5:CCAAGTGGGTGGTATAGAG(7)SEQIDNO:6的信息(i)序列特征(A)长度16bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苦酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:GGGACAAAGGGCAAGA(8)SEQIDNO:7的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:CCCCAGAAGAGCCTATTACATC(9)SEQIDNO:8的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:AGGAACTCCCGAATGGGCCCCGGCA(10)SEQIDNO:9的信息(i)序列特征(A)长度19bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苦酸(xi)序列描述SEQIDNO:7:AGCGCAAGTACTCCGTGTG(11)SEQIDNO:IO的信息(i)序列特征(A)长度19bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:8:AAGCAATGCTATCACCTCC19二、操作步骤本步骤包括样本的制备和贮存、RT-PCR反应、琼脂糖凝胶电泳的实验操作和口腔黏膜组织的判定。(一)样本的制备和贮存对疑似组织的确切部位、大小、包膜状况、与周围关系、色泽、形状、质地以及标本数目等登记后，经多典酒、酒精消毒局部后取组织，一般大小为L5-2xlx0.3cm。对于面积较大的组织可在周边采用"三点法"分别取样，并分别标记。取样深度不超过0.3cm，质量约50mg。获取的标本若在短时间检验可贮存于-20。C，若在三日后检验可贮存于-80。C或液氮中备用。(二)RT-PCR反应本方法适用于一个组织标本的处理，多个组织标本可同时平4亍操作。1、用1.5ml的EP管取一个组织标本，加入lml的TRIZOL试剂，手动匀浆，于15-30。C孵育3-5min。2、加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15sec后，15-30。C孵育2-3min。4°C下12,000xg离心15min。3、将上层水相转移到新EP管中，加入异丙醇0.5ml，混匀后15-30。C孵育10min,于4。C下12,000xg离心10min。4、移去上清液，加入75o/o乙醇lml，适度振荡后，4。C下7,500xg离心5min。5、小心去除上层溶液后，EP管于通风厨中干燥5-10min。6、先加入无RNA酶的水20nl，用枪反复吹打几次，然后55-60。C孵育10min。混勻后lyl/支(S500ngtotalRNA)分装6支(分别编号为A、B、C、D和E卜E2、E3、E4)可直接进行以下操作，其余RNA溶液保存于-70。C备用。7、依次于PC化良应管A、B、C、D和E卜E2、E3、E4中各加入试剂I8.5jil后，再加入01igo(dT^0.5fxl，将其置于PCR仪内，设置程序如表5所示。表5:基因反转录反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、于第7步的PCR反应管A、B、C、D和E,、E2、E3、E4中分别再加入试剂I139^1,A中加入试剂III-aB中加入试剂III-b1^1,C中加入试剂III-clnl,D中加入试剂III-d1^1,E2、E3、E4中各加入试剂III-elul,分别轻轻混匀，按表6所示条件同时进行PCR反应。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。表6:基因的PCR^应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(三)琼脂糖凝胶电泳1、试剂配制和准备常规配制2.0%的琼脂糖凝胶电泳緩冲液等，具体如下(1)电泳緩沖液(TBE)的配制。先配制0.5mol/L(pH8.0)的EDTA溶液将37.2gEDTA-Na加入l60ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌；再用NaOH调节溶液pH值至8.0(约需4gNaOH);用蒸馏水定容至200ml;后送至高压灭菌；室温保存。(2)配制5xTBE溶液在0.6L蒸馏水中溶解54gTris碱，加入27.5ml冰乙酸和20ml0.5ml/LEDTA溶液，再加蒸馏水定容至1L,室温保存。(3)2.0%琼脂糖溶液的配制。取5xTBE溶液2ml，稀释成20ml0.5xTBE,溶解0.4g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至6(TC左右时加入10mg/mlGlodviewNa核酸染料2pl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置30min左右后进行电泳备用。(4)加样緩冲液(LoadingBuffer)的配制常规配制6xLoadingBuffer。2、步骤(1)取55ml5xTBE,用dH2O稀释成550ml，取20ml溶解0.4g琼脂糖，沸后稍冷却，加入GlodviewNa核酸染料2pl，另外530mlTBE倒入电泳槽中。(2)琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后拔出梳子，将凝肢放入电泳槽中。(3)DL2，000Marker2pl加入孔中。(4)PCR反应产物液A5(al+lnlLoadingBuffer,再加入PCR反应产物液E,5fil混合，同时加入一个上样孔中。PCR反应产物液B、C和D分别与5nlE2、5|alE3、5plE4混合后，再分别与ljilLoadingBpffer混合，并A、B、C、D同时进行电泳操作。(5)接上电源，电压100V,电流20mA进行电泳45min。(6)紫外灯检测，并用柯达凝胶成像分析系统初步判定A、B、C和D的bp大小。A的碱基对数量为239bp和501bp;B的碱基对数量为217bp和501bp;C的碱基对数量为为247bp和501bp，D的碱基对数量为179bp和501bp。(7)用柯达凝胶成像分析系统进行基因的表达量分析。三、结果分析本结果分析包括琼脂糖凝胶电泳图的分析方法和口腔黏膜组织的判定方法。(一)琼脂糖凝胶电泳图的分析方法下面，以某基因的RT-PCR结果为例说明对琼脂糖凝胶电泳图的定量分析过程。1、打开KodakDigitalScience1D软件。2、从菜单栏中"file"中的"open"打开待处理的文件。3、将目标文件打开后，软件直接将待处理的图片显示在窗口的中间位置。4、点整个页面最左侧的方框选择标志，将待处理的范围选中，可适当裁减多余部分，通过"Edit"菜单中的"Crop"来完成。5、点图片左侧的"findlanes"可显示图片中的各列。若显示的竖线不位于泳带的中间位置可点击图片左侧的箭头图标，将竖线移动至各条带的中间位置。6、点击图中"findbands"按钮，软件将会显示出目的基因条带的位置和宽度。可使用"Del键"删除不存在的泳带显示。7、在菜单栏中，找到"Show"中的下拉菜单，选择"ImageDisplay"。点击后出现对话框，点击对话框右下角的"Auto"键，软件将自动找到最适合的显示对比度。8、找到菜单中的"show，，下拉菜单>点击"Lands/Bands，，的次级下拉菜单中的"LaneAnalysisData"。而后，出现表格窗口。9、点击最新出现的对话框中菜单栏的"Display"，勾选"mean"和"area"。然后点击"确定"，即可出现每个泳带的灰度值和面积值。10、目的基因相对表达量的计算。例如，NF-1的电泳图中存在两个电泳条带，分别为250bp左右的NF-1条带U28bp)和基本与500bp平行的p-actin条带(501bp),经柯达凝胶成像分析系统分析后NF-l的mean-83.09、area=3%.00，而卩-actin的mean=100.06、area=650.00。利用"目的基因表达的灰度值=meanxarea"计算得NF-l的灰度值为32405.1，p-actin的灰度值为65039。再利用"目的基因的相对表达量=目的基因表达的灰度值xlOO/p-actin的灰度值，，计算得GDF-15的相对表达量为49.82。同样，可计算获得NF-l和S0CS-3的相对表达量。此值即可用于进行口腔黏膜组织的判定。(二)口腔黏膜组织的判定方法将NF-1、ACP-2、CTNNB-l和SOCS-3的相对表达量带入"组织性质判定值非标准化判别公式丫=-16.811十0.477Xnjm+0.540XACP-2-0.543乂〔丽8-,-0.089乂50^-3"即可计算出组织性质判定值Y。例如，若NF-1、ACP-2、CTNNB-l和SOCS-3的相对表达量为分别49.54、53.11、82.55和76.94'则该组织的癌变趋势判定值丫=-16.811+0.477x49.54+0.540x53.11-0.543x82.55-0.089x76.94=-16.811+23.631+28.679-35.497-6.848=-6.848。判定如果癌变趋势判定值Y小于O.1117判断该组织为无癌变，Y介于O.l117和8.6513之间为轻度癌变组织，Y大于8.6513为癌变组织。上例中，癌变趋势判定值丫=-6.848<0.1117,所以可判定该组织为口腔黏膜正常组织，无癌变趋势。方程"组织性质判定值非标准化判别公式Y=-16.811+0.477X,+0.540XACP.2-0.543Xctnnb-!-0.089乂50^-3"以及判别界值0.1117和8.6513通过338.11.5统计分析软件的三项判别分析方法获得。四、方法评价取12例口腔翻膜组织，经专家进行組织病理学鉴定，分别为口腔黏膜正常组织2例、口腔黏膜轻度癌变组织4例、口腔磷状上皮细胞癌组织6例。采用本发明所示的方法进行操作后，再采用Cross-validated(a)法对本判别方法进行评价，总判别符合率为100%;口腔黏膜组织共2个组织，均判断正确；口腔黏膜轻度癌变组织有4个组织，均判断正确；口腔磷状上皮细胞癌组织6例，均判断正确；交互判别符合率为100.00%,灵敏度为100%,特异度为100%。结果如图l、表7所示。表7:采用Cross-validated(a)法对本发明方法进行评价<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1.一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c、试剂III-d和试剂III-e，其中试剂I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH2O、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL组成；试剂II由Tris-HCL+KCL、灭菌蒸馏水、TaKaRaEXTaqHS组成；试剂III-a为基因NF-1的PCR引物，试剂III-b为基因ACP-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNN-B1的PCR引物，试剂III-d为基因SOCS-3的PCR引物，试剂III-e为基因β-actin的PCR引物。2、根据权利要求1所述的一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒，其特征在于由表1所述配比的试剂组成。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>表3:试剂II的组份<table>complextableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>表4:试剂III的组份<table>complextableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根据权利要求1或2所述的用于口腔翁膜组织癌变趋势检测的试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下1)、样本的制备和Bi存；2)、同时进行NF-l、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和(3-actin基因的RT-PCR操作；3)、NF-l、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和(5-actin基因的琼脂糖凝胶电泳；4)、使用KodakDigitalScienceID软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，将NF-l、ACP-2、CTNN-B1和SOCS-3的相对表达量带入方程"组织性质判定值非标准化判别公式Y=-16.811+0.477XNF.,+0.540XACP-2-0.543XCTNN.B1墨0.089Xsocs.3"计算组织癌变程度判定值Y;5)、根据组织癌变程度判定值Y判定该口腔黏膜組织的癌变趋势大小，Y小于0,1117判断该组织为无癌变，Y介于O.l117和8.6513之间为轻度癌变组织，Y大于8.6513为癌变组织。4、根据权利要求3所述的用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒的使用方法，其特征在于所述的GDF-15、"NF-1、SOCS-3和(3-actin基因的RT-PCR操作的退火温度为55°C。全文摘要本发明属于分子生物学的领域，具体是一种用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒及其使用方法，实现了口腔黏膜病癌变趋势大小的临床诊断检测及判别。用于口腔黏膜组织癌变趋势检测的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)<sub>15</sub>、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c、试剂III-d和试剂III-e。其使用方法样本的制备和贮存；各基因的RT-PCR操作和琼脂糖凝胶电泳；对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，判定口腔黏膜组织的癌变趋势大小。本发明具有如下有益效果使用本试剂盒提供的试剂可同时进行NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和β-actin五个基因的RT-PCR反应并同时可进行多个口腔黏膜组织样本的癌变程度的判定；判定时间短，准确性高。文档编号C12Q1/68GK101368212SQ20081016720公开日2009年2月18日申请日期2008年10月15日优先权日2008年10月15日发明者刘玮玮,勃牛,军王,程牛亮,军解,赵文军,赵荣瑞,郭剑津,郭巍伟,陈显久申请人:陈显久