专利名称：一种荧光标记的x-str基因座复合扩增系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及一种通过 复合扩增IO个STR基因座来进行的荧光标记X-STR基因座复合扩增系统及其 应用。 疼豕伎不
短串联重复序列(short tandem repeats,简称STR)是由2-7个碱基对作为 核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列，其片段可采用PCR技术扩增。 STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因位点的遗传多态性，其 等位基因可用银染、荧光标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中，平均 每6-10kb就存在有一个STR基因位点，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信 息基因位点的丰富来源。
X染色体是人类性染色体，X染色体短串联重复(X-chromosomal Short Tandem Repeat, X-STR)是性染色体上一类多态性遗传标记，男性的X-STR 以单倍型形式存在只能从其母亲中得到，且只能遗传给女儿，因此同父所生的 姐妹在X-STR基因座上有1个相同的等位基因，孙女X-STR基因座有l个等位基 因与其祖母相同。X染色体这种独特的遗传方式，使得X-STR在亲权鉴定中有 特殊的应用价值。
在亲权鉴定中，有些没有父母双亲参与检测的特殊案件，如姐妹认亲、 同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲(祖母-孙女、外祖母-外孙子女)等，用常染色体、Y染色体或线粒体等遗传标记无法排除或认定，此时只有依靠X 染色体STR才能起到直接排除或认定的作用。
此外在有先天性缺陷的遗传病中，可通过检测X染色体STR来诊断有无 X染色体多倍体、X染色体重复、X-STR重复序列长短等，同时，X染色体 STR检测可应用于X连锁遗传病、X染色体单亲二倍体、X染色体失活的亲 源性鉴定等。从而为伴X染色体遗传病提供产前诊断方法。
因此，可以通过分析X染色体上的STR基因座的等位基因分型来确定姐 妹关系和用于伴X染色体遗传病的产前诊断。
X染色体STR位点广泛存在真核细胞基因组中，高度稳定且具有较高的遗 传多态性，然而与常染色体和Y染色体STR相比，迄今发现和应用的X-STR位 点数量较少，群体分布、突变率、连锁平衡、基因结构等方面的信息尚不够丰 富，在法医学、医学等领域的应用受限，远不及其他DNA遗传标记广泛。
X染色体遗传标记的研究在国内还处于初期，目前国际上商品化检测试剂 盒仅有德国Bviolencetype Argus X-8，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以 下问题
(1) 采用这类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；
(2) 这些X-STR基因位点都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群
体)资料而开发的，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，个 人识别能力较低；
(3) 国外商品化试剂盒价格昂贵。
这些缺点限制了X染色体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于中国人群的，可
以快速、方便针对常染色体STR、 Y-STR难以排除或认定亲权关系的特殊检案 (姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等)进行鉴定的荧光标记的 X-STR基因座复合扩增系统。
本发明的另一个目的在于提供上述复合扩增系统在为伴X连锁遗传病、X 染色体单亲二倍体、X染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断；以及姐妹认 亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
本发明建立了一套荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，该系统分析l 0个基因座，这10个基因座为DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS7424、 D XS6789、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS6803、 DXS101和GATA31E08。本发
明对上述10个X-STR基因座进行了研究，表明这10个基因座在中国人群中有高 度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。
一、本发明复合扩增系统中IO个基因座的选择 (1)位于同一连锁群内
作为位于同一染色体的基因座，必须考虑到连锁遗传的问题。各基因座如 位于同一个连锁群之内，呈连锁遗传，便于以单倍型观察多态性。
本发明的10个基因座分布于同一染色体上不同的位置，既有紧密连锁者， 也有遗传距离相距较远者。紧密连锁的有DXS7133-DXS7424-DXS101和DXS6 801-DXS6789。连锁的基因座能构成单倍型，在亲权鉴定中有利于分析亲代与 子代之间的遗传关系。(2) 易于扩增
除上述IO个基因座外，实验初期申请人还选择了另外一些位于X染色体 第二连锁群内的基因座，如ARA、 DXS6800、 DXS7423 、 DXS7130 、 GATA172D05、 DXS6854、 DXS9895等。但单基因座扩增结果发现，这些基因 座的扩增存在着一些问题，有的扩增的产物量少，显带过浅，甚至有时很难得 到扩增产物，如DXS7130;有的很容易出现非特异带(如影子带)，如DXS9895; 而上述10个基因座易于扩增稳定性好，结果清晰，非特异性带很少。
因此最后选择了 DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS7424、 DXS6789、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS6803、 DXS101禾Q GATA31E08，这10个易于 扩增，分型较好的基因座进行复合扩增。
(3) 扩增产物片段长度不重叠
复合扩增各基因座片段大小的差距应大于20 bp，各基因座的等位基因之 间才不会发生重叠，干扰分型。
本发明的X-STR基因座复合扩增体系根据各基因座扩增产物片段长度大 小，用同一荧光标记不同扩增产物片段长度(相差大于20 bp)的基因座，保 证复合扩增各基因座的等位基因之间不会发生重叠，不会干扰分型。用四种不 同颜色的荧光标记多个基因座的引物，保证同一反应体系能同时扩增多个基因 座，而不影响各基因座的分型。本发明的10个基因座引物分别用FAM、 HEX、 TAM、 ROX四种不同颜色的荧光素标记。
体系中10个X-STR基因座DXS7133-DXS6801-DXS981-DXS7424-DXS6 789-DXS7132-GATA165B12-DXS6803-DXS101-GATA31E08 。其荧光组合方式 为FAM荧光素标记DXS7133、 DXS6801和DXS981， HEX荧光素标记DXS7424、 DXS6789和DXS7132， TAM荧光素标记DXS165B12、 DXS6803和D XSIOI、 ROX荧光素标记GATA31E08。
这种特定的组合方式将扩增产物控制在300个碱基(bp)范围内，可以建 立X-STR的miniSTR检测方法，适用于降解检材的DNA检测。同时可为增加更 多的X-STR基因座复合扩增奠定基础。
二、本发明复合扩增基因座的扩增 -
本发明的复合扩增系统是采用复合PCR技术在同一反应管中同时扩增上 述10个X-STR基因座，从而可同时分析多个X染色体STR基因座。
复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对 引物中的引物正链的5'端用相应的荧光素标记(即用FAM、 HEX、 TAM、 R OX标记)，全部10个基因座的引物混合在一个试管内。
1、 PCR反应体系
反应总体积为25jxl :PCR反应缓冲液(Buffer) 5.0 pl，引物混合物(Primer Pair Mix) 5.0 |il， DNA聚合酶0.3nl，模板DNA 2.0|J，消毒纯净水12.7^1。
上述DNA聚合酶可选用本领域技术人员常用的DNA聚合酶，如金牌DNA 聚合酶(AmpliTaqGold )
2、 PCR扩增参数
在热循环仪PTC-100或PE9700上扩增，程序如下 95 0C llmin 94。C 45sec
59 0C 45sec 72 0C45sec J
卜30个循环60 。C 45min 3、 ABI PRISM 3100遗传分析仪电泳分型扩增产物
a. 样品准备
GeneScan -500LIZ size standard 0.25pi ，
士 x样品数
去离子甲酰胺 9.75^1
混匀后瞬时离心，每管加lO.Opd混合物，再加PCR产物l.Ojil，瞬时离心。 95。C变性4min，放置冰盒中冷却3min，取10.0^1变性后的样品转移至96孔 样品板，装载入ABI PRISM 3100遗传分析仪进行电泳。
b. 电泳条件14.7kV， 130jiA， 14.8mW。
c. 结果分析GeneMapperlDv3.1软件。
本发明的10个基因座已在申请人实验室应用于群体学调査并获得中国群 体的分型结果，证明这些基因座多态性较高，适合于中国人群的检测，并应用 于实际检案取得理想的结果。
本发明的荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统可以制成试剂盒，为姐 妹认亲和隔代认亲提供新的检测系统，为X染色体相关性遗传病进行产前诊 断。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 灵敏度本发明所研制的MX-STR荧光标记X-STR复合扩增系统在模板 量为10 20ng时可检出全部10个基因座；
2. 单倍型个体识别率用MX-STR荧光标记X-STR复合扩增系统对250个中 国无关男性个体检测，结果显示在250个个体中共发现247种单倍型，其中244 种单倍型是唯一的(占97.6%)，有三种单倍型出现2次，这10个X-STR基因座(DXS7133-DXS6801-DXS981 - DXS7424-DXS6789-DXS7132-GATA165B12-DXS6803-DXS101-GATA31E08)单倍型个体识别率达到0.99992。
3. 本发明所研制的X-STR荧光复合扩增系统己在本实验室用于实际检案， 结果表明该系统多态性高，稳定性、重复性好，分型结果准确，能满足实际检 案的需要。
4. 本发明在国内首先研制出一组10个X-STR基因座在单一反应管中的复 合扩增的五色荧光标记X-STR复合扩增检测系统，达到目前国际上荧光标记 X-STR基因座复合扩增试剂盒的最高水平。
5. 本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、方便，PCR产物可用310、 377、 ABIPRISM3100、 3130等遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、 国际化，保证不同实验室数据比较的正确性。
6. 本发明可制备一套试剂盒，可进行商品化，可以填补国内没有X-STR 基因座荧光复合扩增试剂盒的空白，也可补充国际X-STR基因座荧光复合扩 增试剂盒的不足，作为具有中国特色的X-STR基因座复合扩增试剂盒，可用 于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于产 前诊断和姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定。
7. 本发明的X-STR基因座复合扩增系统可以为伴X连锁遗传病、X染色 体单亲二倍体、X染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断方法，也为解决仅 靠常染色体STR、 Y-STR难以排除或认定亲权关系的某些特殊检案(姐妹认 亲、同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲等)的亲权鉴定提供新的鉴定方法， 具有广泛的应用前景。
具体实施例方式
实施例1应用MX-STR荧光标记复合扩增系统进行姐妹认定和奶奶与孙 女的鉴定
原理X染色体是人类性染色体，X-STR是性染色体上一类多态性遗传 标记，男性的X-STR以单倍型形式存在只能从其母亲中得到，且只能遗传给 女儿，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有1个相同的等位基因。如果 可疑姐妹样本中所有X-STR基因座中有1个相同的等位基因，则不能排除其 来自同一父亲，如果有3个以上的X-STR基因座中无相同等位基因，则可以 排除其来自同一父亲。同样孙女X-STR基因座有1个等位基因与其祖母相同， 故可疑奶奶与孙女样本中所有X-STR基因座中有1个相同的等位基因，则不 能排除她们的亲缘关系，如果有3个以上的X-STR基因座中无相同等位基因， 则可以排除她们的亲缘关系。
操作步骤
1. DNA提取
Chelex-100法剪取4X4mm的血纱，力n 300]iil 10% Chelex-100， 56。C烤 箱过夜，置于PCR仪中100。C 10min，振荡30sec， 10000r/min离心2min， 4 'C保存备用。
2. PCR扩增
PCR扩增反应总体系为25jil: PCR反应缓冲液(Buffer) 5.0 ^，引物混合 物(Primer Pair Mix) 5.0 jil，金牌DNA聚合酶(Ampli Taq Gold ) 0.3|il， 模板DNA 2.0^1，消毒纯净水12.7 ]ol。
上述PCR缓冲液的配方为dNTP 200jJinol/L， MgCl2 1.5mmol/L。上述引物混合物中，各个基因座的引物序列及其荧光标记如表l所示。 表l基因座及其引物序列和荧光标记
基因座引物序列荧光标记
DXS7133F:5，-AGCTTCCTTAGATGGCATTCA-3' R: 5，-CTTCCAGAATCAGAAGTCTCC-3，FAM
DXS6801F:5，-CATTTCCTCTAACAAGTCTCC-3， R: 5'陽CAGAGAGTCAGAATCAGTAG-3，FAM
DXS981F:5，-TCAGAGGAAAAGAAGTAGACATACT-3， R: 5，-rrCTCTCCACmTCAGAGTCA-3'FAM
DXS7424F:5'-CTG CTT GAGTCC AGG AAT TCA A-3'HEX
DXS6789R: 5，-GAACAC GCACAT TTG AGA ACA TA-3' F^'-GTTGGTACTTAATAAACCCTCTm R: 5'陽AAGAAGTTATTTGATGTCCTATTGT陽3，HEX
DXS7132F:5，-AGCCCATTTTCATAATAAATCC墨3， R: 5'-AATCAGTGCTTTCTGTACTATTGG-3'HEX
GATA165B12F:5' TATGTATCATCAATCATCTATCCG-3， R: 5，-TTAAAATCATTTTCACTGTGTATGC-3，TAM
DXS6803F:5，-GAAATGTGCTTTGACAGGAA-3，TAM
DXS101R: 5，-CAAAAAGGGACATATGCTACTT-3， F:5，-ACTCTAAATCAGTCCAAATATCT-3， R: 5，-AAATCACTCCATGGCACATGTAT-3'TAM
GATA31E08F:5'-AGGGGAGAAGGCTAGAATGA-3' R: 5'-CAGCTGACAGAGCACAGAGA-3'ROX
3. PCR扩增参数95。C预变性llmin， 94。C变性45sec， 59。C复性45sec， 72 。C延伸45sec， 30个循环，再6(TC延伸45 min。
4. ABI PRISM 3100遗传分析仪电泳1) 开机:开启稳压电源一打开电脑(进入Win2000系统)一开启3100主 机电源(仪器进入自检状态)一启动3100 DATA Collection数据采集软件。
2) 装置准备定期清洗和安装
把注射器、毛细管、Buffer糟等拆下，用纯水清洗，晾干，灌胶注射器 里注入相当体积的POP-4胶，排出空气。Buffer糟里盛IXBuffer溶液。双击 Run 3100 Data CollectionVersion2.0软件一点击菜单栏中的Wizards—点击Fill Capillary wizards,对毛细管注胶一毛细管定位和样品编辑。
3) 样品准备
GeneScan -500LIZ size standard 0.25ul 「
混匀后瞬时离心，每管加10.0pl混合物，再加PCR产物l.Opl，瞬时离心。 95°C变性4min，放置冰盒中冷却3 min，取10.0^1变性后的样品转移至96孔 样品板，装载入3100遗传分析仪进行电泳。
4) 电泳条件14.7kV， 130jiA， 14.8mW。
5) 结果分析用GeneMapperlDv3.1软件进行基因分型。
去离子甲酰胺
9.75pl
权利要求
1、一种荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于该复合扩增系统分析10个基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS7132、GATA165B12、DXS6803、DXS101和GATA31E08。
2、 根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征 在于所述10个基因座是在一个复合扩增体系中同时扩增。
3、 根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在 于所述10个基因座引物分别用FAM、 HEX、 TAM、 ROX四种荧光素标记。
4、 根据权利要求3所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征 在于体系中FAM标记DXS7133、 DXS6801和DXS981 ， HEX标记DXS7424、 DXS6789和DXS7132， TAM标记DXS165B12、 DXS6803和DXSIOI〉 ROX 标记GATA31E08。
5 、权利要求1至4所述的荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统在认定特 殊的亲权关系检案或对X染色体相关性遗传病进行产前诊断中应用。
全文摘要
本发明公开一种荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统及其应用，该系统复合扩增分析10个基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS7132、GATA165B12、DXS6803、DXS101、GATA31E08，这10个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM、ROX四种荧光标记。本发明可制备一套试剂盒，作为具有中国特色的X-STR基因座复合扩增试剂盒，可用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于产前诊断和姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101413030SQ20081021941
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者刘秋玲, 吕德坚, 虎 赵 申请人:中山大学