专利名称：一种水稻根系木质部薄壁细胞原生质体的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种分离植物根系木质部薄壁细胞原生质体的方法，尤其涉及一种水稻根系 木质部薄壁细胞原生质体的分离方法。
背景技术：
1960年Cocking用酶法首次分离出了有活性的原生质体。1971年Takebe等从烟草叶片 分离原生质体，经培养获得再生植株，原生质体的研究和应用进入了新的阶段。原生质体是 去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的"裸露细胞"，是基因转化的理想受体。植物 原生质体培养是细胞融合的前提，可以被用来克服远缘杂交中的某些障碍，更广泛地组合植 物的各种有利的遗传性状。并且可用于细胞器移植和细胞突变体筛选，是植物生物技术研究 的重要组成部分和基础性工作，已成为植物品种改良的新途径。这一技术己经被成功地用于 植物品种改良，比如提高作物的抗病性、抗冷性和抗冻性。由于原生质体本身所具有的特点 及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受 到重视。研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植 株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面。
原生质体不仅可以作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞 器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料；而且,近年来以原生质体 为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调剂机制已经 成为人们所热切关注的问题。与此同时，原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其 调节机制的理想材料。
水稻是我国一种重要的粮食作物，其原生质体在细胞融合、转基因杂交育种等方面被广 泛研究，但有关其原生质体质膜特性，尤其是根系细胞原生质体质膜的研究却鲜有报道。植 物的细胞膜有一层主要成分是纤维素和果胶的高分子物质所包裹，给其游离带来了困难，所 以其研究远远不及动物细胞膜起步早和透彻。
发明内容
本发明提供一种水稻根系木质部薄壁细胞原生质体的分离方法。 本发明的具体技术方案如下
1、 分离酶液和基本液配制
基本液10mmol/LKCl、 2mmol/LMES、 2mmol/LCaC12、 20mmol/L蔗糖、20mmol/L 葡萄糖，调pH至5.7，山梨醇调渗透势至580mosmo1。
中柱木质部薄壁细胞原生质体分离酶液"/。纤维素酶-RS、 0.02%果胶酶、0.02%BSA，
用基本溶液配置。
2、 材料培养在润湿的滤纸两层中均匀适当间隔铺一层水稻种子，无光照条件下放置 24 h。种子萌发后，播种于装满石英砂的培养钵中，培养条件为25.5'C、湿度60%、日光照 10 h，培养一周后取出。将幼苗根系清洗干净，取根系中较粗壮的，去除尖端lcm长度及上 部长有侧根的部分，剩下的2 3cm作为材料来源。
3、 中柱分离将根断(步骤(2)中所得材料)置于0.2%。3(:12溶液中，用小镊子轻轻 敲击，致根系呈扁平状，用镊子尖端轻轻划开根系，将皮层部分从中剥落下来(中柱部分因 木质化而与皮层部分区分开来)，从而获得水稻根系中柱。获得的中柱置于0.2%CaC12溶液 中。
4、 中柱木质部薄壁细胞原生质体制备取适量中柱用剪刀剪至lmm长切段，置于小三 角瓶中，加中柱原生质体分离酶液4 ml， 3(TC低速振荡水解40 min加6 ml基本液终止水解， 细胞筛过滤，滤液100r/min离心7 min，保留下层约4ml溶液，力n 6ml胞外液相同条件离心， 保留下层约4ml溶液，倒于小平皿中，4'C静置2h。
本发明选取了水稻Oryza sativa L.幼苗根部伸长及成熟区未着生侧根的部位2~3 cm为材 料，使用不同组分的水解酶液，找出最佳的分离条件，并成功得到了完好的中柱木质部薄壁 细胞原生质体。目前，国内外尚无相关报道。
植物细胞原生质体的分离是研究质膜性质尤其是后续对离子通道研究的第一步，如何分 离出细胞膜结构和功能完整的原生质体是关键。
通过实验确定了水稻OryzasativaL.幼苗根系中柱木质部薄壁细胞原生质体的分离条件。 中柱主要由导管和筛管等输导组织构成，起到向上输送水分和盐分的作用。由于导管是死细 胞，木质化程度很高，当用机械方法分离出中柱后，在特定组分的水解酶作用下，导管可以 从中游离出来，从而释放出环绕在周围的木质部薄壁细胞。
具体实施例方式
1、 中柱原生质体分离材料培养-
取大小培养皿各一只，在小培养皿中铺以滤纸两层，润湿，均匀适当间隔铺一层水稻种 子，盖上大培养皿，无光照条件下放置24h。
种子萌发后，播种于装满石英砂的培养钵中，培养条件为25 5'C、湿度60%、日光照 10 h。 一周后取出幼苗，洗净石英砂。
2、 中柱分离
将水稻幼苗根系清洗干净，取根系中较粗壮的，去除尖端lcm长度及上部长有根毛的部 分，剩下的2 3cm作为中柱材料的来源。
将根断置于0.2%(:&(:12溶液中，用小镊子轻轻敲击，致根系呈扁平状，用镊子尖端轻轻 划开根系，将皮层部分从中剥落下来(中柱部分因木质化而与皮层部分区分开来)，从而获得 水稻根系中柱。
获得的中柱置于0.2%CaC12溶液中。
3、 酶液的配制
中柱原生质体分离酶液P/。纤维素酶-RS、 0.02%果胶酶、0.02%BSA，用基本溶液配置。 基本液10mmol/LKCl、 2mmol/LMES、 2 mmol/L CaC12、 20mmol/L蔗糖、20mmol/L 葡萄糖，调pH至5.7，山梨醇调渗透势至580mosmo1
4、 中柱细胞原生质体的制备
取适量中柱用剪刀剪至1 mm长切段，置于小三角瓶中，加1%纤维素酶-RS 4ml， 30 'C低速振荡水解40min加6ml基本液终止水解，细胞筛过滤，滤液100r/min离心7 min，保 留下层约4ml溶液，加6ml胞外液相同条件离心，保留下层约4ml溶液，倒于小平皿中，4 'C静置2h。
通过以上步骤成功得到了完好的水稻根系木质部薄壁细胞原生质体。
权利要求
1、一种水稻根系木质部薄壁细胞原生质体的分离方法，其特征在于，所述方法由以下几个步骤组成1)基本液和分离酶液配制基本液10mmol/L KCl、2mmol/L MES、2mmol/L CaCl2、20mmol/L蔗糖、20mmol/L葡萄糖，调pH至5.7，山梨醇调渗透势至580mosmol中柱木质部薄壁细胞原生质体分离酶液1％纤维素酶-RS、0.02％果胶酶、0.02％BSA，用基本溶液配置；2)材料培养在润湿的滤纸两层中均匀适当间隔铺一层水稻种子，无光照条件下放置24h；种子萌发后，播种于装满石英砂的培养钵中，培养条件为25.5℃、湿度60％、日光照10h，培养一周后取出；将幼苗根系清洗干净，取根系中较粗壮的，去除尖端1cm长度及上部长有侧根的部分，剩下的2～3cm作为材料来源；3)中柱分离将根断置于0.2％CaCl2溶液中，用小镊子轻轻敲击，致根系呈扁平状，用镊子尖端轻轻划开根系，将皮层部分从中剥落下来，从而获得水稻根系中柱；获得的中柱置于0.2％CaCl2溶液中；4)中柱木质部薄壁细胞原生质体制备取适量中柱用剪刀剪至1mm长切段，置于小三角瓶中，加中柱原生质体分离酶液4ml，30℃低速振荡水解40min加6ml基本液终止水解，细胞筛过滤，滤液100r/min离心7min，保留下层约4ml溶液，加6ml胞外液相同条件离心，保留下层约4ml溶液，倒于小平皿中，4℃静置2h。
2、 根据权利要求1所述一种水稻根系木质部薄壁细胞原生质体的分离方法在水稻细胞膜 性质和功能研究中的应用。
全文摘要
本发明提供一种水稻根系木质部薄壁细胞原生质体的分离方法。本发明选取了水稻Oryzasativa L.幼苗根部伸长及成熟区未着生侧根的部位2～3cm为材料，使用不同组分的水解酶液，找出最佳的分离条件，并成功得到了完好的中柱木质部薄壁细胞原生质体。目前，国内外尚无相关报道。
文档编号C12N5/04GK101358181SQ20081019642
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者 张, 隼 李, 赵福庚 申请人:南京大学