专利名称：猪抑肌素基因(mstn)真核表达载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真核表达载体的构建，具体的说是构建了猪抑肌素基因的真核表
达载体。
背景技术：
Pichia pastoris表达系统是近年来迅速发展起来的一种真核表达系统。Pichia pastoris是一种甲醇酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在表达 真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点，又具备哺乳 动物的翻译后加工修饰的功能，从而表达有生物活性的外源蛋白。肌肉生长抑制素基因 (Myostatin， MSTN)属TGF-P超家族，其主要功能是特异性的抑制骨骼肌细胞的增殖与分 化，是骨骼肌生长和发育的负调控因子。随着对该基因进一步了解现已发现Myostatin在 体内众多代谢调控中起着重要的作用。因此采用DNA重组技术在真核系统中表达该蛋白对 其进行研究无疑具有重要的意义。本发明以含有强启动子P皿i和a-factor信号肽序列的 巴斯德毕赤酵母载体质粒PPICZ a C构建猪Myostatin基因的真核表达载体。
发明内容
本发明的目的是利用已有的毕赤酵母真核表达载体，通过基因工程的方法，构建
猪的抑肌素基因的真核表达载体。 为了实现上述目的，本发明的技术方案是 首先，使用重组PCR法扩增出目的基因，使其两端分别带上Cla I和Xba I的酶切 位点，电泳图上显示出一条单一明亮的DNA条带。 其次，将Myostatin基因片段和载体双酶切后用T4DNA连接酶连接，重组质粒转化 入大肠杆菌JM109。 最后，对在LB_Amp+平板上生长的菌落，分别使用了 PCR法，双酶切法和测序法三 种方法进行筛选和鉴定阳性菌落。 具体的鉴定方法包括(1)用自行设计的引物进行PCR扩增快速筛选阳性菌落，经 琼脂糖凝胶电泳检测，菌落能扩增出与目的基因大小相符的基因片段，再用质粒PPICZ a C 上的特征引物(5' A0X引物和3' AOX引物)进行PCR扩增，结果获得的片段大小与预计 的相符，大小基本等于载体上AOX基因的大小+插入的外源基因大小。(2)用Cla I和Xba I对从阳性菌落中提取的质粒进行双酶切，得到了两个片段，一个是3kb左右的载体和一个 1. lkp左右的外源基因片段。(3)测序结果也显示重组质粒序列与GenBank中目的片段的 序列是一致的。以上这些实验结果联合证明了目的基因已插入PPICZ a C载体，重组质粒构 建成功。
图1为表达载体构建流程图。
图2为RT-PCR扩增Myostatin基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。 M :DL2000Marker ;1 :Myostatin基因片段;2 :阴性对照;3 :阳性对照 图3为PMD18-T-MSTN双酶切鉴定结果。 图4为pPICZ a C-MSTN的PCR检测结果。 1-5 :阳性重组质粒；M :DL2000Marker ;6 :质粒pPICZ a C 图5为pPICZ a C-MSTN的双酶切鉴定结果。
具体实施例方式
—、实验材料 1.实验动物 大白猪1头，屠宰后取大腿内侧肌肉组织，立即放于液氮中保存。
2.菌株 大肠杆菌(Escherichia coli) JM109购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
T0P10F'菌株购自Invitrogen公司。
3.分子克隆主要相关试剂 (l)BamHI、 EcoRI、 Hindi 11等限制性内切酶、rTaq酶、dNTP、 DL2000Marker、
pMD-18T载体连接试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司。 (2) EasySelect 毕赤酵母表达试剂盒购自Invitrogen公司。 (2)酵母基因组提取试剂盒、山梨糖醇购自上海华舜生物工程有限公司。 (3)细菌培养用胰蛋白胨和酵母提取物均购自Oxid公司。 (4)琼脂糖、溴化乙锭、Tris等购自Sigma公司。 (5)其他试剂均为分析纯的国产生化试剂。 (6)E卯endorf管和移液器枪尖等塑料耗材均购自哈尔滨伊事达生物技术有限公 司。 二、实验方法
( — )RNA的提取 1.研磨组织样取100mg组织样于装有液氮的研钵中，充分研磨，研磨后加入装有 lml Trizol的EP管中，充分振荡。 2.分相15-3(TC温育2-5min以完全解离核蛋白复合体，2-8 °C 12000rpm离心 10min，上清移至新EP管，加0. 2ml氯仿用力摇动15sec， 15_30°C放置2_3min， 12000rpm 2-8。C离心15min。 3. RNA沉淀移水相于 一 新EP管，加0. 8ml异丙醇混匀，室温放置10_15min， 2-8°C 12000rpm离心lOmin。4.洗涤RNA沉淀弃上清，加lml 75%乙醇洗涤RNA， 2-8°C 7500rpm离心5min。
5.RNA重溶弃乙醇，离心机甩下液滴并小心吸弃液滴，空气中干燥或真空干燥 5-10min，加适量0. 1% DEPC处理水溶解总RNA。
(二)引物的设计与合成
1.克隆用引物 根据GenBank上已发表的序列，用DNAMAN和Primer5. 0软件在其完整的阅读框架外设计上、下游引物。 上游引入Cla I酶切位点，下游引入Xbal酶切位点。
上游引物(P》24bp :5 — - |GCTGA^ATC^| ATGCAAAAACTG-3 下游引物(P2)27bp :5 — - JGTTCTAGAAAl TCATGAGCACCCACAGC-3-
注引物中加框的碱基为引入的酶切位点序列 退火温度Tm 二 59 °C 2.鉴定重组菌用引物
上游引物(P3)21bp :5—-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3— 下游引物(P4)27bp :5—-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3— 退火温度Tm 二 55 °C
(三) 腦A反转录成cDNA
1. 反转录反应体系
2XBca 1st Buffer 10. Oil 1
25,1/L MgS04 4. Oil 1
d證Mixture 1. Oil 1
RNAse Inhibitor(40U/ul) 0. 5u 1
BcaBEST Polymerase (22U/ li 1) 1. 0 u 1 Oligo dT Primer 1. Ou 1
RNA Sample 1. Oil g
RNAse Free dH20 1. 5ii 1
Total 20. 0 ill
2. 反转录反应条件 65°C lmin
30°C 5min I15-30min内匀速升温 65°C 25min
98 °C 5min
5°C 5min
(四) Myostatin基因全长编码区的克隆 1. PCR反应体系
10XPCR Buffer dNTP Mixture r-T叫(5U/'P 1)
Forward Primer (lOpmol/ii 1) Reverse Primer (lOpmol/ii 1)
2. 5u 1 2. 0u 1
0. 2u 1
1. Oil 1 1. Oil 1
50078] 0079] 0080] 0081] 0082] 0083] 0084] 0085] 0086] 0087] 0088] 0089] 0090]
RT—Products Water
1. Oil 1 17. 3ii 1
25. Oil 1
7min
30sec
30sec
50sec
lOmin
to 2 25循环
Total
2. 反应条件 预变性94°C
变性94°C 退火58°C 延伸72°C 孵育72°C
4°C
3. PCR扩增产物的电泳检测及鉴定
反应结束后，取PCR产物5 ill上样于1 %琼脂糖凝胶，同时在一点样孔中加3. 0 ill DNA DL2000Maker作对照，电泳20 30min，在计算机凝胶成像系统上观察，如果PCR产物 无其它杂带，且扩增片段大小与设计相符，就可以用于回收、测序。 0091] 4. PCR扩增片段的纯化
0092] (1)将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1. 5ml的离心管中。 0093] (2)按每lOOmg琼脂糖加入300-600 y 1的比例加入SI液，置55。C水浴10min，使 琼脂糖块完全溶化，每2min颠倒混匀一次。 0094] (3)加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，55"温育lmin。
0095] (4)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，离心lmin。倒掉收集管中的液体，再将吸附 柱放入同一个收集管中。
0096] (5)在吸附柱中加入450iU Wl液，静置lmin后，离心15sec。倒掉收集管中的液 本，将吸附柱放入同一个收集管中。
0097] (6)在吸附柱中加入450 ill Wl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱 放入同一个收集管。 0098] (7)离心lmin。
00"] (8)将吸附柱放入一个干净的1. 5ml的离心管中 静置lmin后，离心lmin。将1. 5离心管中的DNA贮存于-0100] 5.PCR回收产物与T载体连接反应 连接体系如下
pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul
DNA 20-40ng Solution 15ul 加去离子水至 10ul 将上述反应液在16t:反应30min或14"C过夜。 6.感受态细胞的制备(CaCl2法)
(1) 挑取JM109大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线培养。
(2) 挑取新鲜的单菌落，接种到3ml LB培养基中，37t:培养过夜。
,在吸附柱的中央加30iU Tl液， -2Q。C中。
0101] 0102] 0103] 0104] 0105] 0106] 0107] 0108] 0109]
(3)取1ml培养好的菌液，接种到100ml LB培养基中，37。C 300rpm强烈振荡培养 2h，使细胞浓度达到5X 107个细胞/ml，此时，细菌的0D6。。 一般在0. 5 0. 6之间，为对数
生长期。 (4)将培养物在冰上放置10min，转移到2个50ml预冷的离心管中，4000rpm4t:离
心5min。去上清，倒置离心管，使残液流尽，回收细菌沉淀。 (5)加入20ml冰预冷的0. 1M CaCl2悬浮细菌沉淀，然后冰浴30min。 (6)4000rpm，4t:离心10min，去上清，倒置离心管，回收细菌沉淀。 (7)加入4ml 0. lmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。 (8)加甘油至终浓度为15% 20%，混匀，分装成200111/份，冻存于-801:。
7.转化入大肠杆菌感受态细胞内 (1)从-7(TC冰箱中取出一管感受态细胞(200iU感受态细胞)，在冰上放置 10min助溶。 (2)将lOiU连接产物加到感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置 30min。 (3)将管放到预加温到42t:的水浴锅中，热激90sec。
(4)快速将离心管转移到冰浴中，冷却1 2min。 (5)加入400iULB培养基，37t:温和振荡(100 150rpm)培养45min，使细菌复 苏。 (6)取lOOiil菌液铺于含AMP(100iil/ml)培养基上，37"倒置培养12 16h。
8.阳性菌落的鉴定与培养 (1)用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。 (2)以单菌落作为模板，加入PCR反应液(不含模板)中，用获得该片段的PCR条
件进行扩增。 (3)琼脂糖凝胶电泳检测，鉴别T载体上是否含有目的片段。 (4)若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，培养基中预先加入O. 1% (V/V)的Amp(100mg/ml)，37t:过夜振荡培养，用 于质粒回收。 9.质粒DNA的小规模提取 (1)接种一单菌落于3ml含50ug/ml Amp的LB液体培养基中，以37°C 220rpm培 养过夜。 (2)取1. 5ml菌液于离心管中，4，000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体。
(3)在细菌沉淀中加入250 iU Pl液，震荡至彻底悬浮。 (4)加入250 ii 1 P2液，立即温和颠倒离心管5_10次以混匀管中液体，室温静止 4min。 (5)加入350 ii 1 P3液，立即温和颠倒离心管5_10次以混匀管中液体。 (6) 12， OOOrpm离心10min，将上清液小心移入吸附柱，离心15sec。倒掉收集管中
的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 (7)向吸附柱中加入500iU Bl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 (8)向吸附柱中加入500iUWl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放 入同一个收集管中。 (9)向吸附柱中加入500ii1 Wl液，静止lmin后，离心15sec。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中，再离心lmin。 (10)将吸附柱放入一个干净的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入50iU Tl液，
室温静止lmin，离心lmin。将1. 5ml离心管(DNA溶液)-20中。C保存。 10.双酶切鉴定质粒 (1)双酶切反应体系 HindIII 0.80 iil BamHI 0. 80 ii 1 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反应条件:37。C 2 3h。 (3)酶切产物的电泳检测 制备1 %的琼脂糖凝胶，把酶切产物20 ii 1全部加到点样孔中，120V电泳30min，检 测到大小相符的目的基因片段后，将重组质粒PMD18-T-MSTN寄往测序公司测序。
(五)Myostatin基因真核表达载体的构建 1. Myostatin基因转录片段的获得 以PMD18-T-MSTN质粒为模板，进行Clal和Xbal的双酶切。 (1)双酶切反应体系 Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反应条件:37。C 2 3h。 (3)浓度测定 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，回收酶切产物，用分光光度计测0D26。的值，并根据
DNA的浓度=0D26。X稀释倍数X50(ng/iU)测出浓度。 2. pPICZ a C载体质粒DNA的处理 将载体pPICZ a C用Clal和Xbal酶切。 (1)双酶切反应体系 Clal 0.80 ill
Xbal 0.80 ill 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 14. 4 ill Plasmid 2. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反应条件37°C 2 3h。 (3)浓度测定 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，回收酶切产物，用分光光度计测0026。的值，并根据 DNA的浓度=0D26。X稀释倍数X50(ng/iU)测出浓度。 3.构建转录载体pPICZ a C-MSTN 将回收的Myostatin基因的PCR产物与pPICZaC载体按3 : l比例混合，作连接 反应。 (1)连接反应体系
:0181] MSTN liil
:0182] pPICZ a C Vector 0. 5 ii 1
:0183] 5 X Buffer 3. 0 ii 1
:0184] T41ignase 1.5ul
:0185] H20 14. Oil 1
:0186] _
:0187] total 20.0ul (2)反应条件16。C 3 4h。
4.转化和测序 将连接产物转化入T0P10F'菌株，培养基为25 y g/ml的Zeocin 低盐LB培养基，
挑选阳性克隆双酶切鉴定。 (1)双酶切反应体系 Cla I 0. 8ii 1 Xbal 0.8 ill 10XK Buffer 2. 0 ii 1 H20 15. 4 ill plasmid of pPICZ a C—MSTN 1. 0 ii 1 _ total 20.0ul
(2)反应条件37。C 3 4h。 将正确的重组质粒pPICZ a C-MSTN送往上海生工测序，检测插入是否正确。
三、实验结果与分析 以肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR，扩增出一条大约1. lkb的特异性目的条带， 与预期条带1128bp大小相符，初步确认为Myostatin基因。取阳性重组质粒PMD18_T_MSTN 分别用Hindlll和BamHI (载体上的酶切位点)进行双酶切鉴定，获得两个片段，分别为约3kb的PMD18-T载体片段和约1. lkb的Myostatin基因片段。测序结果表明，所扩增的序列
与GenBank上意公布的猪Myostatin基因序列完全相符，证明所扩增序列无误。 取阳性重组质粒pPICZ a C-MSTN分别用Clal和Xbal (载体上的酶切位点)做酶
切进行双酶切鉴定，获得两个片段，分别为约3. 6kb的pPICZaC载体片段和约1. lkb的
Myostatin基因。同时以该重组质粒为模板，用引物P3、 P4进行PCR鉴定，扩增出约1. 7kb
左右的条带。测序结果表明在构建Myostatin基因表达载体的过程中该基因序列未发生突
变，而且是按照设计方案准确插入到表达载体中的。
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权利要求
一种猪全长Myostatin基因真核表达载体，其特征在于猪Myostatin基因的重组载体pPICZαC-MSTN，是通过以下方法构建获得的(1)猪Myostatin基因cDNA的克隆测序取猪大腿骨骼肌外侧肌肉组织，用Trizol试剂提取总RNA，用BcaBEST试剂盒合成cDNA，连入pMD18-T载体，BamH I和HindIII双酶切鉴定后，寄往测序公司测序。(2)Myostatin基因转录片段的获得以pMD18-T-MSTN质粒为模板，进行ClaI和XbaI的双酶切，将酶切下来的片段用胶回收试剂盒回收，用于和pPICZαC的连接反应。(3)pPICZαC质粒的提取、酶切提取pPICZαC质粒后，进行Cla I和XbaI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段的回收，-20℃备用。(4)连接Myostatin片段和pPICZαC载体片段按3∶1摩尔比例，在T4 DNA连接酶的作用下，4℃16小时进行连接反应。(5)将连接产物转化入TOP10F’菌株，培养基为25μg/ml的ZeocinTM低盐LB培养基，挑选阳性克隆双酶切鉴定。将正确的重组质粒pPICZαC-MSTN送往测序公司测序，检测插入是否正确。
全文摘要
从大白猪的肌肉组织的cDNA中，PCR扩增出猪抑肌素基因(Myostatin)全长cDNA序列，产物全长1128bp，即为猪Myostatin编码蛋白376个氨基酸序列。构建了大白猪Myostatin蛋白编码序列的真核表达载体pPICZαC-MSTN，经PCR、酶切和测序检测分析，片段大小与理论相符，证明构建成功。可为进一步表达具有生物活性的猪抑肌素蛋白奠定基础，也可为深入研究Myostatin基因的生物学特性和功能提供一个方便有效的基本材料。
文档编号C12N15/81GK101724647SQ200810172948
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者刘娣 申请人:刘娣;丁镌;张冬杰