专利名称：广东虫草菌丝体的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种虫草菌丝体的生产方法，具体来说涉及一种广东虫草(Cw办ce/w gwa"gctowgeww^ T.H. Li, Q.Y. Lin & B. Song)菌丝体的生产方法。
背景技术：
虫草属(Cor办ce;w)在分类上隶属于真菌界Fungi，子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目 (Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，是目前最值得研究的真菌类群之一。中医认为，药 食同源，因此，不少虫草种类具有极高的食药用价值，尤以冬虫夏草(Co^^戸w'"e"^Sacc.) 最为著名。现代科学研究表明，蛹虫草(又称北虫草)(C.脂7/toni(L. :Fr.)Link.)、古尼虫草 (C.g""m'Z(Berk.)Berk.)等都具有与冬虫夏草相类似的作用，部分种类的活性成份甚至比冬 虫夏草还要高。
虫草中的有效成分例如虫草素、虫草酸、腺苷等均具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、滋阴壮 阳、保肝益肺和提高免疫力等功效，另外虫草子实体中还含有多种对人体有益的营养成分。 随着人们生活水平的提高和对健康食品需求的增加，冬虫夏草日益受到人们的喜爱，但至今 为止，冬虫夏草还未能规模化地人工栽培，而不断增加的需求和高昂的价格导致人们对野生 冬虫夏草的过度采集，使其野生资源日益稀缺。因此，开展高活性虫草种类的人工生产研究， 不但可以有效地缓解紧张的供需关系，而且对提高我国人民的健康和生活水平有着重要的意 义。
广东虫草(CoW戸/w gMa"g^owge腦S T.H. Ii, Q.Y. Lin & B. Song，艮卩Co喊ceps7，w'ca f. gwfl"gJowgew^ T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song， GDIM—C050423 )是在广东地区发现的一个虫草 新种(见文献Lin Q Y， Li T H, Song B. Mycotaxon， 2008， 103: 371 - 376.)。经分析， 这种虫草具有高活性成分，其子实体的腺苷含量达O. 81mg/g，虫草酸含量达392 mg/g，明显 高于冬虫夏草的含量(腺苷0.27mg/g，虫草酸130mg/g)，而且气味芳香，味道甘甜无毒。因 此广东虫草具有一定的市场潜力，作为冬虫夏草的替代品进行产业化研究不仅是可行的，而 且具有较大的经济价值和一定的科学意义。
发明内容
本发明的目的在于开发出广东虫草菌丝体的生产方法。
我们通过将广东虫草(即日本虫草广东变型Cw办ce;w /fl/wm.ca f.gwa"gcfo"ge"wyr.H. Li， Q.Y. Lin et B. Song, GDIM_C050423 CCTCC No. M206051)母种在PDA培养基=〉液体培养基 培养=〉发酵生产液体培养基或大米培养基中培养，得到了广东虫草菌丝体，从而实现了本发明的目的。
本发明的广东虫草菌丝体的生产方法，其特征包括以下的步骤-
(1) 将曰本虫草广东变型(CW戸/w勿om'ca f.gwa"gifowg冊zVLH. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051接种到PDA培养基上，18 26°C下进行暗培养， 使菌落直径长至4 6cm，得到斜面菌种；
(2) 将步骤(l)得到斜面菌种接种至一级液体培养基，每100mL接入5 15块斜面菌种， 20 28°C下振荡培养，至菌丝球充满全部培养基，得到一级液体菌种，所述的一级液体培养 基pH6.0 6.5，每1000mL培养基中含有葡萄糖10 15g，蛋白胨3 10g，麦芽提取粉3 6g， 酵母浸膏3 6g，其余为水；
(3) 将步骤(2)得到的一级液体菌种再次接种到二级液体培养基进行培养，直至菌丝球充 满全部培养基，得到二级液体菌种，所述的二级液体培养基配方同步骤(2)所述一级液体培养 基；
(4) 将步骤(3)得到的二级液体菌种接种到生产用的液体培养基发酵培养或将二级液体 菌种用无菌水稀释后接种到大米培养基中避光培养，至菌丝球或菌丝充满全部液体培养基或 大米培养基，过滤或离心收集充满菌丝的菌球干燥或粉碎，或收集充满菌丝的大米培养基直 接烘干，即都可得到广东虫草菌丝体，所述的生产用的液体培养基pH4 9，每1000mL培养 基中含有麦芽提取粉10 30g，葡萄糖10 20g，黄豆5 15g，酵母浸膏l 4g，其余为水， 所述的大米培养基由大米和营养液按质量比1:1 1.5配制而成，所述营养液按总质量分数 100%计，配方为葡萄糖1.0% 1.5%，蛋白胨0.3% 1.0%，麦芽提取粉0. 3% 0. 6%，酵母 浸膏O. 3% 0. 6%，其余为水，pH5. 0 7. 0。
步骤(l)中所述的日本虫草广东变型(Cw办ce;w/qpom'ai f. gwtmgi/o"gera^ T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423于2008年发表的文献中更名为广东虫草(6b/"办ce;w 卵朋goto/^e/ sj^T.H. Li, Q.Y. Lin & B. Song)(见文献Lin Q Y， Li T H， Song B. Mycotaxon， 2008， 103: 371 - 376.)。该虫草菌株分离自广东虫草标本(GDGM 24020)，已于2006年5月 16日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，保藏号为CCTCC No. M206051。 该虫草菌株首先公开在中国专利ZL200610035774. 3中。
步骤(l)中所述的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，是本领域通常使用的培养基， 所述的暗培养时间最好是20 30天。
步骤(2)所述的振荡的摇床转速最好是120 180r/min，培养时间最好是7 8天。
步骤(3)所述的一级液体菌种在培养基中的体积分数最好是3% 15%，所述的培养时间最 好是4 7天。
步骤(4)所述的二级液体菌种在生产用的液体培养基或大米培养基中的体积分数最好是3% 15%，所述的发酵培养的搅拌速度最好是150 180r/min，通气量最好是8 25L/rain，培 养时间最好是2 5天，所述的避光培养时间最好是9 20天。 上述所用的麦芽提取粉和酵母浸膏都是市售品。
本发明采用液体菌种接种培养广东虫草的方法，使广东虫草菌丝体湿重的产率达到70 100g/L，干重产率达到8 15g/L，或直接接种于大米培养基中培养获得广东虫草菌丝体。成 分分析结果表明，本发明的菌丝体的营养成分中包括粗蛋白23% 24. 12%,粗脂肪12% 13. 52%，其活性成分包括多糖7 8mg/g，腺苷1. 05 1. 76mg/g，虫草素3. 1 3. 31mg/g,甘 露醇(虫草酸)43 45.18mg/g，因此可作为食品或虫草产品生产原料使用。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例中所用的麦芽提取 粉和酵母浸膏都是广东环凯微生物科技有限公司的市售品
实施例l:
将日本虫草广东变型(6broyc印51 j'apo/ 2'ca f.卵a^/0"ge/757'5T. H. Li, Q. Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母种，接种量大小约为0. 5cm2，接种在PDA培养基 (即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其配制方法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL 煮沸半个小时，纱布过滤，再加10 20g葡萄糖和17 20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤， 分装试管，视试管大小而定每试管约5 10mL， 15磅蒸气12rC灭菌20分钟左右后取出试管 摆斜面，冷却贮存备用)上，2(TC下暗培养20天，使菌落直径长至4 5cm，得到斜面菌种。
把斜面菌种接种至带有250mL —级液体培养基YMPD (每1000 mL培养基中含葡萄糖10g， 蛋白胨5g，麦芽提取粉3g,酵母浸膏3g，其余为水，p朋.O)的三角瓶中，接入15块菌种 块，20°C下振荡培养，摇床转速为120r/min，培养8天，菌丝球充满全部培养基，菌丝球平 均直径约2 3mm，且大小均匀，得到一级液体菌种。
将25mL —级液体菌种接种至250mL —级液体培养基中(培养基的组分同上一步所述)， 培养4天，至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种。
将25mL 二级液体菌种接种至装有250mL生产用的液体培养基(每1000mL培养基中含麦 芽提取粉20g，葡萄糖10g，黄豆10g，酵母浸膏2g，其余为水，pH6)的500mL的三角瓶中 发酵培养5天，振荡速度为150r/min，至菌丝球充满全部培养基，离心法收集菌丝球，在40°C 下烘干菌丝体并粉碎至40目过筛，得到广东虫草菌丝体3. 5g，产率14g/L。
实施例2:
将日本虫草广东变型(Coroyce/ 51麵om'cfl f. T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song)
GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母种(约为O. 5cm2大小)接种在PDA培养基上，25°C下 暗培养30天，使菌落直径长至5 6cm，得到斜面菌种。把斜面菌种接种至带有250mL —级液体培养基YMPD (每1000 mL培养基中含葡萄糖15g， 蛋白胨3g，麦芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其余为水，p朋.5)的三角瓶中，28。C下振荡培养, 摇床转速为180 r/min，培养7天，菌丝球充满全部培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且 大小均匀，得到一级液体菌种。
将一级液体菌种7. 5fflL接种至250mL 二级液体培养基中(培养基的组分同上一步所述)， 培养7天，至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种。
将二级液体菌种接种至带有25L生产用的液体培养基的40L小型发酵罐(每1000mL培养 基含麦芽提取粉10g，葡萄糖20g，黄豆5g，酵母浸膏lg，其余为水，pH4)中发酵培养，搅 拌速度为180 r/min，通气量为10L/min，培养2天，至菌丝球充满全部培养基，过滤法收集 菌丝球，在50。C下烘干菌丝体，得到广东虫草菌丝体250g，产率10g/L。
实施例3:
将曰本虫草广东变型(C。r办ceps/a/ o"z'ca f.gwa"gi/o"ge腦VLH. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM_C050423 CCTCC No. M206051母种(大小约为0.4 0.5cm2)接种在PDA培养基上，23°C 下暗培养25天，使菌落直径长至4 5cm，得到斜面菌种。
把斜面菌种接种至带有250mL —级液体培养基YMPD (每1000 mL培养基中含葡萄糖10g， 蛋白胨5g，麦芽提取粉6g，酵母浸膏3g，其余为水，p服.O)的三角瓶中，25。C下振荡培养， 摇床转速为150 r/min，培养7天，菌丝球充满全部培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且 大小均匀，得到一级液体菌种。
将一级液体菌种37. 5mL接种至250mL 二级液体培养基中(培养基的组分同上一步所述)， 培养5天，至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种。
将二级液体菌种接种至带有65L生产用的液体培养基的100L小型发酵罐(每1000 mL培 养基中含麦芽提取粉30g，葡萄糖20g，黄豆15g，酵母浸膏4g,其余为水，pH9)，搅拌速度 为180r/min，通气量为25L/min，培养3天，至菌丝球充满全部培养基，采用过滤法收集菌 丝球，粉碎菌丝体至40目过筛，得到广东虫草菌丝体550g，产率8.5g/L。
实施例4:
将曰本虫草广东变型(Coroycep51 /qpo"/ca f.g"a"gcto"ge"57yr.H. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母种(大小约为0.4 0.5cm2的菌块)接种在PDA培养基 上，22T下暗培养28天，使菌落直径长至4 5cm，得到斜面菌种。
把斜面菌种接种至带有带有250mL —级液体培养基YMPD (每1000 mL培养基中含葡萄糖 10g，蛋白胨10g，麦芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其余为水，pH6.5)的三角瓶中，26。C下振 荡培养，摇床转速为120r/min，培养7天，菌丝球充满全部培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且大小均匀，得到一级液体菌种。将一级液体菌种30mL接种至250mL 二级液体培养基中(培养基的组分同上一步所述)， 培养6天，至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种。
将7. 5mL 二级液体菌种用无菌水稀释后接入20g大米培养基中(培养基由大米和营养液 按质量比l:l配制而成，营养液按总质量分数100%计，配方为葡萄糖1%，蛋白胨0.3%， 麦芽提取粉0. 3%，酵母浸膏0. 3°/。和水98. 1%， p服.0)，避光培养20天，待菌丝体充满全部 培养基，4(TC下烘干，得到广东虫草菌丝体。
实施例5:
将曰本虫草广东变型(CoroycejD51 /fl; o"i'az f.gwarrtg(iowge肌'5T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song) GDIM_C050423 CCTCC No. M206051母种(大小约为0.4 0.5cm2的菌块)接种在PDA培养基 上，20。C下暗培养20天，使菌落直径长至4 5cm，得到斜面菌种。
把斜面菌种接种至带有250mL —级液体培养基YMPD (每1000 mL培养基中含葡萄糖10g, 蛋白胨5g，麦芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其余为水，p朋.O)的500mL三角瓶中，20°C下振 荡培养，摇床转速为120r/min,培养8天，菌丝球充满全部培养基，菌丝球平均直径约2 3mra，且大小均匀，得到一级液体菌种。
将一级液体菌种25mL接种至250mL 二级液体培养基中(培养基的组分同上一步所述)， 培养4天，至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种。
将7. 5mL 二级液体菌种用无菌水稀释后接入20g大米培养基中(培养基由大米和营养液 按质量比1:1.5配制而成，营养液按总质量分数100%计，配方为葡萄糖1. 5%，蛋白胨1. 0%， 麦芽提取粉0.6%，酵母浸膏0. 6%和水96. 3%， pH6.5)，避光培养9天，4(TC下烘干，得到广 东虫草菌丝体。
权利要求
1. 一种广东虫草菌丝体的生产方法，其特征包括以下的步骤(1)将日本虫草广东变型(Cordyceps japonica f.guangdongensisT.H.Li，Q.Y.Lin et B.Song)GDIM_C050423 CCTCC No.M206051接种到PDA培养基上，18～26℃下进行暗培养，使菌落直径长至4～6cm，得到斜面菌种；(2)将步骤(1)得到斜面菌种接种至一级液体培养基，每100mL接入5～15块斜面菌种，20～28℃下振荡培养，至菌丝球充满全部培养基，得到一级液体菌种，所述的一级液体培养基pH6.0～6.5，每1000mL培养基中含有葡萄糖10～15g，蛋白胨3～10g，麦芽提取粉3～6g，酵母浸膏3～6g，其余为水；(3)将步骤(2)得到的一级液体菌种再次接种到二级液体培养基进行培养，直至菌丝球充满全部培养基，得到二级液体菌种，所述的二级液体培养基配方同步骤(2)所述一级液体培养基；(4)将步骤(3)得到的二级液体菌种接种到生产用的液体培养基发酵培养或将二级液体菌种用无菌水稀释后接种到大米培养基中避光培养，至菌丝球或菌丝充满全部液体培养基或大米培养基，过滤或离心收集充满菌丝的菌球干燥或粉碎，或收集充满菌丝的大米培养基直接烘干，即得到广东虫草菌丝体，所述的生产用的液体培养基pH4～9，每1000mL培养基中含有麦芽提取粉10～30g，葡萄糖10～20g，黄豆5～15g，酵母浸膏1～4g，其余为水，所述的大米培养基由大米和营养液按质量比1:1～1.5配制而成，所述营养液按总质量分数100％计，配方为葡萄糖1.0％～1.5％，蛋白胨0.3％～1.0％，麦芽提取粉0.3％～0.6％，酵母浸膏0.3％～0.6％，其余为水，pH5.0～7.0。
2. 根据权利要求1所述的一种广东虫草菌丝体的生产方法，其特征是步骤(l)所述的暗 培养时间是20 30天，步骤(2)所述的振荡的摇床转速是120 180 r/min ，培养时间是7 8天，步骤(3)所述的一级液体菌种在培养基中的体积分数是3% 15%，所述的培养时间是4 7天，步骤(4)所述的二级液体菌种在生产液体培养基或无菌培养基中的体积分数是3% 15%, 所述的发酵培养的搅拌速度是150 180 r/min ，通气量是8 25L/min,所述的生产液体培 养基的培养时间是2 5天，所述的大米培养基的避光培养时间是9 20天。
全文摘要
本发明涉及一种广东虫草菌丝体的生产方法，特征是将广东虫草(Cordyceps guangdongensisT.H.Li，Q.Y.Lin et B.Song)即日本虫草广东变型GDIM_C050423 CCTCC No.M206051母种接种在PDA培养基上培养得到斜面菌种，然后接种至一级液体培养基培养得到一级液体菌种，再接种到二级液体培养基培养，最后将得到的二级液体菌种接种到生产用的液体培养基中发酵培养或用无菌水稀释后接种到大米培养基中避光培养至菌丝充满培养基，收集培养物干燥或粉碎得到广东虫草菌丝体。本发明菌丝体的营养成分中含粗蛋白23％～24.12％，粗脂肪12％～13.52％，活性成分中含多糖7～8mg/g，腺苷1.05～1.76mg/g，虫草素3.1～3.31mg/g，甘露醇43～45.18mg/g。
文档编号C12N1/14GK101463326SQ20081022062
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者斌 宋, 挺 李, 李泰辉, 林群英, 沈亚恒, 浩 黄 申请人:广东省微生物研究所