专利名称：：木霉sc9及利用木霉sc9制备耐冷木聚糖酶的方法
技术领域：
：本发明涉及一种木霉及利用这种木霉制备耐冷木聚糖酶的方法。
背景技术：
：木聚糖酶(EC.3.2丄8)能够以内切方式作用于木聚糖主链的^4，4-木糖苷键产生不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶，可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。近几十年来，木聚糖酶的应用潜力一直为众多的研究者所关注。国内外对木聚糖酶的研究已比较深入，从菌种筛选、诱导产酶、酶的分离纯化、酶学特性以及木聚糖酶基因的克隆与表达等方面都有大量报道。这些报道中，关于中温和高温微生物产木聚糖酶的比较多，但是关于低温微生物产木聚糖酶的研究还很少。在低温条件下具有生长适应能力的微生物都可以称为低温微生物，广泛分布于寒冷环境中，包括高山地区、深海海区、南北两极、冰川、淡水湖泊以及冷冻食物。Morita把低温微生物化分为两类嗜冷菌(Psychrophiles)和耐冷菌(Psychrotrophs)。能在低温条件下生长，在05。C可生长繁殖，但最适生长温度>20r的微生物，称为耐冷菌。低温微生物的研究在近年得到较大发展，其所产生的低温酶(Cold-adaptedenzymes)备受关注。低温酶的i^值较低，对底物的亲合力较强，提高了对底物的利用效率。这类酶催化反应最适温度较低，可以节约能源，适合低温长时的工艺过程，另外低温下的酶反应也可提高一些产品的质量。低温环境下的纤维质材料特别是半纤维的生物降解，主要是由微生物产生的耐冷木聚糖酶引起。现有已报道的可用于制备耐冷木聚糖酶的主要微生物有青霉、产黄细菌和酵母菌。Inglis等(InglisGD，PoppAP,SelengerLB.Productionofcellulasesandxylanasesbylow-temperaturebasidiomycetes.JMZcra^V/,2000,46(9):860~865)和Petrescu等(PetrescuI,LamotteBJ，ChessaJP.XylanasefromthepsychrophilicyeastQyj!7tococciw<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>曾分别报道了酵母和担子菌的低温木聚糖酶，在5'C仍具有显著酶活。刘世利等(刘世利，汪天虹，秦楠.Isolationandmutagenesisofcold-adaptivexylanase-producing户<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(菌物系统)，2003，22(2):272276)报道从深海污泥样品中分离到产低温木聚糖酶的青霉，其最适生长温度为18°C。Hou等(HouYH,WangTH,LongH.Novelcold-adaptivePem'c/〃z'調strainFS010secretingthermo-labilexylanaseisolatedfromYellowSea.Jcto说<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>从黄海中筛选出了产木聚糖酶的低温真菌，该菌属于产黄青霉(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>入利用这些微生物制备耐冷木聚糖酶的缺点是产率较低或者是所得到的耐冷木聚糖酶的酸碱适应性较差，所得到的耐冷木聚糖酶在20。C以下，特别是0-10。C时的酶活非常低。另外，目前报道的还有一些产耐冷木聚糖酶的微生物为基因改造后的微生物(LeeCC,RenaE,GeorgeHR，etal.Cloningandcharacterizationofacold-activexylanaseenzymefromanenvironmentalDNAlibrary.Ext腿叩hiles，2006,10:295300)，这可能会导致这些菌株不稳定。
发明内容本发明的目的是提供一种能够制备耐冷木聚糖酶的木霉，以及利用这种木霉比较高效地制备性能较好的耐冷木聚糖酶的方法，所述性能包括较低温度下的酶活和稳定性、酸碱适应性。本发明提供的木霉是木霉SC9，是从海拔2000m以上的四川九寨沟采到的土样中筛选得到新的木霉菌株。于2008年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.2680，分类命名为木霉OHc/zo血wwsp.义该保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101。本发明提供的利用所述木霉SC9制备耐冷木聚糖酶的方法为以木聚糖为碳源，将所述木霉SC9在10-30'C发酵制得发酵液，过滤所述发酵液得到粗酶液，纯化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。所述发酵的发酵时间较佳为3-10天。较佳地，所述发酵为液体发酵，所述液体发酵是将所述木霉SC9接种到液体发酵培养基上进行发酵，所述液体发酵培养基的初始pH值为5-8，含有以下组分木聚糖10-40g/L，酵母提取物(含氮量为10.0-12.5%，Oxoid公司产品)5-20g/L，胰蛋白胨5-20g/L，CaCl20.1-1g/L，MgS047H200.1-1g/L，FeS040.1-1g/L，(NH4)2S040.1-1g/L。较佳地，所述木聚糖为选自桦木木聚糖、燕麦木聚糖和玉米芯木聚糖的一种或多种。较佳地，所述液体发酵培养基的初始pH值为6.5-7.5，含有以下组分玉米芯木聚糖20-30g/L，酵母提取物8-12g/L，胰蛋白胨8-12g/L，CaCl20.2-0.5g/L，MgS04'7H200.2-0.5g/L，FeS040.2-0.5g/L，(NH4)2S040.2-0.5g/L。较佳地，纯化所述粗酶液包括下述步骤1)向液体发酵得到的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到30-40%饱和度，冰水浴中搅拌30-60分钟，然后冷冻离心，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到50-60%饱和度，冰水浴中搅拌30-60分钟，冷冻离心，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐冷木聚糖酶；2)将初步纯化的耐冷木聚糖酶酶液，过DEAE52弱阴离子柱层析，平衡液选用pH5.5-6.5，20-30mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，收集未吸附蛋白；3)将歩骤2)得到的未吸附蛋白(即木聚糖酶液)过SephadexG50凝胶过滤柱层析，用pH5.5-6.5，20-60mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液洗脱并收集，在280nm处测定各管的吸光值，并测定峰值附近样品的木聚糖酶活力，酶活力较高的收集液经SDS-PAGE检验纯度，蛋白单一的即为纯酶液。收集目标蛋白峰即为纯化的耐冷木聚糖酶。本发明提供的利用木霉SC9制备耐冷木聚糖酶的方法产率较高，制得的耐冷木聚糖酶具有很强的底物特异性，仅作用于木聚糖，对其它非木聚糖多糖均没有活性，在较冷的温度下具有较高的酶活性，稳定性和酸碱适应性都比较好。图1为该实施例得到的耐冷木聚糖酶纯酶SDS-PAGE图；图2为不同反应温度下的相对酶活的测定结果曲线；图3为酶液的温度稳定性曲线；图4表示了不同pH值及体系的缓冲液(分别为柠檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相对酶活曲线;图5表示了不同pH值及体系的缓冲液(分别为柠檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的pH稳定性测定结果；图6为木聚糖酶纯酶水解桦木木聚糖和榉木木聚糖所得产物的薄层层析图7为木聚糖酶纯酶水解木寡糖所得产物的薄层层析图。具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、耐冷木聚糖酶的制备1)粗酶液的制备液体发酵培养基玉米芯木聚糖25g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，CaCl20.3g/L，MgS04.7H200.3g/L，FeS040.3g/L，(NH4)2S040.3g/L，初始pH值为7的培养基。液体发酵低温木霉菌SC9种子从保存的PDA斜面上划线于新配制的PDA平板上，然后将平板放置于10-20。C培养箱中静置培养2-8天。从生长良好的平板上刮下1cr^大小的低温真菌菌丝体，接种在装有50ml液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，20。C、160rpm振荡培养，培养5天后将发酵液在10,000xg冷冻离心10分钟，上清液即为含有木聚糖酶的粗酶液。木聚糖酶活力的测定方法采用DNS(3，5,二硝基水杨酸)法，参照文献(Bailey,MJ,Biely，P，Poutanen,K.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J肠fec/wo/，1992,23:257-270)中所述的方法。具体步骤如下取0.1ml适当稀释的上述方法制备的酶溶液，加入到0.9ml用0.05mol/L，pH5.5的柠檬酸缓冲液配制的1%桦木木聚糖底物溶液中，于3(TC下反应10分钟，用DNS法测定释放的还原糖量(Miller,GL.Useofdinitro-salicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.J"a/C/^m,1959,31:426-428)，同时以木糖作标准。木聚糖酶活力单位(U)定义为在上述条件下，每分钟水解木聚糖生成lpmol木糖所需要的酶量。结果表明，液体发酵产木聚糖酶的产量在第4天时开始显著增加，到第6天时达到最高，为36.7U/ml，第7天酶活力开始缓慢下降。2)耐冷木聚糖酶的纯化①硫酸铵沉淀向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，使酶液中硫酸铵达到35%饱和度，冰水浴中搅拌60分钟，然后12,000xg离心10分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到55%饱和度，冰水浴搅拌60分钟，10,000xg离心10分钟取沉淀，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐冷木聚糖酶酶液；②弱阴离子柱层析经硫酸铵沉淀纯化后的酶液，经弱阴离子柱层析进一步纯化。选用Whatman公司的DEAE52为离子柱填料，层析柱长10cm，直径1.0cm。平衡缓冲液为pH6.025mM柠檬酸-柠檬酸三钠，流速lml/min。木聚糖酶液上样后，收集未吸附的蛋白，每lmin收集一管(lml)。测定各管在280nm处的吸光值和木聚糖酶活力，酶活力较高的收集液进行超滤浓縮至lml左右，4。C冷藏备用。③凝胶过滤层析上述所得酶液经离子交换层析纯化，采用Pharmacia公司的SephadexG50为凝胶柱填料，层析柱长60cm，直《5l.0cm。平衡缓冲液及洗脱缓冲液pH6.050mM柠檬酸-柠檬酸三钠，流速0.083ml/min，12min收集lml，通过测定木聚糖酶活力来确定目标蛋白峰，最后通过电泳(SDS-PAGE)检验其纯度，见图l。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文献(LaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.淑脏，1970，277:680-685)中所述进行。分离胶12.5%，浓縮胶4.5%，考马斯亮蓝染色显示蛋白带，低分子量标准蛋白与样品在同一条件下电泳。蛋白含量的测定方法采用Lowry法，如文献(Lowryetal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent,/owrwa/o/CTzem/W^y,1951，193:265-275)中所述，以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。按照如上方法检测粗酶液、硫酸铵沉淀得到的目标蛋白、经DEAE52离子交换层析和SephadexG50凝胶过滤得到的酶蛋白的量、酶比活，计算回收率和纯化倍数。其中，回收率=各步骤总酶活/粗酶总酶活，纯化倍数=各歩骤比活/粗酶比活。经过上述三步纯化得到了电泳级木聚糖酶，纯化过程中，按照步骤l)所述木聚糖酶活力的测定方法，比酶活达到349.2U/mg，与粗酶液相比纯化了35.9倍，回收率为8.1%，具体结果如下表l。_表1液体发酵产木聚糖酶纯化表_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>图1为该实施例得到的耐冷木聚糖酶纯酶SDS-PAGE图，其中，M:低分子量蛋白标准品；列l:纯酶。实施例2耐冷木聚糖酶的性质耐冷木聚糖酶的最适温度及不同温度下的稳定性测定分别在不同温度(0-80°C)下测定实施例l得到的耐冷木聚糖酶的活力，以酶活力最高点时的温度作为耐冷木聚糖酶的最适温度，以此酶活力作为100%。测定耐冷木聚糖酶的不同温度下的稳定性将酶液分别在不同温度下处理30min，冰水浴冷却，然后测定残余酶活力，以未经处理的酶液做为对照(100%)来测定耐冷木聚糖酶的温度稳定性。木聚糖酶活力的测定按照步骤l中所述方法进行。图2为不同反应温度下的相对酶活的测定结果曲线，该测定结果表明耐冷木聚糖酶的最适反应温度为40-45。C，当温度达到和高于50。C时酶活力迅速下降，50°(:时酶活力降为最高值的56%。该酶在4'C时的酶活力仍为最高值的10%左右，在20"时的酶活力为最高值的22%左右，说明该酶具有耐冷性。图3为酶液的温度稳定性曲线，可以看出，酶液在低于3(TC时很稳定，处理30min后酶活力损失较少，25。C时处理30min后酶活力仍保存90。/o左右，45r处理后酶活力急剧下降，损失了50%左右，说明该酶对温度比较敏感，温度稍高时酶活即损失较大，更说明了该酶在低温下有较好的稳定性。耐冷木聚糖酶的最适pH值及pH稳定性测定将缓冲液分别换为不同pH值及体系的缓冲液(分别为柠檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)加入到底物中30"C条件下测定该酶最适pH，以酶活力最高点作为100%。将不同缓冲体系下的酶液在3(TC条件下处理30min，冰水浴冷却，测定残余酶活力，以未经处理的酶液作为对照(100%)测定木聚糖酶的pH稳定性。图4表示了不同pH值及体系的缓冲液(分别为柠檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相对酶活曲线，结果表明该耐冷木聚糖酶的最适pH值为pH6.0，当pH处于5-7.2之间时，该酶比较稳定，酶活力能保留80%左右，当反应体系的pH偏酸或偏碱时，酶活力受到抑制，酶活力下降较快。该耐冷木聚糖酶的pH稳定性测定结果显示在图5中，当pH在3.5-9.0之间时，该酶比较稳定，酶活力可以保留卯％以上，表明该酶具有广泛的pH稳定性。实施例3、耐冷木聚糖酶的水解特性耐冷木聚糖酶的底物特异性通过在40t:条件下用不同来源的浓度为1%的天然底物进行分析。结果表明实施例2液体发酵并纯化后的耐冷木聚糖酶具有很强的底物特异性，仅作用于木聚糖，对其它非木聚糖多糖均没有活性。下表2显示了该耐冷木聚糖酶对桦木木聚糖、燕麦木聚糖和榉木木聚的底物特异性。表2耐冷木聚糖酶的底物特异性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>耐冷木聚糖酶分别对桦木木聚糖、燕麦木聚糖和榉木木聚糖在30°C下进行水解，同时以木二糖，三糖，四糖和五糖为底物进行水解。在O,0.25，0.5，1，2，4，6，12，和24h取样进行TLC(薄层层析)分析。图6为木聚糖酶纯酶水解桦木木聚糖和榉木木聚糖所得产物的薄层层析图；图7木聚糖酶纯酶水解木寡糖所得产物的薄层层析图，从左到右分别为木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。图6和图7中左右两侧的Xn列从上到下依此为木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。当该耐冷木聚糖酶分别以木寡糖(木二糖、木三糖、木四糖和木五糖)为底物进行水解时，水解产物主要为木二糖其次为木三糖，最终水解产物出现少量木糖。该酶不能水解木二糖，可以将木三糖，木四糖和木五糖逐渐水解为木二糖。权利要求1、木霉SC9，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2680。全文摘要本发明的目的是提供一种能够制备耐冷木聚糖酶的木霉，以及利用这种木霉比较高效地制备性能较好的耐冷木聚糖酶的方法。本发明提供的木霉是木霉SC9，保藏号为CGMCCNo.2680。本发明提供的利用所述木霉SC9制备耐冷木聚糖酶的方法为以木聚糖为碳源，将所述木霉SC9在10-30℃发酵制得发酵液，过滤所述发酵液得到粗酶液，纯化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。本发明提供的利用木霉SC9制备耐冷木聚糖酶的方法产率较高，制得的耐冷木聚糖酶具有很强的底物特异性，仅作用于木聚糖，对其它非木聚糖多糖均没有活性，该酶最适反应温度为40-45℃，在较冷的温度下具有较高的木聚糖酶活性，稳定性和酸碱适应性都比较好。文档编号C12N9/42GK101381683SQ200810224159公开日2009年3月11日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者鹏周,朱会芳,江正强,闫巧娟申请人:中国农业大学