利用酶活性的竞争性干扰和恢复检测被分析物的制作方法

专利名称：利用酶活性的竞争性干扰和恢复检测被分析物的制作方法
技术领域：
本发明的内容涉及利用多核苷酸和结合分子来检测溶液中的被分析 物的方法，其中该方法利用了酶活性的竟争性干扰和恢复。
背景技术：
样品中被分析物的定量和定性4全测经常用于化学和医学领域。例如，
括，例如病毒和细菌抗原、免疫球蛋白、激素、细胞、药物、毒素和管制 药物。由于这些技术通常缺乏足够的灵敏度和精密度，因此已经开发出放 大系统。
已经开发出许多不同的用于定性和定量检测样品中的被分析物的免
疫分析方法，如酶if关免疫吸附分析(ELISA)、》文射免疫分析(RIA)和酶 免疫分析(EIA)。例如，免疫分析可以设定为均相或异相分析，其中异相 分析为包含固相和液相的两相分析，而均相分析是以单一相进行的。异相 分析，如ELISA是常用的，但不利的是其要求的步骤比均相分析多。而且， 除了需要额外的清洗步骤外，异相分析的缺点还在于其永远不能真正地实 现自动化。现有的均相分析，例如酶片段互补(EFC)。 EFC是基于抗体-抗原结合的均相分析，但不利的是其灵敏度和分辨率低，因为其通常只对 小抗原起作用，并且仅在具有高背景活性的分析中起作用。
问题在于当前可用的分析方法都需要有技术的技术人员，只有几种技 术成功地适用于选择的被分析物的检测，并且没有既是均相的又在各种分 析条件下对各种被分析物都灵敏的方法。因此，技术人员希望得到一种易 于使用的均相分析方法，其耗时少于异相分析，具有高灵敏度和精密度而 且能实现自动化。

发明内容
本发明提供的教导主要涉及利用多核苷酸和结合分子检测溶液中的 被分析物的方法，其中该方法利用了酶活性的竟争性干扰和恢复。该教导还涉及用于实施该方法的试剂和试剂盒。
在某些实施方案中，本发明的教导涉及了测定溶液中被分析物的浓度
的方法。该方法包括选择结合化合物；选择被分析物的类似物并使类似物 结合到多核苷酸底物以构成试剂，用于利用期望的多核香酸反应测定分析 溶液中被分析物的含量。分析溶液中试剂与结合化合物的结合与分析溶液 中被分析物与结合化合物的结合相竟争。该方法还包括选择用于催化期望 的多核苷酸反应的期望的酶。
选择并构成成分后，可以选择该方法中使用的成分的相对用量。同样
的酶的量:确定结合化合物与试剂的期望比率。'、、'，
然后形成分析溶液，其包含一定量的结合化合物和含量待测的被分析 物。随后，将一定量的试剂加到分析溶液中，其中试剂的用量和结合化合 物的用量实现了结合化合物与试剂的期望比率。再向分析溶液中加入预先 选定用量的期望的酶，用于催化期望的多核苷酸反应。然后测定期望的多 核苷酸反应中期望的酶活性，来确定分析溶液中被分析物的含量。测定酶 活性的方法的例子包括但不限于技术人员所知的荧光和吸光率测定方法。
在某些实施方案中，结合化合物包括配体结合分子、抗体或细胞受体。 在某些实施方案中，类似物包含被分析物的结构或者为具有被分析物的分 子结构的化合物。在某些实施方案中，多核香酸底物包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或二者的组合。在某些实施方案中，多核苷酸底物为双链
DNA或单链DNA。
在某些实施方案中，期望的多核苷酸反应包括核苷酸聚合反应、核苷 酸裂解反应或者核苷酸聚合反应和核苷酸裂解反应的组合。在某些实施方 案中，期望的多核苷酸反应包括核苷酸重组反应。
在某些实施方案中，本发明的教导涉及用于竟争性结合分析的试剂。 该试剂可以包括结合到类似物的多核苷酸底物，并且可以选择类似物(i) 与分析溶液中预先选定的结合化合物相结合；以及(ii)与分析溶液中被 分析物与预先选定的结合化合物的结合相竟争。可以选择多核苷酸底物参 与期望的多核苷酸反应，该反应通过分析溶液中结合化合物与类似物的结 合而抑制或终止。
在某些实施方案中，本发明的教导涉及用于测定分析溶液中被分析物 含量的竟争性结合分析试剂盒。该试剂盒包含上述试剂，以及用于竟争性
6结合分析的结合化合物，其中分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分 析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竟争。试剂盒还包括用于催化期 望的多核苷酸反应的酶，其中测定酶的活性用于确定分析溶液中被分析物 的含量。


图1A至1C说明了根据某些实施方案，聚合酶活性的干扰和恢复的原理。
图2A至2C说明了根据某些实施方案，核酸外切酶活性的干扰和恢复 的原理。
图3A至3C说明了根据某些实施方案，聚合酶反应干扰和核酸外切酶 干扰的循环以及恢复循环的原理。
图4A至4C说明了根据某些实施方案，转移酶活性的干扰和恢复的 原理。
图5说明了根据某些实施方案，利用聚合酶反应干扰的竟争性结合分 析方法。
图6说明了根据某些实施方案，利用核酸外切酶反应干扰的竟争性结 合分析方法。
图7说明了根据某些实施方案，利用转移酶反应干扰的竟争性结合分 才斤方法。
图8说明了根据某些实施方案，如何使用实时PCR测定聚合酶反应的 抗-Dig^元体的干扰。
具体实施例方式
本发明提供的教导主要涉及利用多核苷酸和结合分子检测溶液中被 分析物的方法，其中该方法利用酶活性的竟争性干扰和恢复。本发明提供 的教导包括均相分析。
本发明的教导还涉及用于实施该方法的试剂和试剂盒。 在本发明教导的每种方法中，多核苷酸反应的程度被用于测定溶液中 被分析物的含量。在某些实施方案中，多核苷酸反应可以是使用聚合酶的 聚合反应、使用核酸外切酶的裂解反应、循环使用聚合酶和核酸外切酶的 聚合和裂解反应的循环，或重组反应。
7图1A至1C说明了根据某些实施方案，聚合酶活性的干扰和恢复的原 理。不想受任何理论或作用机理的限制，据信所发生的聚合酶活性的干扰 和恢复如下图1 (A)说明了由聚合酶106催化的聚合反应，其中多核 苷酸底物102结合类似物104。在某些实施方案中，多核苦酸底物102与 类似物104可以组合成试剂。选择的类似物104与预先选定的结合化合物 108相结合，干扰聚合反应。在图1A中，聚合酶106用于聚合反应以生 成双链多核苷酸112。在图1B中，结合化合物108结合类似物104，并干 扰聚合反应，这样通过加入结合化合物108来抑制或终止聚合反应。在图 1C中，被分析物IIO也能与结合化合物108结合，并与结合到结合化合物 108的类似物104相竟争。结合的竟争阻碍了一部分可用的结合化合物 108,从而导致某些聚合反应的恢复，生成双链多核苷酸112。被分析物的 含量决定了恢复的量，因此恢复的量可以测定被分析物的含量。
图2A至2C说明了根据某些实施方案，核酸外切酶活性的干扰和恢复 的原理。不想受任何理论或作用机理的限制，据信发生的核酸外切酶活性 的干扰和恢复如下图2A说明了由核酸外切酶206催化的裂解反应，其 中多核苷酸底物202结合类似物204。所选的类似物204与预先选定的结 合化合物208相结合，干扰裂解反应。在图2A中，裂解反应中使用核酸 外切酶206将双链多核苷酸202裂解为部分降解的多核苷酸212,最终成 为单链多核香酸。在图2B中，结合化合物208结合类似物204,并干扰 裂解反应，这样通过加入结合化合物208来抑制或终止裂解反应。在图2C 中，被分析物210也能与结合化合物208结合，与结合到结合化合物208 的类似物204相竟争。结合的竟争阻碍了 一部分可利用的结合化合物208, 从而导致某些裂解反应的恢复，单链多核苷酸214的生成。被分析物的含 量决定了恢复的量，因此恢复的量可以测定被分析物的含量。
图3A至3C说明了根据某些实施方案，聚合酶反应干扰和核酸外切酶 干扰的循环以及恢复循环的原理。不想受任何理论或作用机理的限制，据 信所发生的聚合酶和核酸外切酶反应循环的干扰和恢复活性如下图3A 说明了包括采用聚合酶303的多核苷酸底物302的聚合和采用核酸外切酶 305的裂解的循环反应。如图1和图2所示，被选的类似物304结合到结 合化合物308。在图3B中，所示的结合化合物308干扰循环的两个阶段， 聚合和裂解。在图3C中，被分析物310也能与结合化合物308结合，与 类似物304竟争性结合到结合化合物308。该竟争性结合阻碍了一部分可利用的结合化合物308,从而导致某些裂解反应和聚合反应的恢复，导致 多核苷酸底物302形成双链多核苷酸和该双链多核苦酸降解的循环增长。 被分析物的含量决定了恢复的量，故可以用恢复的量来测定被分析物的含 量。循环的作用是通过放大测得的信号来提高检测的灵敏度，其中放大的 程度取决于检测过程中使用的循环次数。
图4A至4C说明了根据某些实施方案，转移酶活性的干扰和恢复的 原理。不想受任何理论或作用机理的限制，据信所发生的转移酶活性的干 扰和恢复如下图4A说明的多核苷酸底物402是单链多核苷酸。单链多 核苷酸402为本实施例中的靶多核苷酸。转移酶403和双链多核普酸探针 405与单链靶多核苷酸402相结合发生重组反应，其中的靶多核苷酸402 取代FAM-标记的多核苷酸409生成重组的双链多核香酸407。在图4B中， 结合化合物408结合到类似物404,干护O重组反应，这样通过加入结合化 合物408来抑制或终止重组反应。在图4C中，-故分析物410也能与结合 化合物408结合，与类似物404竟争性结合到结合化合物408。该竟争性 结合阻碍了一部分可利用的结合化合物408,从而导致某些重组反应的恢 复，生成重组双链多核香酸407。被分析物的含量决定了恢复的量，故可 以用恢复的量来测定被分析物的含量。
本发明的内容主要涉及测定溶液中被分析物浓度的方法，该方法包括 上文讨论的某些形式的反应。在某些实施方案中，期望的多核苷酸反应包 括核苷酸聚合反应、核苷酸裂解反应或者核苷酸聚合反应和核苷酸裂解反 应的组合。在某些实施方案中，期望的多核苷酸反应包括核苷酸重组反应。 在某些实施方案中，与现有可使用的均相分析相比，期望的反应获得了明 显更高的灵敏度，这是通过循环反应，使用实时PCR，使用序列长度超过 lkb或更长的多核苦酸底物，或它们的组合来实现的。
可以利用荧光信号的出现或消失来检测被分析物，所述荧光信号由化 学药品产生，如与寡核苷酸结合的染料；或者来自吸收光谱，如UV-可见 光语信号。在某些实施方案中，检测包括识别由酶偶联反应产生的化学发 光信号。在某些实施方案中，可以通过使用实时PCR检测来提高检测的灵 敏度。在某些实施方案中，可以使用化学染料，例如PICOGREEN来检测 双链多核苦酸。在某些实施方案中，用荧光素和darkquencher预先标记双 链探针，这样可以用于检测转移酶活性。在某些实施方案中，可以使用荧 光共振能量转移技术(FRET)来检测荧光信号。技术人员将认识到多种
9已知检测系统中的任何一种都可以用于补充本发明提供的内容。
本发明提供的内容主要涉及均相分析，其中无需从其他反应成分中分 离出流体样品就可以检测被分析物的存在和含量。异相分析与均相分析的 区别在于，异相分析的反应介质包含至少两个独立的相，如具有附着的用 于结合被分析物的试剂的固相载体和含有被分析物的流体介质。
该方法包括选择结合化合物；选择被分析物的类似物并将类似物与多
核苷酸底物结合以构成试剂，利用期望的多核苷酸反应来测定分析溶液中 被分析物的含量。分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分析溶液中被 分析物与结合化合物的结合相竟争。
技术人员将认识到，被分析物可以为流体分析样品中可以确定其存在 和含量任何化合物。被分析物的例子包括但不限于毒素、管制药物、激素、 小分子药物、生物药品、核酸、蛋白质、肽、免疫球蛋白或它们的片段、 抗原或细菌或病毒颗粒，其在免疫或其他反应中能与配体反应。
结合化合物的选择取决于样品中要确定和/或定量的被分析物的结构。 例如，若被分析物为抗原，抗原的抗体可以用作适合的结合化合物。若被 分析物为细胞因子，例如细胞受体可以用作细胞因子的适合的结合化合 物。因此，在某些实施方案中，结合化合物包括配体结合分子、抗体或细 胞受体。这些结合化合物的例子可以包括但不限于免疫球蛋白、维生素结
合蛋白、IL-1受体、T-细胞受体等。
结合化合物的选择至少部分取决于结合化合物与被分析物和类似物 的相对结合亲和力。以配体结合分子为例，其可以包括对另一目标化合物 具有高结合亲和力的任何分子。在某些实施方案中，结合亲和力的范围为 从大约lxlO"M到大约lxlO"M、从大约lxl(^M到大约lxl(T7M、从大 约5xlO-5M到大约5xlO"M以及从大约8xl(r5M到大约2xlO-6M。
类似物的选择也取决于样品中要确定和/或定量的被分析物的结构。在 某些实施方案中，类似物包括被分析物的结构或为具有被分析物分子结构 的化合物。可使用本领域技术人员已知的任何方法将类似物结合到底物。 例如，类似物可以为结合到接头的被分析物，并且接头结合到多核苷酸底 物。但是，类似物与多核苷酸底物的结合可以使用接头，也可以不使用接 头，这取决于各实施方案。
多核苷酸底物的选择应当对应于所选择的期望的多核苷酸反应，该期 望的多核苷酸反应可以是例如聚合反应、裂解反应、聚合和裂解的循环或
10重组反应。在某些实施方案中，多核苷酸底物包括多核芬酸引物、多核苷 酸模板或者它们的组合。
在某些实施方案中，多核苷酸底物为单链或双链的。在某些实施方案
中，多核苷酸底物为双链DNA或单链DNA。在某些实施方案中，多核苷 酸底物可以包括RNA。在某些实施方案中，多核苦酸可以包括至少10个 核苷酸的序列。在某些实施方案中，多核香酸底物包括至少20个核苦酸、 至少30个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苦酸、至少100个核 苷酸或至少200个核苷酸的序列。事实上，在某些实施方案中，多核苷酸 底物可以更长，具有至少500个核普酸，甚至1000个核苦酸或更长的长 度。在某些实施方案中，多核苷酸底物可以包括起始区域、启动子区域或 者它们的组合。起始区域可以包括聚合反应起始的核苷酸序列，可以在单 链或双链多核苦酸上。启动子区域可以指双链起始区域，并且在某些实施 方案中，通过将寡核苷酸或引物退火到单链多核苷酸的起始区域而形成双 链起始区域，其中寡核苷酸或引物是与起始区域互补的。
本领域技术人员将理解如何形成用于本发明描述的聚合反应、裂解反 应或重组反应的多核苷酸底物。在某些实施方案中，多核苷酸包括至少20 个核苦酸残基，各残基包括噪呤或嘧咬碱基、糖和磷酸酯，且通常通过磷 酸二酯键与其他残基相连接。核苦酸应具有包括本发明所述的起始区域的 核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸可以为具有噬菌体启动子的双 链多核苷酸，该噬菌体启动子如T7 RNA聚合酶启动子或QB噬菌体启动 子。在某些实施方案中，多核苷酸可以为含有启动区域的单链多核苷酸。 功能性启动子区域可以通过将短链寡核苷酸引物退火到启动区域来形成 功能性启动子。在某些实施方案中，多核苷酸可以包含多于一个启动子的 序列。
在某些实施方案中，类似物通过接头连接到多核苷酸。选择的接头实 质上不会影响期望的聚合、裂解或重组反应，当然其不应实质上影响结合 化合物结合到类似物的能力。在某些实施方案中，可以使用生物素和/或抗 生物素蛋白作为接头。
本发明提出的教导为技术人员提供了 一种检测各种分析溶液中任何 一种中被分析物的含量的新方法，所述分析溶液如生物或非生物的流体样 品。在某些实施方案中，分析为免疫分析，在某些实施方案中，样品为血 清样品。样品可以为体液，例如血液、血清、血浆、脊髓液、精液、唾液、积液、分泌物、脓液、羊水、尿液、粪便、获自浓缩的肺呼出物或分泌物 的流体、细胞组织等。在某些实施方案中，流体样品可以为培养基、药理 学试剂样品、食物样品、乳制品、水样品等。在某些实施方案中，样品可 以为工业流体才羊品。
在某些实施方案中，本发明提供的教导可以用于检测目前通过异相系 统检测的被分析物，包括免疫原性被分析物，如抗体，或非免疫原性被分
析物，如糖蛋白。以T-细胞受体为例，如CD4可以用作抗fflV抗体的结 合化合物。或者作为另一个例子，识别糖蛋白上的多糖的凝集素可以用作 糖蛋白的结合化合物。
本发明提供的教导可用于测定样品中维生素D3的浓度。维生素D3 是一种前激素，长期以来已知其在调节体内钙和磷水平，以及骨骼矿化中 的重要作用。在维生素D3快速扩展的研究领域中，临床应用很大程度上 不得不受到所使用的方法的限制，同样地，技术人员希望具有使用本发明 教导的方法来检测维生素D3水平的能力。在某些实施方案中，被分析物 可以为维生素D3;类似物可以包括维生素D3或其书f生物，并且可以与多 核苷酸相结合以形成分析试剂；以及可以使用抗-维生素D3抗体作为结合 化合物。可以选择KlenowDNA聚合酶用于酶反应。当抗-维生素D3抗体 结合到试剂时会阻碍Klenow酶活性。样品中游离的维生素D3通过竟争性 结合到抗-维生素D3抗体使Klenow酶活性恢复，Klenow酶活性恢复的量 可以确定样品中维生素D3的含量。
药物滥用是当今社会的重要问题，因此，本领域人员期望改进的简单、 准确且并t确测定药物水平的方法。然而，目前该领域内仍然Y吏用异相分析， 该领域将从本发明所教导的方法中受益。本发明提供的教导可以用于检测 例如可卡因。在某些实施方案中，被分析物可以为可卡因；类似物可以包 括可卡因或其衍生物，并且可以与多核苦酸相结合以形成分析试剂；并且 抗-可卡因抗体可以用作结合化合物。可以选择Klenow DNA聚合酶用于 酶反应。样品中的可卡因将竟争性结合到抗-可卡因抗体。恢复Klenow酶 的活性对应于样品中可卡因的浓度。当抗-可卡因抗体结合到试剂时，会阻 碍Klenow酶活性。样品中的游离可卡因通过竟争性结合到抗-可卡因抗体 而恢复Klenow酶活性，Klenow酶活性恢复的量可以确定样品中的可卡因 的含量。
使用本发明提供的方法，还可以容易地测定具有较大分子体积的被分析物。以钠尿肽(BNP)和钠尿肽原(proBNP)为例，它们可用于评估心 力衰竭、左心室功能不全和急性冠状动力永综合征。proBNP是心脏疾病的 重要心脏标记物，技术人员期望有一种易于使用、准确且精确的检测 proBNP的方法。在某些实施方案中，被分析物为proBNP,抗-proBNP单 克隆抗体可以用作结合化合物。而且类似物可以包含proBNP的抗原决定 簇一可以被抗-proBNP抗体识别的肽，可以与多核普酸结合形成试剂。可 以选择Klenow DNA聚合酶用于酶反应。当抗-proBNP抗体结合到试剂时， 会阻碍Klenow酶活性。样品中的游离proBNP也包括该抗原决定蔟，将 通过竟争性结合到抗-proBNP抗体来恢复Klenow酶活性，Klenow酶活性 恢复的量将确定样品中的proBNP的含量。
工业样品还可以包含目标被分析物，同样地，本发明教导的方法可适 用于工业样品。例如在环境研究中，还可以用本发明检测污染土壤样品中 的风化油(weathered oil )。溶剂可萃取物质(SEM)可以用于免疫动物并 在动物中形成抗体，以致于形成抗-SEM抗体。在某些实施方案中，被分 析物为SEM,类似物可以包括SEM并可以与多核苦酸相结合以形成试剂。 可以选择Klenow DNA聚合酶用于酶反应。当抗-SEM抗体与试剂相结合 时，会阻碍Klenow酶活性。样品中的游离SEM将通过竟争性结合到抗 -SEM抗体而恢复Klenow酶活性，Klenow酶活性恢复的量将确定样品中 的SEM的含量。
生物素(维生素H或B7)是与抗生物素蛋白结合的小分子， 一种具 有高亲和力的四聚体蛋白。同样地，生物素常用作与抗生物素蛋白相结合 的标记化合物。在某些实施方案中，各种被分析物中的任何一种都可以用 生物素标记，使用本发明教导的方法来定量4企测。可以选择生物素标记的 化合物作为被分析物，类似物可以包括生物素并可以与多核苷酸相结合以 形成试剂。抗生物素蛋白可以用作结合化合物，可以选择Klenow DNA聚 合酶用于酶反应。当抗生物素蛋白结合到试剂时，会阻碍Klenow酶活性。 样品中游离的生物素-标记的被分析物将通过竟争性结合到抗生物素蛋白 而使Klenow酶活性恢复，Klenow酶活性恢复的量将确定样品中的被分析 物的含量。
在选择并构建了用于特定用途的成分后，可以选择成分的相对量来优 化该方法的应用。优化该方法的应用包括针对分析溶液中特定浓度的被分 析物，确定结合化合物与试剂的期望比率。该步骤包括提供预先选定的期
13望量的酶来催化期望的反应。通过确定期望的反应的动力学来选择期望的
酶的期望用量和类型。酶的例子包括但不限于聚合酶，如DNA聚合酶和 RNA聚合酶；核酸酶，如核酸外切酶；转移酶，如RecA, RadA， Rad51等， 其中酶可以利用寡核香酸作为底物。
建立结合化合物的系列浓度来确定结合化合物与试剂的期望比率。基 于预期的待测被分析物的浓度范围来选择结合化合物的浓度范围。每种检 测样品分别基于每种结合化合物的浓度，包括固定量的酶和固定量的试 剂。在某些实施方案中，例如，试剂的固定量可以是与被分析物的预期量 等摩尔的试剂的量。在某些实施方案中，所使用的试剂的量可能取决于试 剂如何充分地与被分析物竟争性结合结合化合物。
一旦针对预期的被分析物的浓度范围确定了结合化合物与试剂的期 望比率，就可以将结合化合物与试剂的期望比率固定，绘制被分析物-浓度 标准曲线，用于测定期望的多核苷酸反应中期望的酶的活性。被分析物-浓度标准曲线可以基于具有在预期范围内的一 系列被分析物浓度的一 系 列溶液、固定量的期望的酶、具有期望比率的固定量的结合化合物与试剂。 被分析物-浓度标准曲线可以用于确定分析溶液中被分析物的含量。
绘制出被分析物浓度标准曲线后，配制含有待测被分析物和一定量结 合化合物的分析溶液。然后向分析溶液中加入一定量的试剂，使结合化合 物与试剂达到期望的比率。再将预先选定量的期望的酶加到分析溶液中催 化期望的多核苷酸反应。然后在期望的多核苷酸反应过程中测定期望的酶 的活性，使用被分析物-浓度标准曲线确定分析溶液中被分析物的含量。
在某些实施方案中，本发明的内容涉及用于竟争性结合分析的试剂。 该试剂可以包括与类似物结合的多核苷酸底物，可以选择类似物(i)与分 析溶液中预先选定的结合化合物相结合；以及(ii)与分析溶液中被分析 物与预先选定的结合化合物的结合相竟争。可以选择多核苷酸底物参与期 望的多核苷酸反应，该反应通过在分析溶液中结合化合物与类似物相结合
而#:抑制或终止。
在某些实施方案中，本发明的内容涉及用于测定分析溶液中被分析物 的含量的竟争性结合分析试剂盒。试剂盒包含上述的试剂，以及用于竟争 性结合分析的结合化合物，其中分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与 分析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竟争。该试剂盒还包括用于催 化期望的多核苷酸反应的酶，其中测定酶的活性可以确定分析溶液中浮皮分
14析物的含量。 实施例1
在聚合酶反应中利用抗-被分析物抗体干扰聚合
该实施例i兌明抗4皮分析物抗体如何被用作结合分子，以剂量依赖性的
方式有意干扰聚合酶反应中的聚合。选择的结合分子与类似物结合，该类
似物结合到DNA模板、引物或二者，并且结合分子与类似物的结合干扰 聚合酶反应。
选择用于聚合酶反应的DNA模板。所选择的DNA模板是下列的51 mer单链寡核香酸
ATGTCTC國3， ( SEQ ID NO:7 )
还可选择用于该反应的引物序列。该引物序列是下列的寡核苷酸 5'-GAGACAUGG画3， ( SEQ ID NO:4 )
类似物与本实施例中的引物相结合。采用本领域技术人员已知的方法 把尿嘧啶(U)结合到类似物。所选择的类似物为地高辛(Dig ) ( Chevalier J.at.al. 1907)。而且如上所述，进行Dig与引物的结合来构建具有用于结 合分子的结合4立点的试剂。选择抗-Dig抗体Fab片|更(Roche Diagnostics, 德国)作为本实施例的结合分子。
制备50(xL反应混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10mMMgCl2、各种dNTP 2.5 nmol、 17nM模板/引物寡核苷酸以及 按1:200稀释的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego )。将Fab片段以系列 浓度加到反应混合物中，该系列浓度包括浓度为5 nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160 nM和320 nM。将反应混合物在室温下孵育5分钟， 再力口入1单位DNA聚合酶Klenow (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)以启动聚合酶反应。再孵育5分钟后，通过产生的荧光来检测DNA 聚合酶反应生成的双链DNA。使用480nm激发波长在520nm波长处检测 荧光信号(Wittwer, C.T., et. Al 1997a )。
抗-Dig抗体以剂量依赖性方式明显抑制了 DNA聚合酶链反应。在双 链DNA的形成过程中，累积了聚合酶反应的副产物一焦磷酸(PPi)。根 据以下原理，通过4企测所生成PPi的量来确定反应的程度
15,"nn. An。ATP硫酸化酵 一
(1) PPi + APS - ATP
(2) ATP+萤火虫荧光素 狄絲> AMP + PPi+氧化荧光素+光
酶一无才几焦磷酸酶催化PPi转化为两个当量的Pi，可以用于放大检测 并提高检测的灵敏度，因为一分子PPi分解为两分子Pi。裂解的无机磷酸 盐(Pi)与2-氨基-6-巯基-7-甲基噤呤核糖核苷(MESG)反应，由噤呤核 苷磷酸化酶(PNP)经酶催化形成核糖1 -磷酸盐和2-氨基-6-巯基-7-甲基 。票呤。MESG的酶转化导致最大吸光率的移位，其中最大吸光率从底物的 330nm移到产物的360nm。该分析能够检测到小到lmL反应混合物中的1 nMPPi，可以在6.5到8.5的pH值范围内操作。
所释》丈的无机磷酸盐(Pi)还可以按以下方法4企测
a 蔗糖磷酸化酶 a a
(1) Pi+蔗糖歸稚两一 0^-葡萄糖-1^+果糖
(2) a-D-葡萄糖小Pi葡萄糖磷鼓位酶,a_D_,_6_Pi
(3 ) a-D-葡萄糖-6-Pi+NAD(P)葡萄糖_6^脱氣酵>0_葡萄糖酸-5一内
酉旨-6-Pi十NAD(P)H
其中，在340nm处监测生成的NAD(P)H。
实施例2
在聚合酶反应中利用抗-被分析物抗体干扰聚合来检测样品中被分析 物的浓度
除非另外指明，本实施例使用实施例1教导的条件和材料。实施例1 描述了在聚合酶反应中，抗-被分析物抗体如何干扰聚合以及如何以剂量依 赖的方式干扰聚合。本实施例说明在被分析物存在下，如何使用干扰来检 测样品中^皮分析物的浓度。
制备50pL的反应混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、每种dNTP 2.5 nmol、按1:200稀释的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego)以及抗-Dig抗体Fab片#殳(Roche Diagnostics, Germany) 33nM。选择被分析物以测试竟争性结合被分析物的检测技术。选择Dig作为被分析物，并且向反应混合物中加入具有不同Dig被分析物 浓度的样品来与Dig类似物竟争性结合抗体。本实施例中所使用的Dig最 大浓度为1600nM。
如上所述，Dig被分析物的类似物也是Dig，其中该Dig结合到引物 的尿嘧啶核苷，以实现与Dig被分析物竟争性结合抗体结合分子的目的。 浓度为17nM的模板/引物寡核苷酸，与1单位DNA聚合酶Klenow相结 合来启动聚合酶反应。
图5说明了根据某些实施方案，利用聚合酶反应干扰的竟争性结合分 析。如图5所示，DNA聚合酶活性随着被分析物Dig浓度的增加而增强， 相应的PICOGREEN荧光也是如此。因此，该结果表明如何通过竟争性结 合分析来检测被分析物的浓度，本实施例中的被分析物为Dig,所述竟争 性结合分析包括聚合酶反应干扰和恢复技术。
实施例3
在核酸外切酶反应中利用抗-被分析物抗体干扰裂解 实施例1和实施例2描述了如何通过利用抗-:帔分析物抗体干扰聚合反 应来使用竟争性结合分析测定被分析物的浓度。本实施例使用抗-被分析物 抗体干扰核酸外切酶裂解反应来测定样品中被分析物的含量。
核酸外切酶反应中被裂解的底物是下列双链DNA ( dsDNA)片段 正义链序列为
ATGTCTCTCTGAC-3， ( SEQ ID NO:5 )
用Dig在序列的3，端标记作为被分析物的类似物，其中该类似物与被分析
物竟争性结合结合分子。
反义链序列为
5'國GTCAGAGAGACATGGTGGTGTTGTGGTTGGTGTGTGTTGGTTGTG TGTGGTGTTGGT-3， ( SEQ ID NO:l )
制备90)iL的反应混合物，其中包含67 mM甘氨酸-KCl (pH 9.4)、 2.5 mM MgCl2、 50ug/mL BSA、 10 nM结合dsDNA的Dig以及按1:200稀 释的PICOGREEN( Invitrogen, San Diego )。将抗-Dig抗体Fab片段(Roche Diagnostics,德国)按照系列浓度加到反应混合物中，系列浓度包括浓度为 5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。将反应混合物在室温下孵育5分钟，再加入2.5单位入-核酸外切酶 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)来启动裂解反应，选择性地 从5'端水解dsDNA,形成ssDNA ( Tolun, G.和Myers, R. S. 2003 )。再孵 育5分钟后，通过4全测荧光来检测核酸外切酶活性，其中降解的dsDNA 显示出荧光逐渐消失。当结合分子一抗-Dig抗体Fab片段存在时，荧光信 号仍然很强，表明抗-Dig抗体干扰入-核酸外切酶的活性并且以剂量依赖 性方式干扰入-核酸外切酶的活性。
实施例4
在核酸外切酶反应中利用抗-被分析物抗体干扰裂解来测定样品中被 分析物的浓度
除非另外指明，本实施例使用实施例3教导的条件和材料。实施例3 显示了在核酸外切酶反应中，抗-被分析物抗体如何千扰dsDNA的裂解， 以及如何以剂量依赖性方式干扰dsDNA的裂解。该实施例说明了在纟皮分 析物存在时，如何使用干扰来测定样品中被分析物的浓度。
在本实施例中，上述的抗-Dig抗体首先与Dig被分析物混合，使得被 分析物阻碍抗体的程度对应于被分析物的浓度，使试剂与核酸外切酶自由 反应达到试剂不再结合抗体的程度。在这种情况下，试剂为结合到Dig类 似物的dsDNA。固定抗体的浓度，以不同的浓度加入被分析物。本实施例 中所使用的Dig的最大浓度为960 nM。
随着被分析物浓度降低，通过核酸外切酶反应裂解的游离试剂的量也 降低。使用PICOGREEN的荧光检测测量的是核酸外切酶活性的变化，由 此确定被分析物的浓度。
图6说明了根据某些实施方案，利用核酸外切酶反应干扰的竟争性结 合分析。如图6所示，随着被分析物Dig浓度的增加，核酸外切酶活性增 强，正如PICOGREEN荧光相应的降低所表明的。如图6所示，被分析物 的浓度，在本实施例中净皮分析物为Dig,可以通过包括核酸外切酶反应干 扰和恢复技术的竟争性结合分析来测定。
备选地，核酸外切酶反应活性以及由此确定的被分析物浓度，还可以 通过使用dNMP (入-核酸外切酶反应的另一产物)脱氢酶偶联NADH或 NADPH来监测。
18循环进行聚合酶-核酸外切酶反应干扰的组合来放大检测信号，检测样 品中较低浓度的被分析物
以上实施例2和实施例4利用聚合酶反应的聚合干扰过程或核酸外切 酶反应的裂解干扰过程中检测的信号来确定样品中被分析物的浓度。本实 施例说明可以利用(i)聚合酶反应中抗-被分析物抗体对聚合的干扰，以 及(ii)核酸外切酶反应中抗-被分析物抗体对裂解的干扰的循环来明显放 大检测信号，甚至以更高的灵敏度来测定样品中的被分析物的浓度。
同样地，本实验表明DNA聚合酶和A-核酸外切酶可以组合形成循环 分析，该分析明显放大了用于测定样品中被分析物的浓度的检测信号，甚 至可以检测出更低浓度的被分析物。除非另外指明，本实施例使用实施例 1教导的条件和材料。
向反应混合物中同时加入1单位聚合酶和2.5单位入-核酸外切酶。由 DNA聚合酶合成的dsDNA入-核酸外切酶/人DNA纟莫板上降解并除去， 生成多个焦石克酸(PPi)、 dAMP、 dCMP、 dGMP和dTMP。多次;改大4企测 信号，分别通过PPi分析和单核苷酸分析来4企测释放的PPi和dNMPs。
当Dig被分析物不存在时，抗-Dig抗体抑制DNA聚合酶的活性。当 加入Dig被分析物时，聚合酶和入-核酸外切酶的活性提高。因此，本实施 例说明使用PPi分析和单核苷酸分析所检测到的信号与样品中Dig被分析 物的含量成比例。
实施例6
在转移酶反应中利用抗4皮分析物抗体干"f尤重组
上述实施例2和实施例4描述了聚合或裂解反应的干扰如何影响酶的 活性并生成用于检测样品中被分析物的信号。本实施例描述了在转移酶反 应中，如何使用抗-被分析物抗体对重组的干扰来检测样品中被分析物的浓 度。
选择双链探针和单链靶点用于重组反应。双链DNA探针序列具有以 下结构
5'FAM國AAACTAATAAGATTTACA-ACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:3 );和 3'-DABYL画TTTGATTATTCT-AAATGTTGTTAAAGAG-5， ( SEQ ID NO:2 )
单链耙点具有与5，FAM寡核香酸相同的序列。
195，-AAACTAATAAGATTTACAACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:6 ),但 是该ssDNA为与类似物结合的多核苷酸，用以提供与结合分子相结合的 位点，干扰重组反应，转移酶反应。在本实施例中，T"与Dig分子相结 合。
制备60pL反应混合物，其中包含70mM Tris-HCl ( pH 7.6 )、 12 mM MgCl2、 0.3mMATP， ( ATP再生系统还需要3mM磷酸烯醇式丙酮酸盐和 30U/ml丙酮酸激酶)，4.5 uM (以核苷酸的形式)靼单链Dig-DNA, 3uM RecA (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA )。将抗-Dig抗体Fab片#爻 (Roche Diagnostics,德国)按照系列浓度加到反应混合物中，系列浓度包 括浓度为5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。
在37。C下孵育反应混合物3分钟，使抗体与类似物相结合，所述类似 物与单链靶点相结合。随后将4.5 uM (在核香酸中)的双链探针DNA加 到反应混合物中。
于37'C下再赙育3分钟后，在RecA DNA转移酶催化下，通过双链' DNA中FAM-标记的5，-序列与不含FAM的5，-耙单链DNA耙序列的交换 产生荧光信号。使用4卯nm激发波长在520nm波长处监测焚光信号。当 结合分子一抗-Dig抗体Fab片段存在时，荧光信号降低，表明抗-Dig抗体 干扰转移酶RecA的活性，并且以剂量依赖性的方式干扰转移酶RecA的 活性。
实施例7
在转移酶反应中利用抗-被分析物抗体对重组的干扰来检测样品中被 分析物的浓度
除非另外指明，本实施例使用实施例6中教导的条件和材料。实施例 6描述了在转移酶反应中，抗-被分析物抗体如何干扰dsDNA探针和ssDNA 靶序列之间的重组反应，以及如何以剂量依赖性方式干扰dsDNA探针和 ssDNA靼序列之间的重组反应。本实施例描述了在被分析物存在时，如何 利用干扰来检测样品中被分析物的浓度。
选择Dig作为被分析物，将含有不同浓度的Dig被分析物的样品加到 反应混合物中，与Dig类似物竟争性结合抗体。本实施例中所使用的Dig 最大浓度为650nM。
上述的抗-Dig抗体首先与Dig被分析物混合，使被分析物对抗体的阻碍程度与被分析物浓度相对应，使试剂与转移酶自由反应达到试剂不与抗
体结合的程度。这种情况下，试剂为结合到Dig类似物的ssDNA。固定抗 体的浓度，随着被分析物浓度的降低，用于RecA转移酶反应重组的游离 试剂的量也降低，检测520 nm的荧光测定转移酶活性的变化，由此确定 被分析物的浓度。
图7说明了根据某些实施方案，利用转移酶反应干扰的竟争性结合分 析。如图7所示，转移酶活性随着被分析物Dig浓度的增加而增强，相应 的520 nm处的焚光也是如此。因此，-故分析物的浓度，在本施实施例中 被分析物为Dig，可以通过竟争性结合分析来测定，在本实施例中，包括 RecA转移酶反应干扰和恢复技术。
实施例8
在聚合酶反应中利用抗-被分析物抗体干扰聚合一检测结果是产物收 率而非荧光或吸光率
除非另外指明，本实施例使用实施例1使用的条件和材料。实施例1 至7表明可以检测聚合酶活性、核酸外切酶活性或转移酶活性并用来确定 样品中被分析物的含量。在实施例中，使用的与被分析物浓度相关的测量 值包括PICOGREEN焚光和UV吸光率。还可以使用实时定量PCR来提 高检测的灵壽文度和精密度。
基于新合成的DNA链设计PCR引物。它们仅检测新合成的DNA。 在本实施例中，酶的活性与用Dig类似物标记的游离底物或抗-Dig抗体的 浓度相关。制备25pL的反应混合物，其中包含10mMTris-HCl(pH7.9)、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、 1 mM DTT、各种dNTP2.5nmo1、 1单位Klenow DNA聚合酶、1.25单位Taq DNA聚合酶、0.1 nM DNA模板/Dig结合引物 混合物以及各种PCR引物200 nM。提供各种浓度的抗体Fab片段(Roche Diagnostics,德国),最大浓度为666nM,最小浓度约10nM。
图8说明了根据某些实施方案，如何使用实时PCR测定抗-Dig抗体 对聚合酶反应的干扰。如图8所示，正如使用实时PCR检测所确定的，聚 合酶活性随着结合化合物(抗-DigFab片段，[AB])的浓度的增加而降低。 实时PCR测定了所形成的相关的聚合产物，其中100°/。相关的产物应对应 于反应混合物中无抗体。相关聚合产物的减少对应于所加入的抗体或结合 化合物的量增加。应注意到实时PCR提供了非常灵敏的检测，同样地，仅
21使用0.1 nM的多核苷酸底物。在此浓度时，10nM的抗体影响很小。因 此，实时PCR是另 一种可以用于检测上述教导的任意一种酶活性的检测方 法，在确定样品中被分析物的含量时具有更高的灵敏度、精密度和准确性。 仅使用常规实验，本领域技术人员将意识到或能够确认，本发明描述 的特定实施方案有许多等同方式。技术人员可以在超出特定实施方案的范 围内实践本发明教导的概念。这样的等同方式将包括在以下的权利要求书 中。此外，还有许多本发明教导和要求的列表和群组。技术人员将认识到 每种这样的列表和群组包含不同的种类，并且可以通过移除或添加一个或 多个种类来修饰，因为每个本发明教导和要求的列表和群组可以不适用本 发明实施的每个可行的实施方案。序列表
<110>博尔诚(北京)科技有限公司
<120> 利用酶活性的竟争性干扰和恢复检测被分析物
<130> DIC08110170
<150> US12/004,281 <151> 2007-12-20
<160> 7
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"i兌明的示例序列 <400> 1
gtcagagaga catggtggtg ttgtggttgg tgtgtgttgg ttgtgtgtgg tgttgg %
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"i兌明的示例序列<formula>formula see original document page 24</formula><400> 5
3ccaacacca cacacaacc3 acacacacc3 accacaacac cacc3tgtct ctctg3c 57
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于说明的示例序列
< > 6
aaactaataa gatttacaac aatttctc 28
<210> 7
<211〉 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"^兌明的示例序列<400> 7
accaac3cc8 ca^caacca acacacacca accac肌cac caccatgtct c 51
2权利要求
1、一种测定溶液中被分析物浓度的方法，其中该方法包括选择结合化合物；选择被分析物的类似物，并使类似物与多核苷酸底物结合，构成利用期望的多核苷酸反应测定分析溶液中被分析物的含量的试剂；以及其中分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竞争；选择期望的酶用于催化期望的多核苷酸反应；针对分析溶液中特定被分析物的浓度和预先选定的期望的酶的量，确定结合化合物与试剂的期望比率；形成包含一定量结合化合物和含量待测的被分析物的分析溶液；将一定量的试剂加到分析溶液中，其中试剂的量和结合化合物的量达到期望的结合化合物与试剂的比率；将预先选定量的期望的酶加到分析溶液中，催化期望的多核苷酸反应；以及检测期望的多核苷酸反应中期望的酶的活性来确定分析溶液中被分析物的含量。
2、 权利要求l所述的方法，其中所述结合化合物包括配体结合分子。
3、 权利要求l所述的方法，其中所述结合化合物包括抗体。
4、 权利要求l所述的方法，其中所述结合化合物包括细胞受体。
5、 权利要求l所述的方法，其中所述类似物包含被分析物的结构。
6、 权利要求1所述的方法，其中所述类似物为具有被分析物分子结 构的化合物。
7、 权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸引 物、多核苦酸模板或它们的组合。
8、 权利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物为双链DNA。
9、 权利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物为单链DNA。
10、 权利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反应包括核苷 酸聚合反应。
11、 权利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反应包括核苷 酸裂解反应。
12、 权利要求l所述的方法，其中所述期望的多核香酸反应包括核香 酸聚合反应和核香酸裂解反应的组合。
13、 权利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反应包括核苷 酸重组反应。
14、 一种用于竟争性结合分析的试剂，其中该试剂包括 与类似物结合的多核苷酸底物，其中选择的类似物(i)与分析溶液中预先选定的结合化合物相结合；并且(ii)与分析溶液中被分析物与预先 选定的结合化合物的结合相竟争；而且其中选择的多核苦酸底物参与期望的多核芬酸反应，该多核苷酸反应
15、 权利要求14所述的试剂，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸 引物、多核苦酸^^板或它们的组合。
16、 权利要求14所述的试剂，其中所述多核苷酸底物为双链DNA。
17、 权利要求14所述的试剂，其中所述多核苷酸底物为单链DNA。
18、 权利要求14所述的试剂，其中所述结合化合物包括配体结合分子。
19、 权利要求14所述的试剂，其中所述结合化合物包括抗体。
20、 权利要求14所述的试剂，其中所述结合化合物包括细胞受体。
21、 权利要求14所述的试剂，其中所述类似物包含被分析物的结构。
22、 权利要求14所述的试剂，其中所述类似物为具有被分析物分子 结构的化合物。
23、 权利要求14所述的试剂，其中所述期望的多核苷酸反应包括核 普酸聚合反应。
24、 权利要求14所述的试剂，其中所述期望的多核苷酸反应包括核 苦酸裂解反应。
25、 权利要求14所述的试剂，其中所述期望的多核苷酸反应为核苷 酸聚合反应和核苷酸裂解反应的组合。
26、 权利要求14所述的试剂，其中所述期望的多核苷酸反应包括核 香酸重组反应。
27、 一种用于测定分析溶液中被分析物含量的竟争性结合分析试剂 盒，该试剂盒包括权利要求14所述的试剂；用于竟争性结合分析的结合化合物，其中分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竟争；以及用于催化期望的多核苷酸反应的酶，其中测定酶活性来确定分析溶液 中被分析物的含量。
28、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或它们的组合。
29、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂为双链DNA。
30、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂为单链DNA。
31、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂包括具有被分析物结 构的类似物。
32、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂包括具有被分析物分 子结构的类似物。
33、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述结合化合物包括抗体。
34、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述结合化合物包括配体结合 分子。
35、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述结合化合物包括细胞受体。
36、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述期望的多核苷酸反应包括 核苷酸聚合反应。
37、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述期望的多核苷酸反应包括 核苷酸裂解反应。
38、 权利要求27所述的试剂盒，其中所述期望的多核苷酸反应包括 核苷酸聚合反应和核苷酸裂解反应的组合。
39、 根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述期望的多核苷酸反应 包括核苷酸重组反应。
全文摘要
本发明涉及利用酶活性的竞争性干扰和恢复检测被分析物。本发明的内容主要公开了一种测定溶液中被分析物浓度的方法。该方法包括选择结合化合物；选择被分析物的类似物并将类似物与多核苷酸底物结合构成试剂，利用期望的多核苷酸反应来测定分析溶液中被分析物的含量，该期望的多核苷酸反应包括聚合反应、裂解反应或重组反应。分析溶液中试剂与结合化合物的结合，与分析溶液中被分析物与结合化合物的结合相竞争。该方法还包括选择用于催化期望的多核苷酸反应的期望的酶。还提供了试剂和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101463388SQ20081018823
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月20日
发明者夏东元 申请人:博尔诚(北京)科技有限公司