具有改变特性的布丘氏菌属菌植酸酶变体的制作方法

专利名称：具有改变特性的布丘氏菌属菌植酸酶变体的制作方法
具有改变特性的布丘氏菌属菌植酸酶变体发明领域本发明涉及布丘氏菌属菌(Buttiauxellaspp.)植酸酶变体，编码该植 酸酶的核酸和异源表达的方法。本发明涵盖的植酸酶可以用于的工业应用 包括淀粉液化的方法、醇发酵和用于提高食物和动物饲料中磷酸酯的消化。发明背景磷(P)是生长的必需元素。常规牲畜饲料例如谷粒、油粕饼、和来 源于种子的副产品中发现的大量的磷为在称为植酸的分子中共价结合的磷 酸酯形式。对于非反刍动物，这种形式的磷的生物利用度通常非常低，例 如家禽和猪，因为它们缺乏从植酸分子中分离出磷的消化酶。注意到非反刍动物不能利用植酸的几个重要后果。例如，为了满足动 物对磷的营养需要，加入无机磷(例如，磷酸二钙、脱氟磷酸盐)或动物 产品(例如，肉类和骨粉、鱼粉)产生了花费。另外，植酸能结合或螯合 胃肠道中的许多矿物质(例如，钙、锌、铁、镁和铜)，因此使得所述矿 物质不能被吸收。此外，饲料中的大部分植酸经过胃肠道，排泄物中的磷 含量提高了。这导致增加了环境中的生态学的磷负担。微生物的植酸酶作为饲料添加剂改善了典型的非反刍动物祠料中植酸 磷的生物利用度(参见，例如，Cromwell等人，1993)。结果是向动物饲 料中添加无机磷的需要减少了，排泄物中的磷水平也降低了 (参见，例如， Kornegay等人，1996 )。除了饲料添加剂之外，植酸酶还可以用于低植酸 钙镁饲料组分的生产。例如，植酸酶可以用于谷物的湿磨法中，以生产例 如低植酸钩镁玉米浆和低植酸钓镁谷物蛋白(corn gluten);或与淀粉水解酶 结合用于千磨法中，以生产葡萄糖和醇(例如，乙醇)。尽管植酸酶有上述用途的优点，令人惊讶的是很少有已知的植酸酶得 到广泛接受的应用于饲料、淀粉液化和醇发酵工业中。其原因是酶和酶的 不同。典型的担心是关于该酶在所希望的应用环境中的高生产成本和/或低 稳定性/活性。如果要使植酸酶在工业应用中引起广泛关注，其必须满足许多酶标准。较重要的酶标准包括高的总比活性、低的pH最适度、对胃肠 道蛋白酶的耐受和热稳定性。热稳定性是植酸酶作为伺料酶成功应用和淀粉液化中最重要的前提条 件之一，因为在饲料和/或工艺中植酸酶暴露于升高的温度。例如，在饲料 造粒工艺中温度在60到95。C之间，在淀粉液化工艺中温度在75到120°C 之间。WO 06/043178中报道了布丘氏菌属P1-29菌中编码植酸酶的基因的 DNA序列，公开于2006年4月27日。参考其中报道的SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO:2和布丘氏菌属Pl-29菌的植酸酶基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。基于多个固有的特性，布丘氏菌属Pl-29菌的植酸酶代表了一个 很好的开端，从此为不同的商业应用开始了热稳定植酸酶的诱变方案。WO 06/043178公开了布丘氏菌属Pl-29菌植酸酶的许多变体(参见，例如，表 1)。在WO 06/043178公开的至少一种变体被进一步改良，其中所述变体 在本发明中称为BP-ll。本发明涉及具有改变的特性的变体，例如改良的 特性，包括但不限于与布丘氏菌属Pl-29菌的植酸酶或BP-11变体相比较 a)提高的热稳定性，b)增加的比活性，和/或c)增加的比活性并保留热稳定 性。发明概述一方面，本发明涉及这样的植酸酶，它是编码植酸酶的突变的DNA 序列的表达产物，突变的DNA序列衍生自布丘氏菌属菌植酸酶前体。在 一个实施方案中，植酸酶衍生自布丘氏菌属Pl-29菌林。另一方面，本发明涉及植酸酶变体，所述变体包含对应 衍生自布丘 氏菌属Pl-29菌林的植酸酶中A122， D125, T167， F197, T209， A211， K240，A242， S281， Q289， A294和N303位置的替代。另一方面，本发明涉及分离的植酸酶，包含对应于SEQ ID NO: 1的 位置A122， D125, T167, F197, T209, A211, K240， A242, S281, Q289, A294 和N303的替代，并且包括所述变异替代在内具有与SEQ ID NO: 1的第 34-446位氨基酸残基至少95%的序列同一性。在一个实施方案中，替代 包含SEQ ID NO: 1的A122T， D125A， T167I, F197S， T209K， A211P， K240E， A242S, S281L， Q289Y， A294E和N303K位置。在另 一个实施方案 中，替代对应于SEQ ID NO:l的R51, R55， T58， K59, D125, R127, K164, N239， G248, T252, E255， E276， H286， F290， M293,固3， H339， D340， T341,和/或D361位置。另一方面，本发明涉及名为BP-11的植酸酶的变体，所述变体包含对 应于SEQ ID NO: 4的R24， R28, T31， K32， D98， R100， K137， N212, G221, T225, E228， E249， H259， F263, M266, N276, H312, D313, T314,和/或D334 位置的替代。在一个实施方案中，BP-11的变体具有一个对应于D98位置 的替代。在一个优选实施方案中，替代是D98A。在另一个方面，本发明涉及具有植酸酶活性的包含SEQ ID NO:3的多 肽。在一个实施方案中，本发明涉及具有植酸酶活性的由SEQIDNO:3所 示氨基酸序列组成的多肽。在另一方面，本发明涉及分离的编码本发明所述植酸酶变体的DNA 和包括所述DNA的表达载体。在另一方面，本发明涉及布丘氏菌属菌的具有改善的植酸酶特性的变 体。在一个实施方案中，改善的植酸酶特性是相比于天然布丘氏菌属菌增 加的热稳定性，更具体的是衍生自P1-29菌林的布丘氏菌属菌植酸酶。在 另一实施方案中，变体具有与BP-11相比改善的特性。在另一方面，本发明涉及包含具有植酸酶活性的蛋白质的酶组合物， 其中酶组合物用于商业应用。在一个实施方案中，该酶组合物是动物饲料 组合物。在另一个实施方案中，该酶组合物可用于淀粉水解(如液化)工 艺。在进一步的实施方案中，包含本发明中所述的植酸酶的酶组合物包含额外的酶，例如葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、和它们的组 合。在一方面，本发明涉及发酵培养基，所述发酵培养基包括来自丝状真 菌细胞培养物的布丘氏菌属菌植酸酶或其变体。在一个方面，丝状真菌细胞是木霉属(7Wc/^^nw")细胞，例如里氏木霉(r. 在一个方面，植酸酶具有与SEQ ID NO:l有至少75%序列同一性的氨基酸序列，例如 SEQIDNO:l、 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在另一方面，本发明涉及丝状真菌宿主细胞中生产植酸酶方法，用 DNA构建体转化丝状真菌宿主细胞，该构建体包括在丝状真菌宿主细胞中植酸酶具有植酸酶活性并且其氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有至少75%序 列同一性；在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许表达 所述植酸酶；和生产植酸酶。该方法也可以包括回收产生的植酸酶。在一 个实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞，例如里氏木霉。在一个 方面，植酸酶具有与SEQ ID NO: 1至少95%的氨基酸序列同一性。在进 一步的方面，植酸酶具有SEQ ID NO: 1， SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3 所示的序列。另一方面，本发明涉及按照上述方法获得的木霉属细胞。附图简述图IA描述了由来源于布丘氏菌属Pl-29菌株植酸酶基因编码的多肽 (BP-WT) (SEQ ID NO: 1)，包括天然信号序列和成熟蛋白(SEQ ID NO:2)。信号序列有下划线。图IB描述了变体BP-11成熟蛋白，没有信号序列但包括N端His标 签(SEQ ID NO:4)。 BP-11变体与BP-WT比对时具有一个11个氨基酸残 基的替代。这些替代突出显示并且在图中具有下划线。

图1C描述了变体布丘氏菌属菌植酸酶的成熟蛋白(BP-17)(SEQ ID NO:3)。 BP-17变体具有与BP-11相同的11个氨基酸的替代加一个其它替 代，在图中的突出显示和下划线部分。图2说明实施例3中较详细描述的表达载体pCDP(SHOK)。
图3显示大肠杆菌(E. coli)表达的BP-17和实施例3中进一步描述的
BP-WT的pH曲线图比较。
图4显示实施例3中进一步描述的BP-WT和BP-17突变体的胃蛋白
酶抗性。
图5说明实施例4中进一步描述的pTREX4/植酸酶融合构建体。 图6说明实施例6中进一步描述的pTREX4/植酸酶直接构建体。
发明详述
除非本发明有其他定义，在文中使用的所有的技术和科^^支术语具有相 同于本发明所属领域普通技术人员所知道的一般含义。Singleton等人， DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.， John Wiley and Sons, New York(1994),和Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的一些术语的通用词典。
尽管和本发明描述的相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的 实践或实验中，优选的方法和材料在本发明中描述。数字范围包含定义该 范围的数值。除非另外说明，核酸序列从左至右是5，到3'方向，氨基, 列从左至右是从N端到C端方向。
本发明标题不局限于本发明不同的方面或具体实施方案。相应的，以 下定义的术语参考^C明书作为整体给出更完整的定义。
定义
本发明使用的术语"植酸酶"或"植酸酶活性"是指这样的蛋白或多肽， 所述蛋白或多肽可以催化植酸水解为(l)肌醇和/或(2)肌醇单，二，三，四 和/或五磷酸酯和(3)无机磷酸盐。例如，有催化活性酶定义为酶学委员会 EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26。
本发明使用的术语"布丘氏菌属菌植酸酶，，是指从布丘氏菌属中的种获 得的植酸酶蛋白。在一个实施方案中，布丘氏菌属菌植酸酶包含NCIMB(英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)的登录号为NCIMB 41248的氨基酸 序列。在一个优选实施方案中，布丘氏菌属菌植酸酶包含SEQIDNO:2所 示的氨基酸序列或SEQ ID NO:l的第34到446位氨基酸残基。
本发明使用的术语"对应于布丘氏菌属菌植酸酶，，涉及这样的酶，所述 酶具有与布丘氏菌属菌植酸酶相同的功能特性或序列，但不必获自布丘氏 菌属菌。
术语"布丘氏菌属(Buttiauxella)，，是指肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的 革兰氏阴性兼性厌氧菌的一个属，并且布丘氏菌属中的种包括乡间布丘氏 菌(B. agrestis)，布里纳氏布丘氏菌(B. brennerase)，费拉格布丘氏菌(B. ferragutiae)，伽瓦尼布丘氏菌(B. gaviniae)，伊查德氏布丘氏菌(B. izardii)， 诺基亚布丘氏菌(B. noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B. warmboldiae)。布 丘氏菌属的菌林可以是例如获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)和 DSMZ，德国国家生物材料资源中心。
术语"野生型4直酸酶"或"野生型"是指具有自然界中发现的氨基酸序列 的酶。
术语"布丘氏菌属菌植酸酶变体"是这样的植酸酶，该酶的氨基酸序列 衍生自亲本植酸酶或前体植酸酶的氨基酸序列，但至少有一个称为突变的 氨基酸的替代、插入和/或删除。
术语"成熟的植酸酶，，是指信号加工后的植酸酶，例如删除分泌信号序列。
术语"BP-11"是包含SEQ ID NO:4的第7-419位置所示氨基酸序列 的植酸酶。BP-11是具有SEQ ID NO: 1所示序列的野生型布丘氏菌属菌植 酸酶的变体。
术语"BP-17，，表示包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的植酸酶。 在文中使用的"蛋白质"包括蛋白质、多肽、和肽。为本领域技术人员
所理解，如下定义和此处进一步所描述，本发明的核酸序列可以用于生成
蛋白质序列。
术语"等同于...的氨基酸残基"，"对应于...的氨基酸，，及其语法上等同
10的说法，用于文中表示与特定蛋白的特定氨基酸序列具有类似位置和类似 作用的蛋白的氨基酸残基。本领域的技术人员可以认识到在可比较的植酸 酶蛋白质中特定残基的等同物。
关于两个氨基酸或多核苷酸序列的"百分序列同 一性"，是指当两个序
列最佳比对时，其中相同的残基的百分比。例如，80%氨基#列同一性 是指在两个最佳比对的多肽序列中有80%的氨基酸残基是相同的。例如， 通过直接比较两个分子的序列信息可以确定同一性百分数，通过比对序列、 数出两个所比对序列的匹配的准确个数，除以较短序列的长度，并且结果 乘以100。易于获得的计算机程序可以用于辅助这些分析，例如ALIGN, Dayhoff， M.O.在M.O. Dayhoff编辑的Atlas of Protein Sequence and Structure, Suppl. 3:353-358中,National Biomedical Research Foundation, Washington, DC,其改编了 Smith和Waterman(1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489的局部同源性算法用于肽分析。Wisconsin Sequence Analysis Package,版本8 (可获自Genetics Computer Group, Madison, WI )提供了确定核苷酸序列同 一性的程序。例如BESTFIT, FASTA和GAP 程序也是基于Smith和Waterman算法。这些程序可容易的根据生产商推 荐的默认参数和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所描述的进行 使用。 一个适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，该算法 在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中描述。BLAST分析软件 可 以 通过 National Center for Biotechnology Information (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
术语"特性，，或与其语法上相同的词，在文中所用的表示多肽的上下文 中，是指一个多肽的可以选择的或检测的任何特征或属性。这些特性包括 但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性曲线、
和分泌能力。
术语"热稳定的，，是指本发明中的植酸酶在暴露于升高的温度后能保持 特定量的酶活性。
术语"增加的稳定性"在特性如热稳定性的上下文中是指随着时间的推移，与其他;fci酸酶相比更高地保留酶活性。
本发明可互换使用的术语"多核苷酸"和"核酸"是指任何长度的核苷酸 的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限 于单、双或三螺旋DNA、基因组DNA、 cDNA、 RNA、 DNA-RNA杂合体、 或包含噤呤和嘧咬碱基、或其他天然的、化学的、生化化学修饰的、非天 然的或衍生的核苷酸的聚合物。
本发明使用的术语"基因，，是指这样的多核苷酸(例如，DNA片段)， 该多核苷酸编码多肽并包括在编码区之前和之后的区域，也包括在分别的 编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明4吏用的术语"DNA构建体"、"转化DNA"和"表达载体"可互换 使用，是指用于将序列导入宿主细胞或生物体的DNA。这种DNA可以在 体外由PCR或任〃f可其他适合的本领域已知的合适技术生成。DNA构建体、 转化DN A或重组表达盒可以被掺入质粒、染色体、线粒体DN A 、质体DN A 、 病毒或核酸片段。 一般而言，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组 表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，以及其它序列。在一个优选 的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中掺入并表达异源DNA片段的 能力。
本发明使用的术语"载体"是指为引核酸入一个或多个细胞型而设计的 多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。
在将核酸序列导入细胞的上下文中，所用的术语"导入"是指任何在细 胞中导入核酸序列的适合方法。该导入方法包括但不限于原生质体融合、 转染、转化、接合、和转导，并包括提到的将核酸序列掺入于真核细胞或 原核细胞，其中所述核酸序列可以掺入细胞的基因組(例如，染色体、质 粒、质体、或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或瞬时表达(例如，转 染的mRNA)。
术语"最佳比对，，是指给予最高百分同一性分值的比对。
术语"蛋白质，，和"多肽，，在此可以互换使用。本发明的说明书和权利要 求中，使用常规的一个字母和三个字母代码表示氨基酸残基。氨基酸的三个字母代码符合IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(Joint Commissionon Biochemical Nomenclature; JCBN)的规定。可以理解的是，因为遗传密码子的简并性，多肽也可以由多于一个的核苷酸序列编码。
本发明中的变体按照下述命名法描述原始氨基酸残基/位置/替代的氨基酸残基。例如，SEQ ID NO: 1中51位置用谷氨酸(E )替代精氨酸(R)表示为R51E。在一个给定的位置用多于一个的氨基酸替代时，则所述替代表示为1) R51E， R51A， R51H或R51W; 2) R51E， A， H，或W;或者c) R51/E/A/H/W。当文中鉴定了一个适合替代的位置而未给出具体替代氨基酸的建议时，理解为任何氨基酸残基可以替代在位置上出现的氨基酸残基。当与其它植酸酶相比，植酸酶变体包含缺失，该缺失用"*"表示。例如，在R51位置处的缺失表示为R51*。两个或多个连续的氨基酸缺失表示例如为(51 -54)*。
"前序列(prosequence)，，是在信号序列和成熟蛋白之间的氨基酸序列，是蛋白质分泌所必需的。前序列的切割导致生成成熟有活性的蛋白质。
术语"信号序列"或"信号肽"是指任何可参与成熟蛋白或前体形式蛋白质的分泌的核苷酸序列和/或氨基酸序列。信号序列的这种定义是功能性的，是指包括所有参与完成蛋白质分泌的N端蛋白质基因编码的氨基^列。信号序列通常但全部是结合于蛋白质的N端部分或前体蛋白的N端部分。
"宿主菌林，，或"宿主细胞"是指适合包含本发明所述DNA的表达载体表达的宿主。
术语"衍生自"和"获得自"不仅是指由或可由所讨论的生物体的菌林产生的，也指由分离自该菌林的DNA序列编码的和在包含该DNA序列的宿主生物体中产生的植酸酶。另夕卜，这个术语也指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的植酸酶，并且这种植酸酶具有正在讨论的植酸酶的鉴别特征。
术语"分离的"、"回收的，，或"纯化的"是指从其原始的环境中移出的物质。"伺料"和"食物"分别是指任何天然或人工的饮食、膳食等、或分别用于或适用于动物和人食用、摄入、消化的此类膳食的组分。
"食物或饲料添加剂"是用于或适用于添加到食物或饲料中的基本上纯的化合物或多组分组合物。其通常包含一种或多种化合物，例如维生素、矿物质或饲料增强酶和适合的载体和/或赋形剂，并且其通常以适合添加到动物饲料中的形式提供。
术语"淀粉液化"是指淀粉转化为较短链和较少粘性糊精的过程。
术语"天然的布丘氏菌属菌植酸酶(n-布丘氏菌属菌植酸酶)"是指自内源表达的布丘氏菌属菌植酸酶产生的布丘氏菌属菌植酸酶。例如，术语"n-布丘氏菌属菌植酸酶"是指由布丘氏菌属的物种内源表达的布丘氏菌属菌植酸酶(即SEQ ID NO: 1)。
术语"重组布丘氏菌属菌植酸酶(r-布丘氏菌属菌植酸酶)"、"重组表达的布丘氏菌属菌植酸酶"和"重组产生的布丘氏菌属菌植酸酶"是指成熟的布丘氏菌属菌^i酸酶蛋白质序列或变体，其自异源多核苷酸在宿主细胞中的表达产生。例如，术语"r-布丘氏菌属菌植酸酶"是指在导入了编码布丘氏菌属菌植酸酶或变体的多核苷酸的宿主中表达的布丘氏菌属菌植酸酶(即SEQ ID NO: 1， 2或3 )。
"启动子，，是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调控序列。
术语"在转录调控下"是本领域已知的，是指多核苷酸序列的转录(通常是DNA序列的转录)取决于其被有效连接至一个有助于起始或促进转录的元件。
"在翻译调控下"是本领域中已知的，是指在mRNA形成后发生的调控过程。
如文中所用，当描述蛋白质和编码其的基因时，基因的术语用斜体表示(例如，编码布丘氏菌属菌植酸酶的基因)。蛋白质的术语通常不是斜体的并且首字母通常是大写的。
术语"有效连接的，，是指元件位于允许它们发挥相关功能地排列的毗邻关系。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则该启动子被有效连接至编码序列。
术语"选择性标记"是指能够在宿主中表达的基因，这些基因允许方便地选择那些转入了核酸或载体的宿主。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物抗性(例如，潮霉素抗性、博莱霉素抗性、或氯霉素抗性)和/或赋予代谢优势的基因，例如宿主细胞的营养优势。
谈及多核苷酸或蛋白质时所用的术语"异源的"，是指多核苷酸或蛋白质不在宿主细胞中天然产生。
谈及多核普酸或蛋白质时所用的术语"内源的"，是指多核苷酸或蛋白质在宿主细胞中天然存在。
在文中使用的术语"回收的，，、"分离的，，和"分开的，，是指从与其天然相关的至少一个组分中移出化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
如文中所使用的，谈及细胞时所用的术语"转化的"、"稳定转化的"和"转基因的"，是指细胞具有非天然的(例如，异源的)核酸序列掺入其基因组或其作为附加型质粒保留多个世代。
如文中所使用的，术语"表达"是指一个过程，通过该过程基于基因的核酸序列产生了多肽。该过程包含转录和翻译。
的实践或实l^，现在描述典型的优选的方法和材料。所有在此记载的出版物作为参考引入，用于公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
其他术语的定义可以在说明书中出现。在示例性的实施方案更详细的描述之前，可以理解本发明不限于如此处描述的优选的实施方案，当然也可以不同。也可以理解在文中使用的术语的目的仅仅是描述优选的实施方案，并不是用于限制范围，因为本发明的保护范围仅以后面的权利要求为限。
在提供数值范围之处，可以理解的是指每个居中值，到下限的单位的十分之一，除非上下文中明确规定并非如此，这个范围的上限和下限之间也明确的公开了 。本发明包含任何公开数值或公开范围的居中值之间的每个较小范围和任何其它公开的或公开范围内的居中值。这些较小范围的上下限可被独立的包括或排除在该范围中，每个范围(在该较小范围中只包含上限或下限之一、不包含上下限或同时包含上下限)同样-陂涵盖到本发明中，同时在公开的范围内具有任何明确排除的端值。若记载的范围包含一个或两个端值，在包含端值的范围内排除两端值之一或两者的范围也包含在本发明中。
在文中和权利要求中，单数形式"一"、"一个"和"该"包含多于一个的情况，除文中清楚地指明了例外。因此，例如，谈及的"基因"包括多个此类候选基因，谈及的"该细胞"包括一个或多个细胞和本领域技术人员已知的等同物等。
此处所讨论的出版物仅是在本发明的申请日之前公开的出版物。此处没有内容被理解为承认本发明由于在先发明而不能早于这些出版物。
植酸酶/变体
作为亲本酶或前体酶所用的植酸酶包括布丘氏菌属菌植酸酶和对应于布丘氏菌属菌植酸酶的酶。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶包含NCIMB(英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)的登录号为NCIMB41248的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶包含SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:l所示的34到446位氨基酸残基(如SEQ ID NO:2 )。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶衍生自乡间布丘氏菌、布里纳氏布丘氏菌、费拉格布丘氏菌、伽瓦尼布丘氏菌、伊查德氏布丘氏菌、诺基亚布丘氏菌和瓦姆波德布丘氏菌。如WO 2006/043178所述，明确引入本文作为参考，描述了所述可获得自或衍生自亲本布丘氏菌属菌和对应于布丘氏菌属菌植酸酶的植酸酶。在一些实施方案中，野生型布丘氏菌属菌植酸酶与SEQ ID NO: 1所示多肽或SEQID NO:2所示多肽有至少75%,至少80%，至少85%,至少90%，至少93%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,和至少99%的氨基酸序列同一性。
本发明涉及植酸酶变体(例如，布丘氏菌属菌植酸酶变体)。特别是，WO 2006/043178描述了野生型植酸酶的诱变，其中所述野生型植酸酶具有
16其中/zHf的SEQ ID NO:3所示序列，并在本申请中称为SEQ ID NO:l和 SEQIDNO:2。 WO 2006/043178教导了许多优选的突变。植酸酶变体包含 至少一个氨基酸替代、删除或插入，特别优选的是氨基酸的替代。氨基酸 的替代、插入或删除可以发生在植酸酶多肽的任意残基处。本发明的植酸 酶变体是不具有与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的相同序列的变体。
本发明一个优选实施方案中，变体包含对应于布丘氏菌属菌植酸酶的 A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240， A242, S281, Q289, A294和 N303位置的替代，更具体的对应于SEQ ID NO: 1的所述等同位置的替代。 在一些实施方案中，替代包含任意的对应于A， C， D， E， F， G， H， I， K， L， M， N， P, Q， R， S， T， V， W或Y的19种氨基酸。在一些实施方案中，突变包含 下述对应于SEQ ID NO: 1的A122T， D125A， T167I, F197S， T209K, A211P， K240E， A242S， S281L, Q289Y， A294E和N303K位置的氨基酸替代。
在一些实施方案中，植酸酶是称为BP-ll的变体植酸酶，所述变体 BP-ll包含SEQ ID NO:4的第7-419位置所示的氨基酸残基。BP-ll是 BP-WT的变体(SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，所述BP-ll植酸酶的变体包含至少一个对应于 SEQ ID NO: 4的R24， R28， T31， K32， D98， R100， K137, N212, G221, T225, E228, E249, H259， F263, M266， N276, H312, D313， T314和/或D334位置的 替代，或是包括所述变异替代在内的序列，其与SEQ ID NO:4的第7-419 位氨基酸残基具有至少95%，至少96%，至少97%，至少98%和至少99% 的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体包括多于一个的替代，例 如，二个、三个、四个或更多个的替代。在另一实施方案中，BP-ll的变 体具有对应于D98位置的替代。替代的氨基酸可以是19种剩余氨基酸中 的任一种，在一个优选的实施方案中，替代是D98A。在一个更进一步的 实施方案中，具有对应于D98位置的替代的BP-ll变体包括一个或多个对 应于SEQ ID NO:4的R24， R28， T31， K32, R100， K137, N212， G221， T225， E228, E249， H259， F263, M266， N276, H312, D313, T314和/或D334位置的 替代。在一些实施方案中，变体具有与BP-11植酸酶相同的或更高的活性。在一个特别优选的实施方案中，植酸酶变体包含SEQ ID NO:3所示的 多肽。在另 一个实施方案中，植酸酶变体由SEQ ID NO:3所示的多肽组成。
在一些实施方案中，本发明的在SEQ ID NO:l的A122, D125, T167, F197， T209, A211， K240, A242, S281, Q289， A294和N303位置包括氨基酸 替代的变体进一步包含具有与SEQ ID NO: 1所示的野生型植酸酶的34 -446位氨基酸残基至少有90%，至少92%,至少93%，至少94%和至少 95%的序列同一性的植酸酶。
在一些实施方案中，本发明的变体除包括对应于SEQ ID NO: 1的 A122， D125， T167， F197， T209, A211, K240, A242, S281， Q289， A294和 N303位置的替代外，还包括一个或更多个对应于59， 70， 193， 204， 221， 223， 225， 268， 336和351氨基酸残基的替代。在一些实施方案中，变体包括对 应于SEQ ID NO:l的K59E, N70Y， H193R, T204I, S221N， D223E， G225A, A268V, I336F和N351D的替代。
在一些实施方案中，本发明的变体包括功能性片段。功能性片段是指 仍能保留其酶功能的布丘氏菌属菌植酸酶的一部分，优选的是与它来源的 植酸酶多肽相比，所述片段保持基本上等量的酶功能或更高量的酶功能。 在一些实施方案中，变体为这样的片段，其包括对应于SEQ ID NO:l的 A122, D125, T167， F197， T209, A211, K240， A242, S281， Q289， A294和 N303位置的替代和SEQIDNO:1的至少350个，至少375个，至少400个 氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体(例如SEQ ID NO:3)可以 是具有至少350个，至少375个或至少400个氨基酸残基的片段。
变体可以由编码植酸酶蛋白质的DNA的核苷酸随机诱变、位点饱和 诱变、和定点诱变产生，使用盒或PCR诱变或其他本领域已知的技术产生 变体，之后变体在细胞培养物中产生。参考Morinaga等人(1984) Biotechnology 2: 646-649; Nelson和Long(1989) Analytical Biochem.， 180:147-151;以及Sarkar和Sommer(1990) Biotechniques 8: 404-407。植 酸酶变体蛋白质片段也可以通过已建立的技术由体外合成制备。
多核苷酸本发明还包含编码本发明的植酸酶变体的多核苷酸。本领域技术人员 知道，因为遗传密码的简并性，核苷酸序列可以由三密码子使用产生，由 最初的序列编码的一些氨基^生改变从而产生不同的核酸序列但其仍编 码和最初的核苷酸序列所编码的相同的植酸酶。例如，具有对所有的三核
苷酸密码子在第三个位置的改变的核苷酸序列大约与原始序列有66%的 同一性，然而，改变的核苷^f列可以编码相同的植酸酶(例如具有相同 的一级氨基酸序列)。
多核苷酸可以由本领域已知的标准方法获得，例如，克隆的DNA(例 如DNA文库)、通过化学合成、通过cDNA克隆、通过PCR( USP 4,683,202 或Saiki等人(1988) 239:487-491 )、通过合成建立的方法(Beucage等人(1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869，以及Matthes等人(1984) EMBO J. 3:801 -895 )或通过基因组DNA或其片段的克隆、从目的细胞中大量纯化， 例如布丘氏菌属菌(参见，例如，Sambrook等人，2001， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover， DM and Hames， BD(Eds.)， 1995， DNA Cloning 1 : A Practical Approach and DNA Cloning 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford )。从基因组DNA和其乎汁生物 中衍生的核酸序列除编码区域外还可以包含调控区域。
19表l: BP-WT的多核苷餅列
TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTT
CTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAA
TGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTG
TTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAA
CGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCC
GCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTA
ACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCC
ACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGT
TTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCA
ATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGC
TTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGC
AGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACC
TGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCA
AACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA
TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGC
GCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGAT
AAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGT
CTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAA
GCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAA
ACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCA
GACATAACGGCACGCCTTTATTGCAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCG
AATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCT
GTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCA
ACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGC
GCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAG
CGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCAC
TTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGT
AACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGT
GGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACA
AAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCC
AGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTT (SEQ ID NO:5)
可以理解的是，WO 2006/043178提供的多核苷酸序列(SEQ ID NO:l 和SEQ ID NO:2)可以用于自编码具有植酸酶活性的酶的其他菌林获得相同的或同源的多核苷酸片段。包含来自布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶基因 (BP-WT)的多核苷麟列(SEQIDNO:5)，如下述表l中所例举。包含 来自BP-n变体的植酸酶基因的多核苷酸序列(SEQIDNO: 14)在下述表2 中显示。
表2: BP-17的多核苷,列
CGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCCCCAACA CCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTC ATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAG CCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCTACGTCTGGACTGACGTCGCCCAGC GCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTC
GGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGG CCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCAGCCTCGCCCTCATG AACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGCCGACAA GAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACAACGGCA
CTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATCCCTCAGGCCGCCTGGGGCAACATCCACAGCGA GCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCTACTTCGACCTCATGGAGC GCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCAGCAAC GCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGACAACAA GATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCATGCTCA ACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCTGGCGGCGCTCTC GTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAGTACGTCAGCGTCAGCATGGT CTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAGCCTG CCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGGCTAC TGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTGCCA GCTCCAGTAA (SEQIDNO:14)
特性
在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体具有改变的特性。优选的本 发明的变体具有改进的特性。在一些实施方案中，改变的特性，例如改进 的特性是底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性曲线、比活性和/或 从植酸中释放砩酸基团的活性。在一些实施方案中，本发明包含的变体相比于亲本植酸酶(例如，
BP-WT或BP-11)具有增加的热稳定性。在一些实施方案中，变体具有相 比于BP-WT或BP-ll至少1.5，至少2.0,至少2.5，至少3.0，至少5.0，至 少8.0，至少10.0，至少15.0，至少18.0和至少20.0的热稳定性差别(TD)。
在一些实施方案中，本发明包含的变体(例如BP-17)具有在pH为4.5， 5.0， 5.5或6.0时至少3°C，至少5。C，至少l(TC，至少12。C，至少15。C和至少 20。C的增加的热稳定性。更具体地，本发明的变体(例如BP-17)在大约65°C， 在约7(TC，在约75。C，在约8(TC或更高时是热稳定的。在一些实施方案中， 如果本发明的植酸酶在pH5.5暴露于特定的温度10分钟保持大于50%的 活性，则认为本发明的植酸酶是热稳定的。
在一些实施方案中，变体具有更高的蛋白水解稳定性(残留活性)。 蛋白水解稳定性可以由WO 2006/043178 7>开的方法，并具体参照其中的 实施例12来确定。在一些实施方案中，本发明包含的变体具有至少45%， 至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%和至少85%的残留 活性。
在一些实施方案中，本发明包含的变体具有在pH4.0，在pH4.5和在 pH 5.0时，大于亲本植酸酶或其热稳定的变体(例如BP-WT， SEQ ID NO:2 或BP-ll) 100%,大于105%,大于110%,和大于120%的比活性。在一 些实施方案中，变体具有比BP-ll植酸酶或BP-WT(SEQ ID NO:2)植酸酶 高至少5%，至少10%，至少15%,至少20%,和至少25。/。的比活性。在 一些实施方案中，本发明包含的变体保持与BP-WT或BP-ll基本上相同 水平的热稳定性，但在基本上相同的条件下(例如pH)具有增加的比活性。
在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体具有至少100 U/mg、至少200 U/mg、至少300U/mg、至少350U/mg，、至少400U/mg、至少450 U/mg、 至少500U/mg、至少600 U/mg、至少700 U/mg、至少800 U/mg、至少 900U/mg、至少1000U/mg、和至少1200 U/mg比活性，比活性是由 WO2006/043178实施例1描述的条件下测定的，将植酸酶置于溶液中孵育， 所述溶液包含2mM植酸酶、0.8 mMCaCl2的pH为3.5的200 mM乙酸钠緩冲液中。在一些实施方案中，酶比活性在最适pH4.0处测定。
在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体与SEQIDNO:5所编码的植 酸酶相比时，具有至少110，至少120和至少130的比活性比率。
在一些实施方案中，pH活性最大值比相应的布丘氏菌属菌植酸酶(如 SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2)低至少0.1,至少0.15,至少0.2，至少0.25， 至少0.3,至少0.5,至少0.6，至少0.7，至少0.8，和至少1.0个pH单位， 或比BP-ll植酸酶低至少O.l，至少0.15，至少0.2，至少0.25，至少0.3， 至少0.5，至少0.6，至少0.7，至少0.8，和至少l,O个pH单位。在一些实 施方案中，本发明包含的变体在pH2.0到6.0范围内具有活性，在一些实 施方案中pH 4.0至pH 5.5附近和4.0至pH 4.5附近有最大活性。
在一些实施方案中，本发明包含的变体可以用于产生磷酸酯/磷酸盐 化合物的方法中，包括用本发明包含的植酸酶变体(如BP-17 )处理植酸。 植酸可以是肌醇二、三、四、和/或五磷酸。另一些合适的有机磷酸酯包括 肌醇四磷酸酯和肌醇-寡磷酸酯。
在宿主细胞中生产植酸酶
在一些实施方案中，本发明提供具有植酸酶活性的酶的产生方法，包 括(a)提供用包含编码本发明的植酸酶变体的多核苷酸的表达载体转化了 的宿主细胞，其中所述变体包含至少文中所述的至少一个氨基酸残基的至 少一个修饰；(b)在适合宿主细胞产生植酸酶的条件下培养经转化的宿主细 胞；和(c)回收植酸酶。
在一些实施方案中，表达载体包含编码这样的植酸酶的多核苷酸，所 述植酸酶包含在对应于SEQ ID NO:l的A122, D125， T167， F197, T209, A211， K240, A242, S281, Q289, A294和N303的位置具有氨基酸残基替代 的氨基酸序歹"在另一些实施方案中，替代对应于SEQ ID NO: 1的A122T， D125A， T167I, F197S， T209K， A211P， K240E, A242S， S281L， Q289Y， A294E和N303K。在一些实施方案中，表达载体包含编码这样的植酸酶变 体的多核苷酸，所述的植酸酶变体包含在对应于SEQ ID NO:4的R24， R28， T31， K32， D98， R100, K137， N212， G221, T225, E228， E249， H259， F263,M266，N276，H312，D313，T314，和/或D334位置的替代。在另一些实施方 案中，载体包括编码包含SEQ ID NO: 3的植酸酶的多核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，宿主菌林经过遗传工程设计来表达异源 的植酸酶或具有本发明的植酸酶活性的变体。
宿主细胞
本发明包含的用于产生植酸酶的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞和 植物细胞。宿主细胞包括细胞和细胞后代和由用于产生本发明的植酸酶变 体的细胞制备的原生质体。
在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞和优选地是丝状真菌宿主细 胞。术语"丝状真菌"是指真菌亚门的所有丝状形式的真菌(参见， Alexopoulos， C. J.(1962)， INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley， New York)。这些真菌的特点在于，具有包含壳多糖、纤维素、和其他复杂多 糖的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌是形态学上的、生理学上的、 和遗传上不同于酵母的。丝状真菌亲本细胞可以是这样的细胞，包括但不 限于木霉属中的种(Trichoderma sp.),(如，里氏木霉(Trichoderma reesei )， 红褐肉座菌(Hypocrea jecorina )的无性形态，以前分类为长枝木霉(T. longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康宁木霉(Trichoderma koningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum));青霉属中的种(Pencillium sp.)，腐质霉属中的种(Humicola sp.)(如，特异腐质霉(H. insolens)，面包腐 质霉(H. lanuginosa)和灰腐质霉(H. grisea));金孢子菌属中的种 (Chrysosporium sp.)(如，C. lucknowense)，粘帚霉属中的种(Gliocladium sp.)，曲霉属中的种(如，米曲霉(A. oryzae)，黑曲霉(A. niger)，酱油曲霉(A. sojae)，日本曲霉(A. japonicus)，构巢曲霉(A. nidulans)，和泡盛曲霉(A. awamori)),镰孢属中的种(Fusarium sp.)，(如，粉红镰孢(F. roseum)，禾谷 嫌孑包(F.graminum)， F. cerealis，尖錄抱(F. oxysporium)和F. venenatum)， 脉孢菌属中的种(Neurosporasp.)，(粗糙脉孢菌(N. crassa))，肉座菌属中 的种(Hypocrea sp.)，毛霉菌属中的种(Mucor sp.)(米赫毛霉(M. miehei))， 根霉属中的种(Rhizopus sp.)和翅孢霉属中的种(Emericdla sp.)(也参见，Innis等(1985) Sci. 228:21-26)。应用于表达本发明的植酸酶(和/或a淀粉 酶)的曲霉菌林公开于如Ward等人(1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743;和Goedegebuur等人(2002) Curr Gene 41 :89 - 98。在一些实 施方案中，宿主是木霉属的菌林，优选是里氏木霉的菌林。里氏木霉的菌 林是已知的并且非限制性的例子包括如ATCC No. 13631， ATCC No. 26921， ATCC No. 56764， ATCC No. 56765， ATCC No, 56767和NRRL 15709。在一些实施方案中，宿主菌林是RL-P37的衍生菌林。RL-P37公 开于Sheir-Neiss等人(1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46 - 53。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。非限制性的例 子包括链霉菌属的菌林(如变铅青链霉菌(S.lividans)，天蓝色链霉菌(S. coelicolor)和灰色链霉菌(S. griseus ))和芽孢杆菌属的菌林。在本发明 中使用的芽孢杆菌属包括本领域已知的芽孢杆菌属的所有种，包括但不限 于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)，地衣芽孢杆菌(B. licheniformis )，迟緩芽 孢杆菌(B. lentus)，短芽孢杆菌(B. brevis )，嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus )，嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus )，解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens)，克劳氏芽孢杆菌(B. clausii),耐碱芽孢杆菌(B. halodurans)，巨大芽孢杆菌(B. megaterium )，凝结芽孢杆菌(B. coagulans)，环状芽孢杆菌(B. circulans )，杣烂芽孢杆菌(B. lautus )和 苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis )。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌或寸艮 单胞菌属中的种(Pseudomonas sp.)。
在其它实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，例如酵母属 (Saccharomyces )， 裂殖酵母属中的种(Schizosaccharomyces sp )，毕赤 酵母属中的种(Pichiasp.),或假丝酵母属中的种(Candida sp)。
在一些实施方案中，宿主菌林可以是之前经过基因工程处理的。在一 些实施方案中，已经失活了真菌宿主细胞的多个天然基因。这些基因包括 例如编码纤维素水解酶如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶 (CBH)的基因(如cbhl， cbh2， egll， egl2和egl3)。例如美国专利号5，650，322公开了 RL-P37的在cbhl基因和cbh2基因中有删除的衍生菌林。(参见， 例如USP 5,847,276和WO 05/001036)
在其他实施方案中，宿主细胞可以是植物细胞，并且本发明应用于双 子叶植物(例如，番茄、马铃薯、大豆、棉花、和烟草)和单子叶植物， 包括但不限于禾本科单子叶植物如小麦(Triticum spp,)、稻(Oryza spp.)、 大麦(Hordeum spp.)、 燕麦(Avenct spp.)、 黑麦(Secale spp.)、 玉米(Zea mays)、 高粱(Sorghum spp.)和小米(Pennisetum spp)。
载体
适用的载体包括这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含编码本发 明植酸酶的多核苷酸，并且宿主细胞转化方法是本领域已知的，可以使用 标准的纟支术和方法。
根据本发明，构建包含编码本发明的植酸酶变体的核酸的DNA构建 体以转化和/或在宿主细胞中表达变体。在一个实施方案中，DNA构建体 通过包含有效连接于植酸酶变体编码序列的调控序列(如启动子、核糖体 结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列、增强子、 激活序列、细胞特异性表达序列、信号序列、和/或终止子)的表达载体转 移至宿主细胞。
包含具有编码植酸酶变体的多核苷酸的DNA构建体的表达载体可以 是任意载体，能够在给定的真菌宿主生物体中自主复制或能够整合入宿主 DNA。在一些实施方案中，表达载体是质粒或噬菌体。在一些实施方案中， 表达载体是预组装的并且包含高水平转录所需的序列和选择性标记。在一 些实施方案中，将植酸酶变体基因的编码区或其部分插入通常目的的表达 载体，从而在表达构建体启动子和终止子序列的转录调控之下。在一些实 施方案中，基因或其部分插入cbhl强启动子下游。
简而言之，在真菌宿主细胞中产生植酸酶可以参考Sambrook等(1989) 见上文，A腳bel(1987)见上文，van den Hondel等(1991)，在Bennett和 Lasure(编著)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press(1991) pp. 70-76和396-428; Nunberg等(1984) Mol. Cell Biol.4:2306画2315; Boel等(1984) EMBO J. 3: 1581-1585; Finkelstein ，在 BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein等编著， Butterworth画Heinemann，波士顿，MA(1992)，第6章；Kinghorn等(1992)
APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall,伦敦；Kelley等 (1985) EMBO J. 4:475画479; Penttila等(1987) Gene 61 :155國164;和美国专 利号5,874,276。适合的载体列表可以在Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC， www at fgsc.net)中找到。适合的载体包括可获 得于例如Invitrogen Life Technologies和Promega的载体。适合在真菌宿 主细胞中应用的特定载体包括载体例如pFB6， pBR322， pUC18， pUC100， pDONTM201， pDONRTM221， pENTRTM， pGEM 3Z和pGEM 4Z。
在一些实施方案中，栽体可以是当导入真菌宿主细胞时整合入宿主细 胞基因组中和复制的任意载体。Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC， 〈www.fgsc.net〉)提供了这类载体的一些非限制性例子。 Sambrook等(1989)见上文，Ausubel(1987)见上文，van den Hondel等 (1991)在Bennett和Lasure(编著)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI， Academic Press pp. 396-428;和美国专利号5,874,276提供了另外 一些适合的表达载体和/或整合载体的例子。特别有用的载体包括pTREX， pFB6， pBR322， PUC 18， pUC100和pENTR/D。用于细菌细胞中的适合的 质粒包括能在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19,和例如允许在芽孢杆 菌中复制的pE194。
在一些实施方案中，编码本发明的植酸酶变体的核酸有效连接至适合 的启动子，该启动子在宿主细胞中显示转录活性。 一般而言，植酸酶变体 的表达可在任意本领域已知的或随后发现的适合的启动子下完成。在一些 实施方案中，植酸酶变体在宿主天然的启动子下表达。在一些实施方案中， 植酸酶变体在异源启动子下表达，该启动子在宿主细胞中有活性。例如， 如果木霉属细胞用于作为宿主细胞，优选地，启动子是在木霉属宿主细胞 中有活性的。
27在一些实施方案中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。"组成型 启动子"是在多数环境的和发育的条件下有活性的。"诱导型"或"可抑制型，， 启动子是在环境的或发育的调节下有活性。在一些实施方案中，启动子是 随环境因子的改变可诱导的或可抑制的，环境因子包括但不限于碳、氮或
其他营养因子的可荻得性、温度、pH、渗透性、重金属的存在，抑制剂的 浓度、应激或上述因素的组合，这一点为本领域所知。在一些实施方案中， 诱导型或可抑制型启动子可以由代谢因子诱导或抑制，例如某些碳源的水 平、某些能源的水平、某些代谢物的水平或上述因素的组合，这一点为本 领域所知。在一个实施方案中，启动子是对于宿主细胞来说是天然的启动 子，例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是里氏木霉天然的启动子，例如 cbhl启动子，GenBank登录号为D86235。
启动子的合适的非限制性例子包4舌cbhl， cbh2， egll， egl2， egl3， egl4， egl5， xynl和xyn2，产黄青霉(P. chrysogenus )的可抑制的酸性磷酸酶基 因(phoA)的启动子(参见如Graessle等(1997) Appl. Environ. Microbiol, 63:753-756)、葡萄糖可抑制的PCK1启动子(参见如，Leuker等(1997)， Gene， 192:235-240)，麦芽糖可诱导的，葡萄糖可抑制的MET3启动子(参 见Liu等(2006)，Eukary. Cell, 5:638-649)、 pKi启动子和cpcl启动子。有 用的启动子的其它例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动 子(参见如Nunberg等(1984) Mol. Cell Biol. 4:2306画2315;和Boel等(1984) EMBO J. 3:1581-1585 )。里氏木霉xlnl基因的启动子也是有用的(参见 如EPA 137280Al)。
在一些实施方案中，启动子是温度敏感的启动子。优选地，温度敏感 的启动子的活性净皮升高的温度抑制。在一些实施方案中，启动子是代谢物 抑制的启动子或^皮渗透性的改变而抑制的启动子。在一些实施方案中，启 动子是可由培养基中存在的多糖、二糖、或单糖的水平诱导的或抑制的。
在一些实施方案中，编码植酸酶变体的序列有效地连接至信号序列。 信号序列不是本发明中重要的，但可以是任意在宿主细胞中有信号序列活 性的信号序列。编码信号序列的DNA可以是与宿主细胞、启动子、或植酸酶天然相关的5在一些实施方案中，信号序列是与待表达的植酸酶变体 的基因天然相关的。在另一些实施方案中，包含在待转入真菌宿主细胞的
DNA构建体或载体中的信号序列和启动子序列衍生自相同来源。例如，在 一些实施方案中，信号序列是cbhl信号序列，该信号序列有效连接至cbhl 启动子。
在一些实施方案中，表达载体也包括在结构基因下游的转录终止序列 以提供高效终止。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列是来源相同 的。在另一些实施方案中，终止序列和宿主细胞是同源的。 一个尤其适合 的终止子序列是衍生自木霉属菌抹的cbhl、更具体的是衍生自里氏木霉的 cbhl的终止子序列。其他有用的真菌终止子包括来源于黑曲霉或泡盛曲霉 的葡糖淀粉酶基因的终止子(参见如Nunberg等(1984)见上文，和Boe 等(1984)见上文)。
在一些实施方案中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的 例子包括赋予抗微生物抗性的标记(如潮霉素和腐草霉素)。也可用于本 发明的营养选择性标记包括本领域已知的那些标记，例如amdS argB和 pyr4。用于转化木霉的载体系统的标记是本领域已知的(参见如， Finkelstein,在BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，第6 章，Finkelstein等编著，Butterworth-Heinemann，波士顿，MA(1992)，第 6章；和Kinghorn等(1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF
FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall,伦敦)。在一些实施方案中，选择性标记是amdS基因，该基因 编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉 amdS基因作为选择性标记的使用在例如Kelley等(198S) EMBO J. 4:475 -479和Penttila等(1987) Gene 61 :155-164中描述。
用于连接包含编码植酸酶变体的多核苷酸、启动子、终止子和其他序 列的DNA构建体和将它们插入合适的载体的方法是本领域已知的。连接 通常可以通过在方^^的限制性位点处的连接而完成。如果这样的位点不存 在，根据常规实验使用合成的寡核苷酸接头(参见如Sambrook(1989)见上文；以及Bennett和Lasure， MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego(1991) pp70-76 )。另外，可以应用已 知的重组技术构建载体 (Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)。
转化、表达和培养宿主细胞
将DNA构建体或载体导入宿主细胞包括如下技术，如转化；电穿孔； 核显微注射；转导；转染(如脂转染介导的转染和DEAE-葡聚糖介导的转 染)；与磷酸钙孵育；DNA沉淀；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生 质体融合。
用于曲霉属和木霉属的转化方法在如Yelton等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474; Berka等(1991),在Applications of Enzyme Biotechnology—书中，Kelly和Baldwin编辑，Plenum Press(NY); Cao等 (2000) Sci. 9:991-1001; Campbell等(1989) Curr. Genet. 16:53-56; Pentilla 等(1987) Gene 61 :155-164); de Groot等(1998) Nat. Biotechnol. 16:839-842; USP 6,022,725; USP 6，268，328和EP 238 023中描述。在木霉属中表达异源 蛋白在USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki等(1991); Enzyme Microb. Technol 13:227-233; Harkki等(1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215，594;和Nevalainen等"The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes",在MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Leong和Berka 编著，Marcel Dekker Inc., NY(1992) pp. 129-148)中描述。转化镰孢属菌林 可以参考WO96/00787和Bajar等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8202-28212。
用于转化植物的DNA构建体的构建方法和植物转化方法是已知的。 这些方法的一些例子包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导 的基因转化、樹A立轰击，PEG介导的原生质体转化、电穿孔等。可参考例 如USP 5,780,708; USP 6,803,499; USP 6,777,589; Fromm等人(1990) Biotechnol. 8:833画839; Potrykus等(1985) Mol Gen. Genet. 199:169-177;Brisson等(1984) Nature 310:511-514; Takamatsu等(1987) EMBO J 6:307-311 ; Coruzzi等(1984) EMBO J 3: 1671-1680; Broglie等(1984) Science 224:838-843; Winter J和Sinibaldi RM(1991) Results Probl Cell Differ 17:85-105; Hobbs S或Murry LE(1992)， McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N. Y.， ppl91-196;以及 Weissbach 和 Weissbach(1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, N. Y.， pp 421-463。转化的细胞可以在适当条件 下用标准技术摇瓶培养、在实验室发酵罐中小规模发酵或在工业发酵罐中 大规模发酵(包括连续、分批和补料分批发酵)，并用包含生理盐类和营 养物的合适培养基(参见如Pourquie， J.等，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, Aubert， J. P.等编著， Academic Press, pp.71-86， 1988;和Ilmen， M.等，(1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306)。常见的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽 提取物(YM)培养基，Luria Bertani(LB)培养基和沙氏葡萄糖(SD)培养基)
可用于本发明。丝状真菌细胞优选的培养条件是本领域已知的，并且可以 参考科学文献和/或来源于如美国典型培养物保藏中心和真菌遗传学原种
中心(Fungal Genetics Stock Center )的真菌资源。
在一些实施方案中，构建了具有载体系统的遗传上稳定的转化体，其 中编码植酸酶变体的核酸稳定地整合入宿主菌的染色体中。然后用已知的 技术纯化转化体。
在一个非限制性的例子中，包括amdS标记的稳定的转化体与不稳定
环状的光滑菌落克隆而不是粗糙的外形。另外，在某些情况下做了更进一 步的稳定性实验，在非选择性固体培养基(即，无乙酰胺的培养基)上生 长转化体，从这种培养基收集孢子并测定这些孢子中随后可发育并生长在 含有乙酰胺的选择性培养基上的孢子的比率。备选地，其他已知的方法可 以用于选择转化体。
在一个具体实施方案中，木霉属转化的制备涉及制备来自真菌菌丝体的原生质体。(参见，Campbell等，(1989) Curr. Genet. 16:53-56 )。在
一些实施方案中，菌丝体获得自萌发的营养孢子。菌丝体用消化细胞壁而 产生原生质体的酶来处理。原生质体然后通过悬浮培养基中存在的渗透稳 定剂得到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通 常这些稳定剂的浓度在0.8 M到1.2 M之间变化。优选的是在悬浮培养基 中使用浓度大约为1.2M的山梨醇溶液。
在建立了真菌的生长后，使转化体细胞暴露于能有效引起或允许表达 本文中定义的植酸酶变体的条件。在编码植酸酶变体的序列位于诱导型启 动子控制下的情况时，诱导剂(如，糖、金属盐或抗微生物剂)以能有效 地诱导表达的浓度加入培养基中。
植酸酶表达/活性的测定法
为了评价具有植酸酶活性的植酸酶变体被本发明的编码具有植酸酶活 性的植酸酶变体的异源多核苷酸转化的细胞系的表达，可以在蛋白质水平、 RNA水平进行测定或通过使用特定的植酸酶活性和/或产生的功能性生物 测定法。通常，所使用的测定法包括RNA印迹、斑点印迹(DNA或RNA 分析)、RT-PCR (逆转录酶聚合酶链反应)、或用适当的探针标记(基 于核酸编码序列)的原位杂交和常规的DNA印迹和放射自显影术。
另夕卜，具有植酸酶活性的植酸酶变体的产生和/或表达可以在样品中直 接测量，例如，通过无机磷酸盐的释放直接测量植酸酶活性(FTU)的测定 法。无机磷酸盐和酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色复合体，黄色复合体在 分光光度计中于415 nm波长处测定，并且释放的无机磷酸盐由磷酸盐标 准曲线定量。 一个单位植酸酶(FTU)是按欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)给出的反应条件下每分钟从植酸释放1微 摩尔无机磷酸盐所用酶的量。
另外，基因表达可以由免疫学的方法评价，例如细胞、组织切片的免 疫組织化学染色或组织培养基的免疫测定法，例如，通过蛋白质印迹或 ELISA。这些免疫测定法可以用于定性和定量评价植酸酶的表达。这些方 法的详细内容是本领域技术人员已知的，并且用于这些方法的许多试剂是
32商业上可得到的。
植酸酶活性的测定法是本领域已知的， 一个例子是由Fiske和 SubbaRow， Journal of Biological Chemistry 66:375-392(1925)开发的释i文 无机磷酸盐的经典测定法。Mitchell等Microbiol. 143:245-252(1997)建立 了这个方法的变化的方法。FOOD CHEMICALS CODEX，第4版， Committee on Food Chemicals Codex, Institute of Medicine, National Academy Press, Washington, DC， 1996， 809-810页描述了备选方法。这些 参考文献均掺入本发明。在许多这些测定法中，随后使用分光光度计进行 比色，并与无机磷酸盐的浓度已知的对照(Pi)相比较和/或与通过用具有已 知植酸酶活性的酶反应产生的对照相比较。将一单位活性确定为在定义的 反应条件下每分钟从植酸释放1 jimol &所需酶样品的量。也可以参考USP 6,221,644和USP 6，139，902。
在本发明的一些实施方案中，由木霉属或曲霉属宿主表达的具有植酸 酶活性的植酸酶变体在每升培养基中具有大于1克蛋白每升(g/L),大于2 g/L，大于5 g/L,大于10 g/L，大于20 g/L，大于25 g/L，大于30 g/L，大于 50 g/L和大于100 g/L。
蛋白回收
离，并且可以用按照本领域已经建立的多种方法大量纯化。本领域技术人 员能够选择最适当的分离和纯化技术。本发明的植酸酶可以从培养基或宿 主细胞裂解物中回收。如果蛋白是膜结合的，通过使用适合的去污剂溶液 (如Triton-X IOO)或通过酶裂解将蛋白从膜释放出来。表达植酸酶所用的细 胞可以通过各种物理的或化学的方法破坏，例如冻融循环、超声处理、机 械破碎、或细胞裂解剂。期望从重组细胞蛋白或多肽纯化植酸酶。下列方 法是适合的纯化方法的例子通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相 高压液相层析；二氧化硅色谱法或阳离子交换树脂色语法如DEAE;色谱 聚焦、SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；使用如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋 白A琼脂糖凝胶柱去除污染物；和金属螯合物柱结合植酸酶的表位标记形式。可以使用多种蛋白纯化方法，并且这些方法是本领域已知的，例如在
Deutscher， METHODS IN ENZYMOLOGY， 182(19卯)；Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag， New York(1982)中描述。选择的纯化步骤取决于如所使用 的生产工艺的本质和产生的植酸酶的特定形式。
一般而言，细胞培养产生的植酸酶变体(包括n-布丘氏菌属菌植酸酶 或r-布丘氏菌属菌植酸酶)分泌到培养基中并且可以纯化或分离，如通过 去除细胞培养基中不需要的成分。在一些情况下，植酸酶变体可以以细胞 的形式产生，使得从细胞裂解物中回收植酸酶变体成为必需。在这些情况 下，使用本领域常规的技术从产生植酸酶变体的细胞中纯化酶。例子包括 但不限于亲和层析(参见如Tilbeurgh等(1984) FEBS Lett. 16:215 );离子 交换色谱法(参见如Goyal等(1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess等(1983) Eur. J. Appl Microbiol Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai等(1984) J. Appl Biochem. 6:336;和Ellouz等(1987) Chromatography 396:307)，包括用高分 辨能力材料的离子交换(参见如，Medve等，(1998) J. Chromatography A 808: 153);疏水相互作用色镨(参见如，Tomaz和Qudroz(1999) J. Chromatography A 865: 123 ) ; 二相分配(参见如，Brumbauer等(1999) Bioseparation 7:287 );乙醇沉淀；反相高压液相层析；二氧化硅色谱法或 阳离子交换树脂色镨法如DEAE;色谱聚焦；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀； 和/或4吏用如Sephadex G-75的凝胶过滤。
发酵
在本发明的一些实施方案中，表达异源植酸酶变体的真菌细胞在分批 或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭的系统，在这个系统中， 培养基的组成是在发酵开始时设定的，并且在发酵过程中不受到人为的修 改。因此，在发酵开始时用目的生物体接种培养基。在这种方法中，允许 发酵在不向系统中添加任何成分地进行。 一般，分批发酵称为"分批"在于 碳源加入，和经常尝试控制pH和氧浓度等因素。分批发酵系统的代谢物 和生物量组分不断的发生变化直到发酵结束时。在分批培养中，细胞经历延滞期到高生长对数期的过程，并且最终到稳定期，在稳定期生长速率减 小或停止。如果不进行处理，在稳定期的细胞最后会死亡。通常的，在对 数生长期的细胞进行大量终产物的生产。
标准分批系统的变化形式是"补料分批发酵"系统，该系统也可用于 本发明。在这种典型分批系统的变化形式中，在发酵过程中以增量加入底
量的底物时补料分批系统是有用的。测量补料分批系统中真实的底物浓度
是困难的，因此基于对如pH、溶解氧和如C02的废气的分压这些可测量 因素的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵是常用的和本领域熟知的。
连续发酵是开放的系统，在这个系统中，将确定的发酵培养基连续的 加入到生物反应器中，并且相等量的条件培养基同时被移出用于处理。连 续发酵通常使培养物保持衡定高密度并且细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物物浓度的一个因子或任 何数量的因子。例如，在一个实施方案中，限制性营养成分如碳源或氮源 维持在固定的比率，所有其他参数允许调节。在其他系统中，许多影响生 长的因子可以连续的变化，而通过测量培养基混浊度将细胞浓度保持衡量。 连续发酵系统力争保持稳态生长条件。因此，在发酵中由于取出培养基而 引起的细胞损失必须和细胞生长速率相平衡。调节连续发酵过程的营养和 生长因子的方法以及产物形成率最大化的技术是工业微生物领域熟知的。
应用和^f吏用的方法
在本发明的一个实施方案中，提供了包含本发明的至少一种植酸酶的 酶组合物。本发明的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可以是 液体或干的组合物形式。
液体组合物只需要包含植酸酶，可以是基本上纯的或不纯的形式，优 选的是基本上纯的形式。然而，通常地也加入稳定剂如甘油、山梨醇或单 体丙二醇。液体组合物也可以包含一种或多种其他添加剂，如盐类、糖类、 防腐剂、pH调节剂(即，緩沖剂)、蛋白质、或植酸(植酸酶底物)。典 型的液体组合物是含水的或基于油的浆液。干的组合物可以是喷雾干燥组合物，在这种情况下，干燥组合物仅需 要包含干的形式的酶。然而，通常地，干的组合物也是所谓的颗粒，可以 容易的与例如食物或饲料成分混合，或者更优选的形成预混合物的组分。 酶颗粒的大小优选的是与混合物中的其他组分一致。
在一些实施方案中，包括本发明的植酸酶变体的酶组合物可以任选地
用于与任一以下酶或以下酶的组合进行组合葡糖淀粉酶、a淀粉酶、蛋 白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊 精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶(cutinase)、 其他植酸酶、和它们的组合。
在一些实施方案中，植酸酶组合物是食物或动物饲料组合物。食物或 动物饲料组合物可以包含浓度为10到15,000 U/kg饲料或食物(例如，100 到5,000 U/kg， 200到2,000 U/kg，和500 -1000 U /kg)的植酸酶。植酸酶 组合物可以用作在牲畜例如家禽和猪以及包括鱼和奸在内的水生养殖动物 的消化道中有活性的添加剂。本发明考虑了产生食物或动物饲料的方法， 特征是将本发明的植酸酶与所述食物或动物饲料混合。液体组合物可以在 其任选的粒化过程后添加到食物或饲料中。
在一些实施方案中，动物饲料包含一种或多种下述组分a)谷类，例 如小粒谷物(如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和其组合)和/或大粒谷物如玉 米或高粱；b)谷类的副产品，如谷物蛋白质粉、可溶性干酒糟(Distillers Dried Grain Solubles; DDGS)、麦*夫、小麦次粉(wheat middlings )、次 小麦粉(wheat shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈核、和柑橘果肉；c) 获得自如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、芸苔、鱼粉、 干燥的血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻来源的 蛋白；d)获得自蔬菜和动物源的油和脂肪；e)矿物质和维生素；f)添加剂， 如酶、甜菜碱、香料、香精油、抗生素生长促进物质、抑球虫剂、益生菌 剂和益生素。
也提供了减少动物粪中磷水平的方法，特征在于给动物喂饲本发明的 动物饲料，在所述动物饲料中含有的植酸酶的量为有效转化植酸的量。更进一步，本发明包含的植酸酶组合物可以用于淀粉水解的方法。植 酸酶组合物可以在淀粉液化步骤、糖化步骤和/或发酵步骤期间添加。在使 用减少的植物材料例如碾碎的谷类作为给料的工业淀粉水解工艺中(如在
酿造和烘焙中)a-淀粉酶用于分解淀粉1-4连接键。淀粉酶是分解淀粉所 必须的，并且获得足够的这些酶的活性有时是有问题的。 一段时间以来人 们已知植酸具有对淀粉酶的抑制作用。因此包含本发明所述的植酸酶的酶 组合物可以用于淀粉水解工艺来减少植酸对a-淀粉酶的抑制作用(EP 0 813607B)。
发现植酸酶、植酸和较低磷酸的植酸衍生物有许多其他用途，用于个 人护理产品、医药产品、以及食物和营养产品，还有多种工业应用，尤其 在清洁、织物、平板印刷和化学领域中。
提供了以下实施例仅为了阐明目的，并不是以任何方式用于限制本发 明的保护范围。
实验
缩写
在下文公开的内容和实验部分应用了以下缩写。。C( 氏度)；rpm(每 分钟转数)；1120(水)；dH20(去离子水)；(111120(去离子水，Milli-Q过滤)；aa 或AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g或gm(克); Hg(微克)；mg(毫克)；nL(微升);ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(微米); M(摩尔)；mM(毫摩尔)；jiM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量); sec(s)或s(s)(秒)；min(s)或m(s)(分钟)；hr(s)或h(s)(小时)；AMM溶液(7.5 N H2S04, 15 mM钼酸铵和丙酮(l:l:2)); ABS(吸光度)；EtOH(乙醇)；PPS(生 理盐溶液)；m/v(质量/体积);和MTP(樣i量滴定板)。
在以下提供的实施例中使用了以下测定法和方法
以下描述了用于提供变体的方法。然而值得注意的是，不同的方法可 以用于提供亲本分子的变体，并且本发明并不限于实施例中应用的方法。 可以预期的是，可以使用任何用于制造变体和选择变体的合适方法。布丘氏菌属P1-29菌株保藏于NCIMB，保藏号为41248。 WO 2006/043178描述了从植物材料中分离该菌林和其分类鉴定(参见，实施例 1-4)。另夕卜，WO 2006/043178也描述了染色体DNA的克隆和在大肠杆菌 中扩增和表达布丘氏菌属Pl-29菌林的植酸酶基因(参见，实施例5-6)。 WO 2006/043178中描述的布丘氏菌属P1-29菌林植酸酶在本文中也称为 BP-WT，并参考本文中的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2
植酸酶酶活性测定法
在两个緩沖系统中实施这些测定法。使用了 pH4.0到5.5的乙酸钠緩 冲液。用HCL滴定250 mM乙酸钠到指定的pH值制备所述緩沖液。用 HCL滴定250 mM甘氨酸到指定的pH值来制备pH 2，0到3.5的緩沖液。 在pH4.0的测定法用做标准。除緩沖液外，反应混合物还含有6mM植酸 和1.0 mM CaCl2和0.05 mg/ml BSA。反应允许在37。C进行1小时。使用 钼酸盐测定法来测量磷酸的释放，如Heinonen等(Heinonen， J. K.， Lahti， RJ.， Anal Biochem. 113(2)， 313-317 91981))描述的。简而言之，在每个孩吏量 滴定板孔中将200fU新鲜配制的AMM溶液加入到lOOfil反应混合物中。 在添加AMM试剂后不早于10分钟也不晚于30分钟内在3卯nm测量吸 光度。建立已知浓度的磷酸盐溶液的校正曲线来确定磷酸盐的量。使用 Vector NTI software(Invitrogen)根据蛋白质的氨基酸组分计算植酸酶变体 的比吸收值(A280)。
比活性测定法
在微量滴定板中使用酶联测定法来确定植酸酶活性酶制备物用稀释 緩沖液(50 mM乙酸钠緩冲液，0.05%普流尼克F-68， 1 mg/ml BSA)稀释。将 75^1植酸酶测定混合物(500 mM甘氨^/HCl， pH 4.0， 10.67 mM植酸，1 mM CaCl2， 0.05%(w/v)普流尼克F-68)加入到5^1酶溶液中。在37。C下 孵育待测溶液l小时。然后10jil待测溶液与40ftl检测混合物(lMTris/HCl， pH 7.0, 0.01%(v/v) Triton X-100, 25nM ADHP(MoBiTec， GOttingen，德 国)，0.25 u/ml麦芽糖磷酸化酶、0.3125 mM麦芽糖、1.5625 u/ml葡糖氧 化酶、0.3125 u/ml辣根过氧化物酶、1 mMEDTA，0.35mg/mlBSA)混合，
38并在37。C孵育1小时。在H20中加入30jil 2700 u/ml的过氧化氢酶终止反 应。使用535 nm作为激发波长在595nm处测量荧光。使用已知浓度的磷 酸盐溶液的校正曲线确定磷酸盐的量。
通过在A280nm处测定吸光度进行蛋白质测定。使用Gill和von Hippel(Anal. Biochem. 182:319-326(1989))的方法基于蛋白质的氨基酸组 分计算植酸酶变体的比吸收值(A280)。
热稳定性
变体的热稳定性以酶的失活温度表征。在不同温度反应10分钟并随后 降至室温后测量;f直酸酶的残留活性确定失活温度。失活温度是与在室温相 同条件下持续相同时间反应的残留活性相比较，残留活性是50%处的温 度。为了确定对应于50%残留活性的温度，根据需要对测量的活性数据进 行内推法(interpolation )和外推法计算。以。C表示的热稳定性差是将两酶 的失活温度彼此相减计算出的。
纯化BP-ll突变体
纯化如下进行使用添加了 20 mg/l新霉素的标准LB培养基，37。C 160 转/分钟摇瓶培养用编码BP-11的质粒转化了的枯草芽孢杆菌。在这个阶 段，培养基累积了显著量的植酸酶活性。将大约2L培养液调节到pH8.0， 滤过并上样至10 ml Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂(Qiagen)填充的柱。用50 mM Tris-HCl緩冲液，300 mM NaCl， pH 8.0洗柱子直到OD280降到0.05之下。 随后用相同的包含250 mM咪唑盐酸的緩冲液洗脱下结合的植酸酶。洗脱 物对50 mM pH 5.0的乙酸钠緩沖液透析并在4。C保存。然后将酶溶液上样 至用20 mM pH 5.0乙酸钠緩沖液平衡的Resource S柱，并且使用超过10 个柱体积的0-1M NaCl盐梯度进行洗脱。任选地，在4。C保存前用pH 5.0 的20 mM乙酸钠緩冲液透析洗脱物。
胃蛋白酶稳定性
此类变体的胃蛋白酶稳定性表征为与对照条件相比，胃蛋白酶孵育 后pH3.5 37。C测量的残留活性(残留活性=胃蛋白酶孵育后的活性/对照条 件下孵育后的活性)。在pH 2.0， 0.25 mg/ml胃蛋白酶，1 mM CaCh和5mg/ml BSA37。C 2小时进行胃蛋白酶孵育。对照条件是pH5.0, ImM CaCl2 和5mg/mlBSA，在37。C孵育2小时。
在下文的实施例中，除非有其他注释，植酸酶变体序列的氨基酸残基 按照BP-WT(SEQ ID NO: l)的序列编号。
实施例1.植酸酶变体的产生和鉴定
一般而言，4吏用如Morinaga等(Biotechnology(1984) 2， 646-649页)； Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)， 180， 147-151页)描迷的那些 方法;或WO 92/18645描述的误差阈i秀变(Error Threshold Mutagenesis ) 方案中公开的诱变方法，通过诱变SEQIDNO:5所示的核苷酸序列构建植 酸酶变体。Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl. 3(1994)， 136画140)公开了 另一合适的i秀变PCR的方法。
在一种或多种下述表达宿主大肠杆菌K12、枯草芽孢杆菌、酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae )中异源表达后表征了才直酸酶变体。植酸酶 变体是衍生自SEQIDNO:l,在一个或多个氨基酸位置处有差异，包括两 个位置、三个位置、四个位置、五个位置、六个位置、七个位置、八个位 置、九个位置、十个位置、十一个位置、十二个位置。根据需要进行反复 的诱变轮次。根据WO 2006/043178中描述的方案，在BP-WT中观察到多 种突变。 尤其是一个变体体 A122T/D125A/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/ A242S/S281L/Q289Y /A294E /N303K称为BP-ll，观察到具有超过BP-WT的增加的热稳定性(参 见，SEQ ID NO:4所示序列的7-419氨基酸残基，对应于SEQ ID NO:6 )。
实施例2. BP-ll的变体
三种不同的方案用于获得BP-ll的变体，包括随^L诱变、定向诱变和 4立点饱和i秀变。
A.按照WO 2006/043078中描述的用于获得BP-WT突变体如BP-ll 的教导进行随机诱变和高通量筛选。
用这种方法获得的BP-ll的一个具体变体称为BP-19。BP-19与BP-ll 不同，在对应于SEQ ID NO: 4的54(Y54H)， 84(S84G)， 190(S190G),220(I220V)和289(N289D)位置发生替代。
应用上文中描述的测定法测量比活性。确定了 BP-19在pH 4.0具有比 活性比BP-ll高出大于26%,表3给出了参考。
B. 在BP-WT骨架和BP-ll骨架上进行了三个特定残基的定向诱变， 对应于SEQ ID NO:4的G221S， T225M和N276R位置。突变体BP-15获 自BP-WT骨架，突变体BP-16获自BP-ll骨架。相对于亲本植酸酶的比 活性在表3中描述。
C. 基于变体BP-ll分子在多个位置进行了位点饱和诱变获得文库。位 置包括SEQ ID NO:4的R24， R28， T31， K32, D98， R100， K137, N212， G221 T225, E228， H259， F263， M266， N276, H312, D313, T314和D334。该文库 最初用高通量筛选出提高的活性，然后筛选出具有上文描述的比活性的一 些变体。所选择的变体更进一步纯化到约97%纯度并分析比活性。在位置 D98处突变的两个变体获得了提高的比活性(D98A和D98Q)。分离出具 有ala(A)代替asp(D)(D98A)的突变体并称为BP-17(参见，SEQ ID NO: 3)。 分离出具有gln(Q)代替asp(D)(D98Q)的突变体并称为BP-20。
包括BP-16， BP-17, BP-18, BP-19和BP-20在内的BP-ll的变体均按 上文所述测定植酸酶活性。
表3比活性(U/mg， pH 4.0， 97%酶纯度)
变体比活性 (U/mg )比活性 (BP-WT活性的。/。)比活性 (BP-ll活性的％ )
BP-WT ( P1-29 )936100142
BP-ll63270100
BP-1579085121
BP-1676074106
BP-171017109156
BP-181005107153
BP-1982288126
BP-2084093133实施例3-在大肠杆菌中表达BP-17
在大肠杆菌中表达的BP-17突变体的DNA序列经过了修饰，包括在 "6xHis标签"之后的编码野生型布丘氏菌属菌植酸酶信号序列的DNA序列 和对应于布丘氏菌属菌成熟植酸酶的突变体BP 17的编码序列。使用标准 基因工程方法，将这个核苷酸序列插入到大肠杆菌dps基因的启动子和也 来源于大肠杆菌的tufA基因转录终止子之间。
表达盒插入到大肠杆菌载体pCR 2丄(Invitrogen) Sacl和Apal限制性 位点之间产生质粒pCDP(SHOK)。表达栽体pCDP(SHOK)的结构如图2 所示。
pCDP(SHOK)转化的大肠杆菌菌林XL-Blue MRF，在37。C和200转/ 分钟使用添加了 50 mg/1卡那霉素的标准LB培养基在摇瓶中培养。在这 个阶段，培养基累积了显著量的植酸酶活性，该活性在转化了 pCR2.1的 受体菌抹并在相同培养基上培养时未检测到。大约2L这种肉汤培养基调 节到pH 8.0并上样至25ml Ni-NTA琼脂糖凝胶(Qiagen)填充的柱。用20 mM Tris-HCl緩沖液，pH 8.0洗柱子直到OD280降到0.05之下，随后用 相同的包含200mM咪唑盐酸的緩沖液洗脱下结合的植酸酶。洗脱物用20 mM乙酸钠緩沖液pH 5.5透析并保持在4。C或冻存在-20°C。重复冷冻-融化没有观察到活性的损失。
如下测量在大肠杆菌中表达的BP-17和野生型布丘氏菌属菌植酸酶 (BP-WT)的pH特征曲线。含有250 mM乙酸钠和7.5 mM植酸钠的溶液用 盐酸调节到pH 6， 5.5， 5， 4.5， 4.25, 4.0， 3.75， 3.5，用于构建在pH 3.5到pH 6.0范围的pH特征曲线。测量了在含有250mM甘氨酸和7.5 mM植酸钠 的并用盐酸调节到指定pH的底物溶液在pH值为3.0和2.5的酶的活性。 发现在大肠杆菌中产生的BP-17的pH特征曲线显著偏离了野生型布丘氏 菌属菌植酸酶的pH特征曲线(图3)。
氨酸-盐酸緩沖液中用不同浓度的胃蛋白酶在37。C处理2小时。孵育后，在pH5，5测定剩余的活性。如图4所示，BP-17基本上对胃蛋白酶稳定。 BP-17的高胃蛋白稳定性与野生型布丘氏菌属菌植酸酶的非常低的胃蛋白 酶稳定性形成对比，野生型布丘氏菌属菌植酸酶基本上完全被1 fig/ml胃 蛋白酶降解(图4)。
在实施例4-8中，野生型和变体布丘氏菌属菌植酸酶直接或作为融合 蛋白在里氏木霉中表达。在所有情况下观察到大于10g/L的非常强的表达 水平。
实施例4-构建并在里氏木霉中作为无Kex2位点的融合蛋白表达野生 型布丘氏菌属菌植酸酶
由GENEART AG(BioPark Josef-Engert-Str. 11， D-93053 Regensburg， Germany)合成了编码野生型布丘氏菌属菌植酸酶可读框的DNA。限制性 位点SpeI和AscI为克隆目的引入其中(参见表4、 SEQIDNO:8)。植 酸酶可读冲匡(SEQ ID NO: 8)插入到栽体pTrex4的Spel和Ascl位点(见图 5)。得到的构建体生物弹射击地转化入来源于里氏木霉的菌林，使用 Bio画Rad的Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Hercules， CA)。 使用的转化方案如Foreman(WO 2005/001036)所描述。在得到稳定的转化 细胞后，这些转化细胞在摇瓶中生长，表达分析布丘氏菌属菌^^酸酶蛋白， 如Foreman(WO2005/001036)所述。WO2005/001036的转化和表达分析方 案整体作为参考引入本发明。在MM乙酰胺板上生长数天后，显示稳定的 形态的转化细胞接种到含有30 ml Proflo培养基的250 ml摇瓶中。Proflo 培养基包含30g/L a-乳糖；6.5 g/L(NH4)2S04; 2g/L KH2P04; 0.3 g/L MgS04'7H20; 0.2g/L CaCL2; lml/L 1000X痕量元素盐溶液；2ml/L 10% 吐温80; 22.5g/L Proflo棉子粉(Traders Protein, Memphis, TN);和0.72g/L CaC03。在28。C和225转/分钟生长两天后，将10% Proflo培养物转入 包含30 ml限定了乳糖的培养基(Lactose Defined Media)的250 ml摇瓶中。 限定了乳糖的培养基的组分如下5g/L(NH4)2S04， 33g/L PIPPS緩沖液; 9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/L KH2P04， 1 g/L MgS047H20; 5ml/L Mazu DF60-P消泡剂(mazur Chemicals, Gurnee， IL); lml/L 1000X痕量元素盐溶
43生型布丘氏菌属菌#_酸酶
通过聚合酶链反应(PCR)扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶的可读框， 使用GENEART合成的DNA作为模板(见表4， SEQ ID NO: 8)。使用的 PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR中使用
液；pH 5.5. 40ml/L的40%(w/v)乳糖溶液灭菌后加入到培养基中。在28。C "5转/分钟摇瓶培养限定了乳糖的培养基2-3天。培养上清液的样品用适 当体积的含有还原剂的4X NuPAGE样品緩冲液(Invitrogen Carlsbad, CA) 混合，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，使用4-12。/。NuPAGE预制凝胶 和MOPS电泳緩冲液(Invitrogen Carlsbad, CA)。用Simply Blue Stain(Invitrogen Carlsbad, CA)染色的凝胶用于蛋白检测。在染色的凝胶上 观察到具有约96 kDa的表观分子质量的蛋白带。该融合蛋白的预期分子质 量约为96 kDa。发现该蛋白表达大于10 g/L。
表4:包含5'端的Spel位点和3'端的Ascl位点的野生型布丘氏菌属 菌植酸酶的DNA序列。
CCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC (SEQ ID NO:8)
实施例5-构建并在里氏木霍中作为具有Kex2位点的融合蛋白表达野
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实施例6-构建并在里氏木霉中以直接构建体表达野生型布丘氏菌属菌 植酸酶
通过聚合酶链反应(PCR)扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶的可读框， 使用GENEART合成的DNA作为模板(见表5， SEQ ID NO:6 )。使用的 PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR中使用 的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。使用的扩增植酸酶的可读框的 引 物 是 引 物 SK680( 正 向 引 物 ) 5-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTC
TCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGAC ACCCCCGCCAGC画3'(SEQ ID NO:ll)， 和 引 物 SK6 5画CCTTACTGGAGCTGGCAG-3'(SEQ ID NO:12)。正向引物在5'端包含 附加的四个核苷酸(序列-CACC)，是克隆入pENTRY/D-TOPO载体(Invitrogen)所必须的。扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶可读框的PCR条 件如下步骤l， 94。Cl分钟，步骤2:94。C30秒，步骤3:58。C30秒，步 骤4: 72°C l分钟，步骤2、 3和4重复额外的24个循环。步骤5: 72°C 5 分钟，步骤6: 4。C保存。PCR产物用Qiaquick Gel Purification Kit(Qiagen) 纯化。PCR纯化产物最初克隆入pENTRY/DTOPO载体(Invitrogen)，并 且转入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。用LR克隆酶 II(Iiwitrogen)按照使用说明书，将具有植酸酶可读框的正确序列的 pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组(见图6)。如实施例4所述将得 到的构建体转化并鉴定蛋白表达。融合蛋白期望的分子质量大约为46 kDa。蛋白表达大于10g/L。
实施例7-构建并在里氏木霉中以具有Kex2位点的融合蛋白表达 BP-17变体布丘氏菌属菌植酸酶
由GENE ART AG(BioPark Josef-Engert-Str. 11， D-93053 Regensburg Germany)合成编码BP-17变体可读框的DNA(见表5， SEQ ID NO:7)。包 括氨基醋列VAVEKR(SEQ ID NO: IO)是为了 Kex2蛋白酶切割融合蛋 白，也具有为了克隆目的的限制性位点Spel和Ascl。植酸酶可读框(SEQ ID NO:7)在Spel和AscI位点插入pTrex4载体(见图5)。如实施例4所述转 化所得的构建体并表达。融合蛋白期望的分子质量大约为96kDa。蛋白表 达大于10 g/L。属菌植酸酶
通过聚合酶链反应(PCR)扩增BP-17变体布丘氏菌属菌植酸酶的可读 框，使用由GENEART合成的DNA作为模板(见表5， SEQ ID NO:7 )。 使用的PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR 中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。使用的扩增植酸酶可读 框的 引 物是引 物 SK680(正向 引 物 )
GCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3'(SE Q ID NO:ll),和引物SK6 5'-CCTTACTGGAGCTGGCAG-3'(SEQ ID NO:12)。正向引物在5，端包含附加的四个核苷酸(序列-CACC),是克隆入
表5:包含5'端的Spel位点和3'端的Ascl位点的布丘氏菌属菌植酸 酶的BP-17变体的DNA序列。
GAGCGTCGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC (SEQ ID NO:7).
实施例8-构建并在里氏木霉中以直接构建体表达BP-17变体布丘氏菌
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GpENTRY/D-TOPO载体(Invitrogen)所必须的。扩增野生型布丘氏菌属菌 植酸酶可读框的PCR条件如下步骤1， 94°C 1分钟，步骤2: 94°C 30秒， 步骤3:58。C30秒，步骤4:72。C1分钟，步骤2、 3和4重复额外的24个 循环，步骤5: 72°C 5分钟，步骤6: 4。C保存。PCR产物用Qiaquick Gel Purification Kit(Qiagen)纯化。PCR纯化产物最初克隆入pENTRY/D TOPO载体(Invitrogen)，并且转化入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞 (Invitrogen)。使用LR克隆酶II(Invitrogen)按照制造商的使用说明书，将 具有植酸酶可读框的正确序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重 组(见图6)。如实施例4所述转化所得的构建体并表达。在染色的凝胶上 观察到具有约46 kDa的表观分子质量的蛋白带。该融合蛋白的预期分子质 量约为46 kDa。发现该蛋白表达大于10 g/L。
权利要求
1.分离的植酸酶变体，所述变体包含对应于SEQ ID NO1的位置A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303的替代，并且包括所述变异替代在内具有与SEQ ID NO1的第34-446位氨基酸残基至少95％的序列同一性。
2. 权利要求1的植酸酶，其中所述变体包含对应于SEQ ID NO: 1的 位置A122, D125， T167, F197, T209， A211, K240, A242, S281, Q289, A294 和N303的替代。
3. 权利要求l的植酸酶，其中替代进一步包含A122T，D125A，T1671， F197S， T209K， A211P， K240E， A242S， S281L， Q289Y， A294E和N303K, 并且包括所述变异替代在内具有与SEQ ID NO: 1的第34 - 446位氨基酸 残基至少95%的序列同一性。
4. 权利要求l的植酸酶，其中所述变体具有SEQIDNO:3的序列。
5. 布丘氏菌属菌(5 故^1 ^// 印.)植酸酶的变体，其中所述变体由对 应于SEQ ID NO: 1的位置A122， D125, T167， F197, T209, A211, K240, A242， S281, Q289, A294和N303的替代组成。
6. 分离的植酸酶变体，所述变体包含对应于SEQ ID NO: 4的位置 R24， R28, T31， K32， D98， R100, K137， N212, G221, T225, E228, H259， F263, M266， N276, H312， D313， T314和/或D334的替代。
7. 权利要求6的植酸酶变体，其中替代对应于SEQIDNO:4的位置D98。
8. 植酸酶的变体，其中所述变体包含与SEQIDNO: 1的氨基酸残基 位置34-446具有98%序列同一性，并且包含在SEQ ID NO: 1的位置 A122, D125, T167， F197, T209， A211， K240， A242， S281， Q289， A294和 N303的替代。
9. DNA,其编码权利要求1的植酸酶。
10. DNA，其编码权利要求6的植酸酶。
11. 表达载体，其包含权利要求9的DNA。
12. 宿主细胞，其是用权利要求ll的表达载体转化的。
13. 根据权利要求1的植酸酶变体，其具有与SEQ ID NO: 2的植酸 酶相比较而言增加的热稳定性。
14. 酶组合物，其包含权利要求1的植酸酶。
15. 酶组合物，其包含权利要求6的植酸酶。
16. 权利要求14的酶组合物，其中所述组合物是动物饲料组合物。
17. 权利要求14的酶组合物，其中所述组合物用于淀粉液化工艺。
18. 权利要求14的酶组合物，其中所述组合物用于醇发酵工艺。
19. 权利要求14的酶组合物，其进一步包含选自以下的酶葡糖淀粉 酶、a-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、和它们的组合。
20. 发酵培养基，其包含产生自丝状真菌细胞培养物的权利要求1的 植酸酶。
21. 权利要求20的发酵培养基，其中丝状真菌细胞是木霉属 (7Wc/^mwfl)细胞。
22. 权利要求21的发酵培养基，其中木霉属细胞是里氏木霉(r. /^^/)。
23. 权利要求20的发酵培养基，其中植酸酶包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。
24. 在宿主细胞中产生植酸酶的方法，包括a)用DNA构建体转化宿主细胞，其中所述DNA构建体包括在宿主酸，所述4直酸酶具有与SEQ ID NO: 3至少75%序列同一性的氨基酸序列， b )在合适的培养基中培养经转化的宿主细胞，以允许表达所述植酸酶，和c)产生植酸酶。
25. 根据权利要求24的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞、细菌细 胞或植物细胞。
26. 根据权利要求25的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。
27. 根据权利要求24的方法，其进一步包括回收所产生的植酸酶。
28. 根据权利要求26的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞， 且该丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。
29. 根据权利要求28的方法，其中木霉属细胞是里氏木霉细胞。
30. 根据权利要求24的方法，其中所述植酸酶具有与SEQIDNO: 3 至少95%的序列同一性。
31. 根据权利要求30的方法，其中所述植酸酶具有SEQIDNO:3的 序列。
全文摘要
本发明涉及具有改变的特性的植酸酶变体。
文档编号C12N15/55GK101636496SQ200880004350
公开日2010年1月27日 申请日期2008年2月6日 优先权日2007年2月7日
发明者A·米亚斯尼科夫, B·勒斯奈尔, K·派兰格尔, M·A·卡文, M·华德, O·肯施, S·金, U·凯特林 申请人:丹尼斯科美国公司