专利名称：卷烟主流烟气细胞毒性测定方法
技术领域：
本发明涉及巻烟主流烟气细胞毒性评价领域，具体说是一种巻烟主流烟气 细胞毒性测定方法，是通过将细胞暴露于巻烟主流烟气下，测定主流烟气造成 的细胞死亡率来进行细胞毒性测定。
背景技术：
巻烟烟气是由几千种化学物质组成的气溶胶，其中许多组分对于细胞或人 体都具有一定的毒性作用。科学家们开展了很多关于巻烟烟气或烟气中的化学
成分的细胞毒性研究，C0RESTA体外毒理学特别工作组推荐选用合适的哺乳动 物细胞用中性红方法评价巻烟烟气的细胞毒性，中性红评价方法已经被广泛用 于评定和比较不同焦油含量以及不同类型巻烟的烟气冷凝物的细胞毒性 [Putnam KP， Bombick匿，DoolittleDJ. Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate. Toxicology F/"o[J] 2002， 16 (5): 599-607]。此外，中性红方法还被应用于巻烟烟 气中 一些具有细胞毒性化合物的细胞毒性测定，以及被巻烟生产企业用来测定 比较添加和未添加巻烟添加剂巻烟烟气粒相物和气相物的细胞毒性[Roemer E.: F.J Tewes， T.J. Meisgen, et al. Evaluation of the potential effects of ingredients added to cigarettes. Part 3: in vitro genotoxicity and cytotoxicity. Food Chem Tox [J]. 2002， 40:105-111.]。寸旦以上研究测i式的 对象为主流烟气粒相物，将主流烟气用剑桥滤片进行捕集，然后将捕集到剑桥 滤片的主流烟气粒相物进行萃取，再进行细胞毒性测试。这样的测试方法要花 费大量的时间，操作繁瑣，且由于测试的只是巻烟主流烟气粒相物，没有测试 主流烟气中的气相组分，不能反映真实地主流烟气细胞毒性
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题，而专门开发的一种用 于巻烟主流烟气细胞毒性测定方法，本方法针对上述巻烟烟气细胞毒性测试中 仅仅测试捕集到剑桥滤片上的主流烟气粒相物细胞毒性的不足之处，同时还可 以大幅度减少烟气收集后进行繁瑣的溶剂萃取过程，可以直接并全面的反映巻 烟主流烟气细胞毒性，该方法操作简单，灵萄丈度高，结果可靠。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的先将培养好的细胞直接置入 经过洁净空气稀释的巻烟主流烟气中进行暴露，然后通过中性红染色，根据细 胞摄入中性红的情况，利用可读多孔培养板分光光度计进行吸光度值测定，与 洁净空气暴露对照样品比较，进而判断巻烟主流烟气毒性。本发明的具体测定方法包括以下步骤a. 细胞培养将测试细胞接种于细胞培养液中，在C02细胞培养箱中37 。C下培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中， 浓度为5. Q x 105-1 0. 0 x 105细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL,于(:02细胞培 养箱中37。C下培养24h;b. 细胞主流烟气暴露在ISO标准条件下抽吸巻烟，产生的主流烟气用洁 净空气稀释，烟气暴露浓度以稀释后的烟气中总粒相物(TPM)浓度为指标进行 控制，稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶中进行主流烟气暴露。暴露时 间为60min,整个暴露过程才艮据监测的TPM/L值进行控制，正常对照组通入洁净空气暴露。c. 烟气暴露后细胞培养暴露结束后，将培养瓶中的培养液换成新鲜的培 养液，并置于C02培养箱中37。C下培养24h,对照为通入洁净空气并经过相同 条件培养的平行样品；d. 中性红染色烟气暴露过的细胞培养24h后，吸出培养液，用37。C下 预热的含Ca2+、 Mg^磷酸盐緩冲液10mL-30mL漂洗2遍，加入20mL中性红培养 液，放入C02培养箱中37。C下培养3h,然后，除去中性红培养液，加入5mL-15 mL 1%曱醛固定液，室温下放置2min-10min,吸去固定液，加入20mL中性红溶 解液，室温下》i:置2min-10min,颠倒几次培养瓶，Y吏中性红充分溶解，吸取
0. lmL-O. 3 mL溶解液，置于96孔培养板中，以中性红溶解液作空白、空气暴 露样品作对照，用可读96孔培养板分光光度计测定溶解液在MOnm处的吸光值； e.数据处理和分析，评^介巻烟主流烟气细力包毒性。在本发明中，中性红培养液是由中性红染液和细胞培养液按体积比1:" 比例混合配制而成，需当日配制并过滤除菌。曱醛固定液是由曱醛和蒸馏水按 体积比1:99混合而成。中性红溶解液是由乙醇、水和水醋酸按体积比50: 49: 1本发明依据的测试原理在于将培养好的细胞直接置入巻烟主流烟气中进 行暴露，细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比，巻烟主流烟气的毒性 作用越大，暴露于巻烟主流烟气中存活的细胞就越少，染料吸收量也相应越少， 其吸光度值就低。这一实验设计比较客观地反映了巻烟主流烟气的毒性作用， 且能定量评价受试物的细胞毒性，与现有技术相比具有操作筒单，灵敏度高， 结果可靠的特点，开创了 一种新的用于巻烟主流烟气细胞毒性测定的方法。
图1为试验过程所用仪器的示意图。图中1为吸烟机，2为流量计，3为泵，4为细胞培养弁瓦。 图2为实施例1巻烟烟气细胞毒性剂量响应曲线图。 图3为实施例2巻烟烟气细胞毒性剂量响应曲线图。 图4为实施例3巻烟烟气细胞毒性剂量响应曲线图。
具体实施方式
本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。 实施例1对国产某巻烟(盒标焦油15mg)进行评价。样品巻烟在ISO标准条件下抽 吸，抽吸容量为每口 35ml,持续时间2s，每分钟抽吸一口。巻烟燃烧产生的主 流烟气用洁净的空气进行稀释，并调节烟气总粒相物浓度至30|ag/L、 60 ja g/L 、 90jig/L和120jig/L,将稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶进行
暴露，每个浓度暴露时间为60min。试验中所用吸烟机与细胞培养瓶连接及烟 气控制方式参见图1。此外，将长有细胞的培养瓶通入洁净空气作为对照样品。暴露结束后，将 培养瓶中的培养液换成新鲜的培养液并置于C02培养箱中培养24h。然后吸出培 养液并用预热的含Ca2+、 Mg"磷酸盐緩冲液20mL漂洗2遍，加入20mL中性红培 养液(由培养液加入中性红配置而成，要当日配置并过滤除菌)，放入CCh培养 箱中培养3h。然后将中性红培养液移除，加入5mL-lSmLl。/。曱醛固定液并放置 2min-5min,吸去固定液，加入20mL中性红溶解液(乙醇水冰醋酸50: 49: 1 )， 放置2min-5min后颠倒几次培养瓶，使中性红充分溶解，吸取Q. lmL-O. 3 mL 溶解液至96孔培养板。用中性红溶解液作为空白、空气暴露样品作为对照，用物统计软件进行分析，结果见图2。 LC5。 (LCs。是某主流烟气使受试细胞死亡一 半所需的浓度)计算结果为49. 2jLig/L。实施例2本实施例基本同于实施例1,仅是巻烟样品和烟气暴露浓度不同。巻烟样 品为盒标焦油8mg国产某巻烟，烟气暴露浓度为20|ag/L、 60jug/L、 80|ag/L、 100|ug/L、 120jug/L和150jig/L。结果见图3。 ZG。计算结果为78. 0 n g/L。实施例3本实施例基本同于实施例1,仅是巻烟样品和烟气暴露浓度不同。巻烟样 品为盒标焦油3mg国产某巻烟，烟气暴露浓度为60|ug/L、 90jig/L、 120pg/L 和160ng/L。结果见图4。 ZG。计算结果为95. lyg/L。
权利要求
1、一种卷烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在于先将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，然后通过中性红染色，根据细胞摄入中性红的情况，利用可读多孔培养板分光光度计进行吸光度值测定，与洁净空气暴露对照样品比较，进而判断卷烟主流烟气毒性。
2、 根据权利要求1所述的巻烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在 于其具体测定方法包括以下步骤a. 细胞培养将测试细胞接种于细胞培养液中，在C02细胞培养箱中37 。C下培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中， 浓度为5. Ox 105-10. Ox 105细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL,于。02细胞培 养箱中37。C下培养24h;b. 细胞主流烟气暴露在ISO标准条件下抽吸巻烟，产生的主流烟气用洁 净空气稀释，烟气暴露浓度以稀释后的烟气中总粒相物(TPM)浓度为指标进行 控制，稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶中进行主流烟气暴露，暴露时 间为60min;c. 烟气暴露后细胞培养暴露结束后，将培养瓶中的培养液换成新鲜的培 养液，并置于C02培养箱中37。C下培养24h,对照为通入洁净空气并经过相同 条件培养的平行样品；d. 中性红染色烟气暴露过的细胞培养24h后，吸出培养液，用37。C下 预热的含Ca2-、 Mg2+"磷酸盐緩冲液10mL-30mL漂洗2遍，加入20mL中性红培养 液，放入C02培养箱中37。C下培养3h,然后，除去中性红培养液，加入5mL-15 mL 1%曱醛固定液，室温下方欠置2min-10min，吸去固定液，加入20mL中性红溶 解液，室温下放置2min-10min，使中性红充分溶解，吸取0. lmL-0. 3 mL溶解液， 置于96孔培养板中，以中性红溶解液作空白、空气暴露样品作对照，用可读 96孔培养板分光光度计测定溶解液在54Qnm处的吸光值；e. 数据处理和分析，评价巻烟主流烟气细胞毒性。
3、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在 于中性红培养液是由中性红染液和细胞培养液按体积比1:"比例混合配制而 成，当曰配制并过滤除菌。
4、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在 于曱醛固定液是由曱酪和蒸馏水按体积比1: 99混合而成。
5、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在 于中性红溶解液是由乙醇、水和冰醋酸按体积比50: 49: 1配制而成。
全文摘要
一种卷烟主流烟气细胞毒性测定方法，其特征在于先将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，然后通过中性红染色，根据细胞摄入中性红的情况，利用可读多孔培养板分光光度计进行吸光度值测定，与洁净空气暴露对照样品比较，进而判断卷烟主流烟气毒性。本发明依据的测试原理在于将培养好的细胞直接置入卷烟主流烟气中进行暴露，细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比，卷烟主流烟气的毒性作用越大，暴露于卷烟主流烟气中存活的细胞就越少，染料吸收量也相应越少，其吸光度值就低。本发明能定量评价受试物的细胞毒性，具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于卷烟主流烟气细胞毒性测定的方法。
文档编号C12Q1/02GK101393190SQ200810230659
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者卢斌斌, 孙世豪, 宗永立, 军 胡 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院