用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的质粒及转化方法

文档序号:566293阅读:371来源:国知局

专利名称::用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的质粒及转化方法
技术领域
:本发明公开了嗜酸硫杆菌属0^^//"/0&"7勿》细菌,如嗜^lt^til&铁硫杆菌(爿c/c^力/o6ac/"iAy尸e/T。ar他/5)、嗜酸氧化疏硫杆菌C4c/WM/o6a"7/i/sf力/oo;r他/w1)和嗜酸喜温疏杆菌C4c/WM/o&"7/iAycaM/力中的功能'l!^t粒。以及利用这些质粒成功转化嗜酸石俯菌属细菌,如嗜酸氧"ftJE铁硫杆菌、嗜酸氧^^^W菌和嗜酸喜^^杆菌的方法。
背景技术
:嗜酸疏杆菌属的细菌具有嗜酸、自养和化能无机营养的特点,换言之,它们生活在pH0-4的酸f生环嫂中,絲源为0)2,能量来源为i&iMt^。嗜酸缺菌属细菌中有两种对于生物iM户具有重要意义,分别是嗜酸氧化亚铁石缺菌和嗜W^^^踏菌。另夕卜,嗜酸喜i^W菌在生物iM户^^呈中^^^M^越重要的作用。所谓生物采矿,通常来讲,是指利用賴生物^^广石中提取金属。其最传统且重要的表述为生物浸矿,但生物釆矿不只限于该过程,它还包括所涉及M物的监^脉干预-这些技^M艮复杂而且是不断A艮的-及与过程优^^目关的实验室水平研究或^技术的M。中溶^r属的方法(RawlingsD.E.Microb.CellFact.2005;4(1):13)。当孩性物作用于金属本身或^^离子(counterion),释改目的金属离子到溶波时,这种作用^Ol接的。另一方面,当孩化物并不将目的金属或者^if离子作为底物,而是产生加速^mi^斤述金属溶解的化学环境,其中或者通4^h质(例如,产生石爐)或者因为其产生氧化剂而最终与幹溶解的盐分(金属和M离子)相互作用,这种作用是间接的。属于嗜酸硫杆菌属的物种,嗜酸氧化亚铁石缺菌、嗜酸氧^5J^讲菌和嗜酸喜^^踏菌,都能够产生成分,这些成分利用氧作为电子受絲加^^1^刷^^(例如石;U匕物、元素硫、硫^MMl等等)的氧^ii率。在该过程中,它们产生^t^作为终产物,型如iiLe^ik和石刷VM盐作为中间产物,其能够溶解矿石中与确化物相关的金属,特别狄的是,嗜酸氧化亚铁-沐菌与某些生物学成分利用氧作为电子受体共同^fci价铁变成三价铁。产生的三^4失作为强氧化剂能够氧^*妇^或其它^f可待氧化的^^。既然嗜酸石饼菌属细菌如此重要,人们很自然i^想到通ii^立有效的转化方法对这些细菌进^if传,,以提高其氧化活性、在其内^目的功能如)^有4^^的:l^生、或更^A^了解^R^^几制。#^细菌遗传负荷的最传统方法是利用转化过程。该过程是指将目的DM片段直##^到待转化的#^物中。其中有很多种转^^支术,最常见的是电穿孔。嗜酸硫杆菌(^/WM/Mac///^s卯.)的所有##都是非常复杂的;既他在实验室中进4辨#^不是那么简单。i!A因为该细菌必须^^^l端酸性pH值中,而且其所利用作为底物的矿石也是不清楚的,或者当魁'铁时*养基中以盐的形式^i定下来,或者是粒子如元素硫。可用肉目^C^到4feW定物,因为在菌落中可看到m^色的核。另一方面,由于细菌粘附于特定的物质,导综洗涂阶te物量的损失,而洗涤对于^W可^^物^t^bMfP是必需的。由于上述原因,有必^"^^^适的尤其针对这些细菌设计的转化方法。已经设计了一种转化方法以成功进^t酸硫杆菌属细菌如嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧^^;^菌和嗜酸喜^^危杆菌等的转化。正如上面^ij的,最常用到的孩逸物转化方法之一是电穿孑L。电穿孑L^t是利用短暂的高强度放电使细舰暂时^iit化。在细^-h形成瞬时敏的区,结构称为微孔,载体正是通iiit些区,结构i^细胞。如^f'J用石w匕铁作为底物,则嗜酸石缺菌属细菌的电穿孔就变得4摊,因为细菌上亚4組的存在能够破坏游化载体。另一方面,如W'j用石;il^作为底物,由于粘附于颗粒性物质上的部分细菌会丢失,因》^##;#^在洗涤后减少。但是不仅转化方法不同,所用的遗传载体应当具有某些特性使其在细贿功能。其中之一U制^i台原点(or力。某些情况下它们对不同属是特异的甚至对特定种是特异的,正因为此,即使我们能够成功转化嗜酸石;i^f菌属细菌,我们也不能实现载体表达,除非我们具有适于嗜酸硫杆菌属的复制系统。理想地,其需要获得嗜酸石浙菌属质粒,而且其复制勤会原点能够齡到转化载体上。最^£具有强启动子以<呆证目的基因转录。到目前为止只^il过很少的嗜酸石納菌质粒,更不用i^^征化了。Rawlings研究了其中的两种质粒(RawlingsD.E.,2005,Plasmid53:137-147),^g^殳有描述它们在转化中的用途。在English的文章(English等人1995,Appl.Environ.Microbiol.,61:3256-3260)中,利用分离的嗜酸中间石树菌C4c^//^/o6ac27/:w//2fer/z7e力'w5)质粒的复制子和嗜,不勒斯石踏菌"c2V/2Wo&c///wsi7eapo7/"加s)中与^^形絲关的肽的基因构建的栽体电穿孑L^化嗜,不勒斯石;IL^菌。扭种情况下,即使确实肯^jl转化,*觉不到#蛋白质的表达,所以不能产生成功IHt类型。涉及嗜酸硫杆菌转^^JII的另一篇文章是Kusano所发表的(Kusano等人1992,J.Bacteriol.,174:6617-6623),其中对嗜酸氧4緣铁石饼菌进行了转化,但并没有公开该物种的质粒。事实上,作者利用以前从嗜酸氧化亚铁石Jlt^t菌中分离的^^^M^子鹏r^^子辆建栽体。共电穿孔30个独立的嗜^^化亚4失石缺菌菌林,但它们中M—个U转化,效率为每微克载体120-200个^^菌落。这种转4说率是非常低的,因此并不是合适的转化方案。实际上,Kusano并没有其它涉及该技术的研究工作,而且其后来的适用性^i殳有得到验证,因为B嗜酸石讲菌研究组一直没能重复出Kusano的研究结果。有3篇文章通过利用;^杆菌作为供体以结合方式实现了嗜酸石W菌转化(Yankofsky等人1983,J.Bacteriol.,153:652-657),(Jin等人1992,A卯l.Environ,Microbiol.,58:429-430)和(Liu等人2000,J.Bacteriol.,182:2269-2276),一没有得到,的转^^t率。总之,在目前的技术^7K平下,既没有用于嗜酸石缺菌属细菌转化的特异功f^t粒,"^殳有能够实5^效转化的方法,特别是对于嗜酸氧^^铁-l^f菌、嗜酸氧"ft^J危杆菌和嗜酸喜S^^f菌。通,建嗜酸硫杆菌属的特异功能质粒,^Htit^^^^嗜酸》充杆菌的特异转化方';^f吏这一技林题得到解决,该质粒包含分离的嗜酸氧化亚铁石沐菌(WenelenDSM16786)和嗜酸氧"j^彭缺菌(LicanantayDSM17318)质粒的复制絲原点(ori),其连接到从Wenelen(DSM16786)菌抹分离的^i^动子。
发明内容本发明公开了能够成功转化嗜酸硫杆菌属细菌如嗜酸氧化亚铁硫杆菌种、嗜酸氧〗^^充杆菌种和嗜酸喜;^W菌种的质津A^转化方法。这些质粒包含从嗜酸氧^i^铁石;^菌中分离的质粒的复制^原点(or力,表示为序列l或其反向互补序列,和从嗜酸氧^*彭納菌分离到的质粒的复制粉会原点(or力,表示为序列2或其反向互补序列。还包括从Wenelen(DSM16786)菌林分离的i^f酶的表达启动子尸"/"Biosigma的'l"錄,表示为序列3。如将在后面描述的尸/2〃启动子的优点(图3)是其强烈^ii受其调錄因的狄。描述了穿梭型克隆遗传载体(质粒),这些栽体包含至少一个序列1和2所示的or/,序列3所示的^启动子特异用于其它基因的另一个复制起始原点,多克隆位点以U少一个才科eisl报告基因。转化方法包括对嗜酸硫杆菌的培养M进^^步调整以使它们适于转^^发明的质泮立。调节嗜酸石缺菌培,的pH值到5-7,并且将底物^^M四石ji^。如有必要,可先将底物由减黢亚铁#^成元素硫怍为中间底物,^4#^5成连四确黢盐。一_3^#^/在该条件下保彬|定,就利用已知的任何转^a术尤其是电穿;ui行转化。附图简述图l.显示可用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的伏itii传载体图镨。该图谱显示了pUCor/;本发明的or/1或2;带有其自身启动子的赋予卡那霉素Uan)拔(t的基因,户h/r,带有其自身启动子的lacZ基因,和多克隆位点,包括户""启动子;5U且氨艇(His6)的MCS。具有本发明or/1的裁/M"应于pBM-3PnH,而具有本发明or/2的裁/^Mt应于pBM-4PnH。图2.显示多克隆位点序列,显示MCS中的户/7"启动子,多克隆限制性位点和6个^組氨^列。图3.显^H古克隆^"发明载体中的蛋白质^i情况的^^片。嗜^化亚铁石俯菌ourWenelen(DSM16786)菌林的铜蓝蛋白基因作为克隆基因被^^到pBM-3PnH⑧载体上。该载体用于转化;U^杆菌DH5oc培养物,克隆的蛋白质随后利用组氨酸亲和柱(NTA-琼脂糖)进行纯化。作为阴性对照,用不带有所述克隆基因的pBM-3PnH⑧载体转化;U^杆菌DH5ct培^^。由化学Mwestern-blot;^r测纯化产物,其利用能识别六组氨齡列的特异*,经化学^jfe^;W自显影洗涤显影。泳道1和2分别对应于用含有嗜^IU匕亚铁石tt1菌铜蓝蛋白基因构建##化的两个^杆菌DH5ct克隆的纯4緣。泳道3显示仅转化了pBM-3PnH⑧栽体的;t^杆菌克隆阴'^ft照。结论在pBM-3PnH⑧载体中M^^到克隆的铜蓝蛋白高^Ji。这证明化"启动子强力^ii其调控基因的表l图4.显示对应于选择平^Ji嗜酸氧化亚铁石j^菌转^/^的两个培养平板照片。用咱^有卡那霉素拔1"生基因的pBM-3PnH@质津1#化嗜酸氧化亚4失石納菌培养物。平板A.对应于涂布在不#那霉素且pH5.5DOP的培养基中的转^^,其最初从kan50|ig/mLpH5.5DOP筛选的具有pBM-3PnH⑧的转4tS^获得。平板B.对应于在含有卡那霉素平板的影印,kan50Mg/mL,pH5.5D0P。结论在两个平紅都M^到转化的菌落生长,表明本发明的转化方法是成功的。只負MLA平紅生长的菌落为不稳定的转4沐。共得到4个稳定转化体。图5.显示来自转化的嗜酸氧化亚铁石浙菌^^养物的质粒DNA提取物的凝颜、片。泳道1和泳道2分别上样10juL和20jnL提和^^,泳道3和泳道4分别对应100bp和X氾/^///^^标准。结论因为能够回4i^载体,所以嗜酸氧^^铁硫杆菌的转化是稳定的。图6.A.显示h/基因经PCR扩增的^M片。泳道1中的样品,其PCR底物为从pBM-3PnH⑧质并MH匕的嗜酸氧化亚铁石;^菌林中提取的DM。泳道3中的样品为P曰性对照,其PCR底物为纯化的pBM-3PnH⑧质粒,泳道2、4和5中的样品为阴性对照,其中泳道2和5中的底物为水,而泳道4中为从未转化的嗜酸氧化亚铁石浙菌株中提取的DNA。泳道6和7分别为100bp和XHindIII衬标准。结论可以M^到转化的菌林(l)与P日'l^t照(3)存^目同的^f,而在未转化的阴性对照菌抹(4)中没有条带。因此回收的质粒正是pBM-3PnH@质粒。图6.B.显示培养平板的照片,所述平;^目应于大肠杆菌转^^选择平板。用从转化的嗜酸氧化亚铁瑜片菌克隆中回收的pBM-3PnH⑧质fi^化;^杆菌培#,该质粒包^f"那霉素抗'^&因。该平M补M50]Lig/mL卡那霉素的LB(LuriaBertani)琼脂培养基中的转化体。结论由于栽体能够完整回收而且可以用于新的转化,因此嗜酸氧化亚铁石*菌的转化^功的。发明详述建立一种高效转化嗜酸输片菌细菌的方法在生物采矿中至关重要,因为它通#这些细菌中整合入有利于它们转化的基因来改良细菌,在它们所参与过程中提高它们的效率。为了&'〗上述目的,获得在该属中有功能的含有复制起始原点的质并i^成转化的方法很重要。得到该质粒的第一步是获得嗜酸石沐菌or/。为了此目的,从嗜酸氧化铁硫杆菌和嗜酸氧^^^if菌菌株中分离质粒。得到这些质粒^,进行测序并加以研究以确认它们中可能的or/。在所有情况下,确定可能的oW的存在,对于序列1,对应嗜酸氧^i^铁硫杆菌,对于序列2,对应嗜^^^^W菌。对^4页域技^A员来说,每个DM序列显然等針其反向互补序列。椐此,每次我们所指的某一序列,对于序列1*列2,hU旨其反向互朴序列。获得嗜酸石俯菌属细菌特异的w2'允许我们首次构建高成功率的转化载体,当构建的载体不含有表达启动子时用来克隆,或者当构建的栽体含有^Ji启动子时用于^it。本发明的质粒^i^含有从Biosigma所有的Wenelen(DSM16786)菌;fe^分离的M启动子。选择在该菌抹基因组中鉴定的固氮酶启动子化"作为不同培养糾下都能高水平絲的强启动子。尸""如序列3所示。由于我们的栽体中含有尸/2仏因此能够确保受该启动預控的目的基因强^Ji。一_§^#了嗜酸石危杆菌的or/',序列1和序列2,以及戶/2"启动子,序列3,就可以设计含有这些的转化载体。特别设计了在两种不同的属或种中都有功能的穿梭载体。在这种情况下,除了嗜酸石*菌的ori,序列1和序列2夕卜,所ii^^ii包^ff异于其它属的另一个复制,原点。该载包含^〃启动子、多克隆位点以M少一个才封己基因或净艮^^因。^M^领域已知的任何一个复制起始原点中选择第二个复制起始原点,如or/pUC、or/ColEl、or/'pl5A、oWNTPl、or/'pBR345、oWpBR322、or/R6K等,^ffei^or!'pUC。设计遗传栽体时,多克隆位点连接于才艮告基因,因jtb^所述克隆位点插入基因则iiA报告基因不負汰达。这样就能够确定在克隆位点是否成功插入目的基因。为了进行克隆,选#^只别多克隆位点内序列的卩艮制性内切酶,确保该序列;r^在于目的基因中。从已知的能够通it^物颜色变化、^J^^M4^ii行鉴定的报告基因中选#^接克隆位点的报告基因,如""((3-半吝'Ut普酶)、g/M绿色荧光蛋白)、/w(费光素酶)等。报告基因尤其是P-半吝14t苷酶,h"基因。该栽^fM"有能够通过筛选进行鉴定的标记基因,该基因从抗生素抗性基因中选择。尤^LiW予卡那霉素(ir犯)私f生的基因。M的是多克隆位点还含有组^^,即编码6个组M的序列,^^皮整合入我们要表达的蛋白质的^i^將为其絲^J^。包^i亥M的优点在于首先,^J且氨酸胁的存在能够方^^用来^H古^f可所克絲白质的狄其次,组氨酸六肽使包辨的嵌和蛋白质可以用絲镉亲和4ii^t^化。图1代^^发明to的遗传栽体,其中含有PUCw/;本发明的w71或2;带有其自身启动子的赋予卡那霉素(Kan)抗性的基因,带有其自身启动子的lacZ基因,尸/ac;以及含有户/〃和组^j^C(His6)的多克隆位点(MCS)。具有本发明or/1的栽^t应pBM-3PnH,而具有本发明or/2的载^t应pBM-4PnH。可在图2中详细XC^该多克隆位点。图3中证明了Pnit启动子的强度,其显示了克隆在P丽-3PnH⑧中的嗜酸氧化亚铁石缺菌铜蓝蛋白的表达,而避亲和柱纯^^被检测到。利用^i且氨酸序列的特异^Mt过化学发光western-blot方法i^ft^r测。泳道1和2对应于用构建##化的两个大肠杆菌DH5oc克隆的纯化物。泳道3对应作为阴',照的仅pBM-3PnH@空栽#^#化的菌林的纯^緣。可以XC^到受户/"调控蛋白质的强力4it。本发明的质粒iMl^M页域已知的方法构建,主要包^t酸石姚菌的or/,序列1和2,以及尸/〃启动子,序列3。嗜酸硫杆菌的or/,序列1和序列2,以及户/〃启动子,序列3都可以单独应用于此说明书未明确预见的^it传构建体,i^t于^^页域技^Mv员来说;1E而易见。每次将序列1的or/it亭列2的w/^^Ait传构建体,将^J1提高嗜酸石jMf菌中的^iio每次将序列3的尸72"启动子整合Aii传构建载体,连接到所述启动子的序列也将强力M。所述/^Hf序列用于上述目的的所有应用#1^为^^发明的明显1务改。一旦已经构建本发明的质粒,J^T必要提供能够使该质粒得以整合入嗜酸石;l[if菌的方法。转^il些细菌首先遇到的困难在于所用的底物几乎干^^斤有已知的操作方法。已知这些嗜酸石沐菌需^t失源和/i^克源作为能量来源。嗜酸氧化亚铁石踏菌通常以石jfi^亚铁作为底物。石繊亚4ibi—种优^物,虽然当其氧化成铁离子时,培絲的氧功肯巨*高,在转4^jt前通过破坏DNA栽M通过增加电孤形成可能性而干扰电穿孔,所述电弧损伤细胞。适^f酸硫杆菌的另一种能量来源是具有不可溶缺点的元素硫,因此只能以耀b险的形iOA^培养物中,而且当它将其膽絲中去除时会带走很多存在于培絲中的细菌,因为这些细菌黏附于底物^r立上。为了解决该方法中it5ij的第一个困难,我们选择利用可溶硫源连四石M盐(tetrathionatesalts)。我们已^C现,如^J^f紋培养,嗜酸石;Uf菌属细菌接j]iJl:四-;l^it作为》克源。在第一阶段,先用元素硫脊氏常用的硝酸亚铁,然后再用连四石JL^L^^元素硫。每次改M物都是通iiA^来的培員中取出一些接种物射吏其生长在不同的底物培养基中。在4^亍新的培养^前有必^##^絲&'膽、定。舰常^A在3^^2周内,最通常在改她物一周后。转化嗜酸硫杆菌遇到的第二个麻烦是这些细菌生长所需的极端酸ltpH值,该pHM常在甚至小于2的一定范围内。为了IHE^化是否J^,通常在转化载体中^^入一种負m予转化细胞某朴歸的筛錄因,通过该4鍾可^^转化细胞中区分转化细胞。多数清况下,^^赋予某种抗生素^1"生的基因,絲錄培养基中加Ail种抗生素来筛选转4沐。绝大多数抗生素都^1杂的有^^,在酸性pH下会j^jl变性并且其活,|^皮部分或^#制。因此pH2^#化的嗜酸石俯菌的筛选带来了困难。为了解决这个问题,本发明的方法包^WI节培骑pH值的。每次升高培养基pH0.5-1,而且每次升高以5-15天时间间隔进4亍,以确^3|#^在每次pH升高之前^^惑定。通过制M同于原始组賴的培养&^絲升高培养基的pH值,利用錄^^I调节到较高的pH(每次升高的值介于0.5和1之间)。培养物pH的升高g^^底物的改变可以同时或相继实施,先实施哪一步并没有不同。一^SJii^了接近5-7的中性pH值,并利用连四石i^Jt作为底物的嗜酸石缺菌稳定培养物,就可以运用本领域已知的^—技术实皿养物的转化,特别是电穿孔。如果转化方法需要,可以在转化前用合适的緩冲'^ii行冰浴漂洗。一旦用本发明的质粒完成转化,就应在含有筛选成分的平^Lh培养所迷细胞(,性包含在转化载体中)。平絲25-45匸下孵育7-14天。长出的菌落就M功IH匕的细胞。本发明实施的一些实例列举如下。这些实例只是—对^^发明的举4'B兌明,决不限制^^发明。实施例实施例1.载储建通过PCR扩增含有序列1所示or/的片断,然后通过限制性内切酶(尸^7/处a/)定向。从pT0P0载体获得ira/片段,并iL^^a/位点连接至图2所示的多克隆位点(MCS)和从pBluescript载体获得的pUC复制絲原点。通it^'J用T4连^S^将得到的片断在/^//处a/位点处与oW1连接。IC^棘于屈0//^';^///1^刀位点之间的尸""启动子和位于5^c/位点的六组氨斷列连接到遗传载体上。产生的质粒命名为pBM-3PnH⑧,该质粒预期大小约4500bp,其结构如图l所示。^f示准糾下,通过电穿孑傳连接产物转化;^杆菌。在含有50jug/mL卡那霉素的LB琼脂培养JJi筛选转^^。在含有50|ig/mL卡那霉素的LB液條养基中培养卡那霉素私性菌落,分离抝f生克隆的质粒DNA,并且鉴定通itF艮制性图ifi殳计的质粒(利用氾/k////、处a/、及^/、S鹏/等酶切),并PCR扩增构建的质粒中存在的不同片段。结果表明分离的质粒是构建的栽体。实施例2.通过电穿孑L^"化嗜酸氧^^铁石;^菌首先,将培^^底^I整^^发明的底物,连四石繊盐,并,养物的pH絲不变。制备lOraL在pH2.5条件下生长的嗜酸氧化亚铁^if菌培养物,该培#以石jlt^il^失作为石;fl^L来源。吸取lmL所*养物中作为接种物并将,移到9mL1%的S培养基中。培絲在301C培养一周。然后,将S培养基中的lmL培养液转移到9mL含0.1%连四石诚盐的9K培养基中,其《JL^如表1所示。培辆在30。C下培养一周。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>It^将培养物的pH调至接近中性,并维持;^。为此目的,取1mL含有ly。连四石;!L^盐、pH2.5的9K培*并将^#入9mL含有0.1°/。连四石爐盐的、pH3.5的9K培养基中。培养物在30匸下培养一周。重Jji述步骤,先接种入pH4.5的培养基,^^种入pH5.5的培^&。为了在转4t^^前提高生物量,将10mL含有0.1。/。连四石爐盐、pH5.5的9K培^4勿接种入90mL同样的培养基中。该培辆在30。C下培养一周直至餘。从该#培絲中取出一些培养液,并将其在同样的培养基中稀释至10%,过夜培养以获得新鲜的培,。次日上午,8,000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞^^jfo^浴中用40mLA溶液(9K盐培养;iJ^础,pH1.8)漂洗。接着,#浴中用40niLB溶液(PBS5mM、蔗糖0.3M、10mMEDTA,pH8.0)进行第4漂洗。林浴中用30mL电穿孑遴冲液,即溶液C(PIPES3mM、蔗糖272mM,pH6.4)进行第三次漂洗。漂决后,用lmLC溶液悬浮^i定,^KijM:直至:ii^亍电穿孔。如实施例1所描述的,利用pBM-3PnH⑧栽^ii行电穿孔。10pL含7gpBM-3PnH⑧栽体,然后将其DM渗析30在0.2cm容器中对400liL细胞在2,500-3,000V和400Q奈件下进行电穿孔。每批400inL电穿孔的细胞分别在10mL含有0.r/。连四石jKM盐的9K培养基中培养,不进行筛选。另外,作为阴'f树照,在不同的舰中用10mL含有1.0y。连四石滅的9K培养基单独培养400pL未电穿孔的细胞。所有的培#^在30。C振荡培养过夜。次日,制名^~有50jLig/mL卡那霉素,pH5.5的D0P平板。DOP固,养!^笛述于文献(Liu,Z.等人1999,p.39-49,R.Amils和A.Bailester(编辑)InternationalBiohydrometallurgySymposium,Elsevier,Amsterdam,TheNetherlands),(Peng,LB.等人,1994,J.Gen.A卯l.Microbiol.40:243-253)中。每杏聘频中取200样品均匀:^ki^布在制备的平紅,两次重复。平板在30。C下培养7天。所有的平;MP显示存在转化体。然后,将其中一^板影印在无卡那霉素、pH5.5的DOP固*养基中U.),和含有50pg/mL卡那霉素、pH5.5的DOP液,养基中(B.)。图4显示了这两付板的照片。在没有卡那霉素平板A中,荻得所有的最初转化克隆。然而,在含有卡那霉素的平板B中,只有能继续表錄因的稳定转4脉才肯^长。^Eit种情况下,获得了4个稳定转化的嗜酸氧化亚4失石^菌克隆。利用能识别转化载体中存在的卡那霉素抗'錄因的引物,同时针对筛选培养基(B)上生长的4个菌落,即l、2、3和4进行PCR^r测。#测了未修饰的阴性对照,以pBM-3PnH载体作为阳性对照的樹l。扩增结^明这些克隆含有卡那審素基因,并且得到了与阳4生对照相同大小的条带。实施例3.从转化的嗜酸氧化亚铁石*菌菌林中回*1^1体。用4^J^法从用pBM-3PnH转化的⑧并在含有50ng/ml卡那霉素的9K疏培养基中生长的嗜酸氧^i^铁石辦菌克隆中分离质粒DM。如图5所示,先制备一块^iM角定栽体的存在,在第一个泳勤口入10)iL提^^^物,在第二个泳^|>入20pL从转化的嗜^IU匕亚铁石讲菌菌林中提取的同样的质粒DM提$0,a^。第三#第四个泳道分别对应100bp和入HindlII^^标准物样品。显示的条带与载体的预期大小一致。逸*明,既然栽体負^皮回收,那么转化魏定的。另外一种JiHiE^化成功的方法是用PCR扩增载体中包含的卡那霉素U3i2)抗'錄因。分别对用pBM-3PnH⑧转化的嗜酸氧^JE铁石踏菌菌林、未转化菌林、pBM-3PnH⑥载体和水(作为阴松寸照)进行PCR反应。图6.A显示了反应结果,泳道1对应用pBM-3PnH⑧转化的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌椒泳道3是pBM-3PnH⑧载体,作为阳'f树照;泳道4对应未转化的嗜酸氧化亚铁石饼菌菌株;'减2和泳道5是利用水的阴'I"树照;泳道6和泳道7分别对应100bp和入HindIIIW标准。可以看到,转化的菌抹(1)与P曰性对照(3)显示了相同的条带。而阴寸树照未转化的菌林(4)没有絲显示。因此,回收的质^^J"应pBM-3PnH。用从转化的嗜酸氧化亚铁石缺菌林系中分离的质粒DM转化燥杆菌培养物。结果如图6.B所示,从图中可以看出转化的燥杆菌株系在含有卡那霉素的培养平Wi生长。上述的实施例作为本发明的例子,决不限制在所附的权利要求书中所描述的^^发明的范围。序列表序列号1长的1647pb'类型DNA分类嗜酸氧化亚纟失石危杆菌复制起始原点(Acidithiobacillusferrooxidansori)序列ATTTTCACTAACATAGCGACAACACTAGGTGCAATCAAATAGTTGCCGTTTAGTCTTATGGCTGTTATCAGACATTACGATGAGGTCGCTCATTTTGCTTCCTGTCAGGATAG丌(TGACG丌GTAGCTTCCAGTGTCGTGA丌CGGCTTTTAATCTCT丌GAGATCGCGCTCAATACGATCCTGCCCAGCCTGAAAGCGTTTCAGGTGTTCCAGCATGAGG丌CTCTATCTCGTTTGCCATAGTTGTC丌AGACGGCCTTGCCGCCTGCCTCCTGATG丌GGCCGCCCTTCACCACACTAAACCCTTTCGCC丌GGCCTTATCAGCTGTTCTCACTGCC丌CTGGTGAGTAGCCCCTTTTCCCTTCCATCCGAATTCTGGATTCAAGGTGTAAGTGCGGTTTTGGCCCCATTTTGGTCCAACAATAAGCGCATCTAAACTGATGAGGCGCTTAA丌GCCCTG丌GACTCGCGCTCGATCGATGTTCATCTCCCGCGAAAATCTTGAGTGGTCCTTGTGCCATCGTAAAAAACCTCCCCTTCTCAAAAGCTAGTATCCCTATCAACGAAGTCAAATGCCATTTnTGCCCCCTTGTTGACTCCACAGTCATCATTGATGATTGTACAGTCAACAAGGGGTTTTGCAAGCCATTATTTTAACGGCTGImilIGCCCCCIIIIICTTA丌CTAACAGGCCGTGCCAGCGAAGCGCACTGGGGCGGTTGCGGTAGCGTCGGTCGATTTGCAAGCAAATCGACCGCCACTCCTCGCCCGACrrTGACCCTTCGGGTCCTGAGCTAAAGCTATTnTGTGACTTGCAACAAAACACCACGATTGTCGAAAGTTTGGGGGGGGCCGCCAGAGCGGGGGGGGGGAACGGCACGTTCCCCGCCGGGGATGTTCGTGGGCGGTCCGACGCAGTCGGAGCAAGCGCCCACTCCTTTTCTTGCCAGCAGGACGATTAGGTGGCAGTCTGCCCATATTCGACGGAGACTAGCAAGGGGCGTTGCCCCCTTGACCCCCTGACACTGCCGGAGCGCTTTAACGTGACAAGCCACAAAGACA序列号2长的1104pb类型DM分类嗜酸氧化亚4失石克杆菌复制起始原点(Acidithiobacillusferrooxidansori)序列TTCGTTACGGTAACAAGGCGAACGGCTCAAGCCCTCTCCCCCAGACCCCCTCACCCAGCCCGTGCAGGCCATACGATGCACGCTGTAGCCACTATTCCGCCCTCTGGGCGGTTGCGGATTCGTTCGACGATTTGCAAGCAAATCACCGCCCTCACCCGCGCTCCCTCCTGTTTTCCTACGAGCTAACGCTnTCTTTTTCCCGATAGGGAATCCATTGCACCATTGGCGAGCTCATTCATTGCGCACTTTACAAAAATTGCGCAATTTTATTGCTTTTGAGCAAACCAGTACTTTACCGTTCTGAGAGACACGCCAAGGGCATACCTGATTGGAGGCTTTCCTGCCCCGCTCCGCCTGCTGTTCTGGCGTATGCGTCGCTGATGCTCTTAGCCGTGGCCTTCACTTCGGCAAAGGGTAAGGGCTGCGGAAACTCGCCGTTAATGGCCTGTAATCGCTCCAGGACGGCTTTTGACCATCGACCAAGCCCATTGGGTGCCCAATACTCCCTGACAGCCCCGTAGGCCCAGAAACGACCTGGTTCATGCCGAATGGCACTATCGCAAACGGTCGTTTTTGAGGCTCCATCCTGAGAATGCACGGAAACGCTGTGTTTGCTGGTGATTGCGACGCTCAAAAACGGCTCTCAATTTCAGTTGGCCAGGATTATGGGTTTTGAGAACAGCAGAGTGGGAATCTTCAAAATCATGGGGTCCAACATCCTTAAC序列号3长的106pb类型DNA分类Pnit,Wenelen林(DSM16786)固氮酶启动子序列A序列表<110〉BI0SIGMAS.A.<120>用于转化嗜酸硫杆菌属细菌的质粒及转化方法<130>NA<150〉CL2115-2007<151〉2007-07-19〈160〉3<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211>1647<212〉DNA<213>嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)<400〉1attttcactaacatagcgacaacactaggtgcaatcaaatagttgccgtttagtctgctt60taggttaaaaggcaataacgggaggcgctgtattggtgccgcccgttatttatggctgtt120atc卿cattacgatg'aggtcgctcatt"gcttcctgtcaggata.gttcaagacggcgc180tcaatgcgctggatgcgctcatccaagctgtcataacgcacatgctgctctgcaatggag240cctgacaggtgtgccagataUgcatgatcgttgacgttgtagcttccagtgtcgtgatt300cggcttttaatctctttgagatcgcgctcaat.acgatcctgcccagcctgaaagcgtttc360aggtgttccagcatgaggttctctatctcgtUgccatagttgtcttagacggccttgcc420gcctgcctcctgatgttggccgcccttcaccacactaaaccctUcgccttggccttatc480agctgttctcactgccttctggtgagtagccccttttcccttccatccgaattctggatt540caaggtgtaagtgcggttttggccccattttggtccaacaataagcgcatctaaactgat600gaggcgcttaattgccctgttgactcgcgctcgatcgstgttcatctcccgcgccatgtc660cgcctgagaaacggcgatatggttctgatagtccagcttgcggagcaagttcatcaagac720gcggaagccgtccacacccaaatcctgagcatgatcctcgaaaatcttgagtggtccttg780tgccatcgtaaaaaacctccccttctcaaaagctactggaacgggccgctgaaccagcat840aggcactcgctcggaaagtatctcaccagtatccctatcaacgaagtcaaatgccatttt900ttgcccccttgttgactccacagtcatcattgatgattgtacagtcaacaaggggttttg960caagccattattttaacggctgtttttttgccccctttttctta"ttctaacaggccgtgc1020cagcgaagcgccgcacggacccggtaagcccccgcgatagcggtxgtcaaacccggccca1080ggagccgctaggagtgggcgcttgcctcgacctatggtcgagccgcccacgaacccttaa1140agggcctcacagggcat.tctagggcacctgtagcaagcattccgccccactggggcggtt1200gcggtagcgtcggtcgatttgcaagcaaatcgaccgccactcctcgcccgactttgaccc1260ttcgggtcctgagctaaagctatttttgtgacttgcaacaaaacaccacgattgtcgaaa1320gtttggggggggccgcc卿gcgggggcaatagccccggagggggtcgatccggcgaagg1380agcgcagcgactgaggacagggggaacggcacgttccccgccggggatgttcgtgggcgg1440tccgacgcagtcggagc卿cgcccactccUttcUgccagc鄉acgattaggtggca1500gtctaaccactgtaaagctagcctacccgtcgaacacgagcaccccctgacggggttgcc1560catattxgacggagactagcaaggggcgttgcccccttgaccccctgacactgccggagc1620gctttaacgtgacaagccacaaagaca1647<210>2<211〉1101<2i2〉鹏<213>嗜酸氧化硫硫杆菌(八cidithiobacillusthiooxidans)<400〉2ttcgttacggtaacaaggcgaacggctcaagccctctc.ccccagaccccctcacccagcc60cgtgcaggccatacgatgcacgctgUgccactattccgccctctgggcggttgcggatt120<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>emt3cc幼ccggtcggtcttagatgggggccacactga肪atttga10权利要求1.一种用于转化嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)细菌的质粒,其特征在于它包含一个从嗜酸硫杆菌属细菌分离的复制起始原点,并且主要包括序列1和2所示ori之一的核苷酸序列或各自的反向互补序列,和序列3所示从Wenelen株系(DSM16786)分离的固氮酶启动子Pnit,该启动子强烈地促进受其调控的基因的表达。2.才娥权利要求1的质粒,^#棘于它絲包含序列No.1所示oW之一的核齡列或其反向互补序列,使其能够转化嗜酸石缺菌属细菌,尤其是嗜酸氧化亚铁石*菌种64c^//r//o6aci7/iw/br了oox/^2/w,细菌。3.才^^5Uf'涹求1的质粒,其特征在于它M包含序列No.2M的之一的核齡列或其反向互补序列,使其能够转化嗜酸石沐菌属细菌,尤其是嗜酸氧^j^缺菌种64c2WM/o&s"7/mM/oar/rfs/wJ细菌。4.才財居45U,漆求1的质粒,^##于它是一个能用于多种不同属或不同种的微生物的载体(穿梭载体)。5.才N^权利要求4的质粒,^#棘于它包^#异于其它种的第二个复制船会原点、克隆位点和至少一个才科己基因。6.才权利要求5的质粒,其特征在于A〃启动子々條于多克隆位点,并且调节所述克隆了的基因的^io7.才N^权利要求5的质粒,其特M于,于克隆位点,优选多克隆位点,有一^R编码六组氨,的序列,该六組氨^k可以作为质粒所克隆的蛋白质的C-絲的组氨親。8.才M^5^,漆求5的质粒,其特征在于所錄二个复制起始原点选自or/pUC、oWColEl、or/pl5A、oWNTP1、oWpBR345、oWpBR322、or/R6K。9.才娥^U,漆求8的质粒,^#棘于报告基因选自已知的报告基因,如7acZU-半孝Ut香酶)、-/7(绿色荧光蛋白)、/wc(焚光素酶)或可通狄物颜色变^^^^f亍^^定的其它才艮4"基因。10.才M^权利要求9的质粒,^#棘于报告基因与克隆位,^目连,因此在所述克隆位点插入基因决定了报告基因不4it。11.才^^5U'J要求10的质粒,^#棘于该报告基因是&-半專Ut苷酶/a"基因。12.根据权利要求9的质粒,其特征在于它含有第二樣自抗生素抗I"錄因的才艮"^基因。13.根据权利要求12的质粒,其特征在于^^该基因赋予对卡那霉素14.根据权利要求8的质粒,其特征在于第二个复制^原点是pUCoW。15.—种转化嗜酸硫杆菌属细菌的方法,其特征在于在于它包括以下步骤a.制^t酸石踏菌"c/力7A/o&2C27/m)培#^;b.逐洋糊整培养物的pH值,使#于5和7之间;c.#^培养底物为连四石;1^;d.制备权矛虔求1-14中^-项所定义的負^嗜酸石;^菌中^i自己的转化载体;e.从步骤d^%供的以转化载体修饰的培*获得嗜酸石克杆菌转化体,以获得转化的嗜酸^W菌;其中步骤b和c可以同时或按相继实施,哪一步先实施并无不同。16.根照权利要求15的方法,其特征在于步骤b是在如下糾下实施的每次升高的pH值衬0.5和1之间,絲高一次间隔时间是5-15天,每次升高pH之前^l^射緣养的稳定性。17.根据权利要求16的方法,其特征在于合适的间隔时间是5-7天。18.根据权利要求15的方法,其特征在于步骤C中的培养底物;^w5A^铁^^^t素硫,然后^ff^M四石i^JL19.根据权利要求18的方法,其特征在于底物的每次都是一个機3U2周的阶段,以4呆*养的稳^:性。20.根据权利要求16的方法,其特征在于合适的间隔时间是5-9天。21.根据权利要求15的方法,其特征在于步骤(1制备的栽^*有从嗜酸硫杆菌质丰立分离的复制,原点。22.根据权利要求15的方法,其特征在于转化是利用贿^^中的^""转^^支术实施。23.根据权利要求22的方法,其特征在于电穿孑L是^^f^I的^^。24.根据权利要求15的方法,其特征在于嗜酸石;^菌培#^是嗜酸氧化亚铁赠菌培絲。25.才^^U,J要求15的方法,其特征在于嗜酸石沐菌培#^是嗜酸氧^*危石缺菌培絲。26.才^l权利要求15的方法,其特#于嗜酸硫杆菌培#^是嗜酸喜^^危杆菌(Acidithiobacilluscaldus)培^/。全文摘要本发明公开了嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)细菌,如嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)中的功能质粒。以及利用这些质粒成功转化嗜酸硫杆菌属细菌,如嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸喜温硫杆菌的方法。文档编号C12R1/01GK101413010SQ20081017566公开日2009年4月22日申请日期2008年7月18日优先权日2007年7月19日发明者贝朗格P·E·马丁内斯,巴尔德坎托斯P·帕拉达申请人:拜奥希格马公司
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