专利名称：孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立方法，属于胚胎干细胞系技术领域。
背景技术：
胚胎干细胞(Embryonic stem cell)也称ES细胞，是由发育5-7天囊胚的内细胞团细胞 在体外进行传代扩增而得到的，具有无限增殖和多向分化潜能的特征。人类ES细胞可以在体 外诱导分化成为人体的各种细胞，广泛应用于医学临床和科学研究。但由于ES细胞来源于胚 胎，在某些M家和地区受到宗教、道德和伦理的制约，大大限制了ES细胞的研究发展。
胚胎千细胞目前按来源分有三种正常胚胎来源(绝大多数)、核移植来源和孤雌来源(只 要卵子激活，不需精子受精形成胚胎)。孤雌生殖是在无需精子的条件下，自发或经物理、化 学刺激，使卵母细胞有丝分裂激活，而形成胚胎，并可继续发育至成熟而产生后代，即无雄 性配子的任何作用，由雌性配子产生胚胎。最近有文献报道,孤雌生殖的胚胎干细胞同样具有 无限增殖和多向分化潜能，它与胚胎来源的ES细胞一样，可在体外诱导分化成机体的各种细 胞。这样一来，若能建立孤雌生殖胚胎干细胞系，就可避免胚胎来源的ES细胞导致的宗教、 道德、伦理上的争议，为ES细胞的来源提供了一个新的途径。现有的孤雌激活源性胚胎干细 胞系的建立技术流程--般是促排卵——取卵——化学激活——胚胎培养一一分离内细胞团细 胞^~扩增——传代。记载孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立情况的现有文献有-
1. 1983年2月《胚胎实验形态学(J Embryol Exp Morphol)》杂志发表的《来自鼠单 倍体胚胎多能干细胞系的建立》(Establishment of pluripotential cell lines fromh即loid mouse e油ryos.),采用小鼠卵，用7%的酒精激活。
2. 2002年2月《科学(Science)》杂志发表的《非人灵长类单性生殖干细胞系》 (Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates.)杂志，采用猴子卵，激活是应用
钙离子载体A23187处理8分钟和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理4小时。
3. 2007年2月《干细胞》(Stem Cells)杂志发表的《兔胚胎干细胞系的建立和鉴定》 (Generation and characterization of rabbit embryonic stem cells), 采用兔子卵。
4. 2003年21 (2)丄52-61《干细胞(Stem Cells)》杂志发表的《来源于二级卵母细胞 中期纯合子的多能干细胞系》(Multilineage potential of homozygous stem cells derived from raetaphase II oocytes),采用小鼠卵，激活是应用钙离子载体A23187处理5分钟和 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理3小时。
5. 2007年9(3):432-49《来源于人单性生殖囊胚的患者特异性干细胞系》 (Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts). 《克隆干细胞(C]oning Stem Gelis)》杂志，采用人卵。
以上文献均采用免疫外科法分离内细胞团，免疫反应容易损伤内细胞团细胞，使其活力 下降，耗时长，不利于保护细胞，囊胚率较低。
发明内容
本发明针对现有孤雌激活源性胚胎干细胞系建立技术存在的问题，提供一种孤雌激活源 性胚胎干细胞系的建立方法。本发明的孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立方法包括以下步骤
(1) 以孕马血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性动物体，进行超促排卵；
(2) 取卵后应用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对其进行化学激活 以80u/ml透明质酸酶消化半分钟，先用人类输卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5umol/L钙离子载体A23187的人类输卵管液中，37。C避光放置5分钟， 再以人类输卵管液(HTF)洗涤3次后，置于含10wg/ral嘌呤霉素的HTF中，在37'C、 5% C02培养箱中培养4小时进行激活处理，将激活发育的胚胎体外培养至囊胚；
(3)机械法分离内细胞团细胞，在37'C温台、避光及保持湿润的条件下，以细针直接刺 破胚胎囊胚，将内细胞团剥离出来，在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增培养，建立稳 定的动物孤雌激活ES细胞系。
上述方法适用于各种动物体的孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立。
本发明的孤雌激活ES细胞与胚胎来源的ES细胞一样，能够在体外可被诱导分化为全身 各种组织细胞，激活处理的效果好，囊胚率可高达96.5%,高于现有的文献报道，以针刺的 机械法分离内细胞团细胞，避免了免疫反应对内细胞团细胞的损伤，而且耗时短，减少细胞 在培养箱外的暴露时间，最大程度的保护了细胞。本发明不但避免因破坏胚胎所带来的各种 伦理问题，还能解决胚胎来源ES细胞应用中的免疫原性问题，拓展了 ES细胞的来源和研究 范畴。
图丄是雌性昆明小鼠的卵母细胞图。 图2是激活发育的昆明小鼠2细胞胚胎图。 图3是激活发育的昆明小鼠4细胞胚胎图。 图4是胚胎体外培养的囊胚图。 图5是内细胞团细胞图。
图6是雌性昆明小鼠第37代孤雌胚胎干细胞(PGES)图。 图7是PGES表达特异性指标SSEA-4图。 图8是P(;ES表达特异性指标oct-4图。 图9是PGES细胞的纯和性鉴定图。 图IO是PGES细胞的染色体鉴定(40， XX)图。 图11是PGES细胞的体外分化拟胚体图。 图12是PGES细胞的体外分化血管样结构图。 图13是PGES细胞的体内分化肌肉组织图。 图14是PGES细胞的体内分化原始神经细胞图。 图15是PGES细胞的体内分化腺上皮细胞图。
具体实施例方式
以昆明小鼠为例，本发明的孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立技术流程是雌性昆明小 鼠超促排卵~"^取卵——应用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对其进行 化学激活——机械法分离内细胞团细胞一一将内细胞团细胞置于事先铺好饲养层细胞的培养
皿中——扩增_一-传代——鉴定。具体步骤如下。1. 以孕马血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性昆明小鼠，进行超促排卵，雌性昆明小鼠 的卵母细胞如图1.所示。
2. 取卵后应用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对其进行化学激活 以80u/ml透明质酸酶消化半分钟，先用人类输卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5"mo1/L钙离子载体A23187的人类输卵管液中，37'C避光放置5分钟。 再以HTF洗涤3次后，置于含lOu g/ml嘌呤霉素的HTF中，在37。C、 5%0)2培养箱中培养 4小时进行激活处理。激活发育的2细胞昆明小鼠胚胎如图2所示，激活发育的昆明小鼠的4 细胞胚胎如图3所示。
再以胚胎培养液G1(瑞典的vitrolife公司)进行胚胎培养，胚胎分裂为8细胞后换液， 以G2(同前)继续培养至囊胚阶段。激活发育的胚胎体外培养的囊胚如图4所示，上述方法培 养的囊胚率为96.5%,高于现有的文献报道。
3. 将激活发育的胚胎体外培养至囊胚后，以机械法分离内细胞团细胞(内细胞团细胞如 图5所示)，就是在37"C温台、避光及保持湿润的条件下，以中医所用针灸的细针直接刺破 胚胎，将内细胞团剥离出來。
4. 在铺有饲养层细胞(昆明小鼠胚胎的成纤维细胞，经丝裂霉素处理后停止增殖，即不 消耗培养液的营养成分，只分泌利于干细胞生长的各种因子)的培养皿中传代、扩增培养， 建立稳定的小鼠孤雌激活ES细胞系。
图6给出了昆明小鼠第37代孤雌胚胎干细胞(PGES)。图7给出了昆明小鼠第37代PGES 的表达特异性指标SSEA-4，图8给出了 PGES表达特异性指标oct-4，图7和图8的胚胎干细 胞特异性指标的表达，证明该细胞是胚胎干细胞。图9给出了PGES细胞的纯和性鉴定，证明 是孤雌激活来源的。图IO给出了 PGES细胞的染色体鉴定(40， XX)。图11给出了PGES细 胞体外分化的拟胚体，图12给出了 PGES细胞体外分化的血管样结构图。
PGES细胞体内分化，即将细胞打到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，病理切片检测发现包含3个 胚层的组织，证明PGES细胞的多向分化潜能。图13给出了 PGES细胞体内分化的肌肉组织， 图14给出了 PGES细胞体内分化的原始神经细胞图，图15给出了 PGES细胞体内分化的腺上 皮细胞。
权利要求
1. 一种孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立方法，其特征是包括以下步骤(1)以孕马血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性动物体，进行超促排卵；(2)取卵后应用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对其进行化学激活以80μ/ml透明质酸酶消化半分钟，先用人类输卵管液(human tubalfluidmedium，HTF)洗3遍，再置于含5μmol/L钙离子载体A23187的人类输卵管液中，37℃避光放置5分钟，再以人类输卵管液(HTF)洗涤3次后，置于含10μg/ml嘌呤霉素的HTF中，在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时进行激活处理，将激活发育的胚胎体外培养至囊胚；(3)机械法分离内细胞团细胞，在37℃温台、避光及保持湿润的条件下，以细针直接刺破胚胎囊胚，将内细胞团剥离出来，在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增培养，建立稳定的动物孤雌激活ES细胞系。
全文摘要
本发明提供了一种孤雌激活源性胚胎干细胞系的建立方法，包括以下步骤以孕马血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性动物体，进行超促排卵；取卵后应用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对其进行化学激活，将激活发育的胚胎体外培养至囊胚；机械法分离内细胞团细胞，以细针直接刺破胚胎囊胚，将内细胞团剥离出来，在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增培养，建立稳定的动物孤雌激活ES细胞系。本发明激活处理的效果好，囊胚率可高达96.5％，以针刺的机械法分离内细胞团细胞，避免了免疫反应对内细胞团细胞的损伤，而且耗时短，减少细胞在培养箱外的暴露时间，最大程度的保护了细胞，解决了胚胎来源ES细胞应用中的免疫原性问题。
文档编号C12N5/06GK101429493SQ20081023833
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者晴 宦, 凯 徐, 彦 王, 钱德俭, 陈子江, 多 韦, 选 高 申请人:彦 王